本发明属于医药技术领域，涉及一套体外动态的代谢孵育体系，该体系可用于更全面的拟合药动学或药效学参数，预估药物更趋近于真实的体内药物代谢动力学、药物相互作用和药效学。
背景技术：
众所周知，药物的研发由于成本高，周期长，失败率高等固有的特性，一直都面临着巨大的挑战，其中代谢作为机体最重要的一个处置机制，又对药物的研发起到至关重要的作用，而因代谢活性和种属差异等因素导致药物研发的失败率也居高不下，加上日益增多错综复杂的药品，联合用药的现象越来越普遍，因药物相互作用引起的不良反应屡见不鲜，甚至出现已经上市药物被迫撤市的事件发生。
现有技术公开了，利用体外模型研究化合物的代谢动力学性质具有重要的科学意义和应用价值。它不仅提供了一种快速筛选化合物的方法，还有利于深入研究酶动力学机制；目前传统的体外模型包括：1)重组酶(例如，细胞色素p450酶与葡萄糖醛酸转移酶)；2)亚细胞组分(例如，微粒体，胞浆或s-9fraction)；和3)细胞器(例如，肝细胞和肝切片)，经实践显示，均存在相应的缺点，如，肝切片由于运输缓慢，导致代谢速率不一致，肝切片内部细胞不易接触到培养液中的药物且肝切片表面的细胞生存能力下降而内部细胞却活性良好；原代肝细胞虽可以较好的模拟体内代谢，但离体后迅速失活且难以控制；而重组酶、肝细胞和微粒更容易提供一致的结果，且更容易处理，但可能无法反映体内真实的肝脏代谢；另外，目前常用的体外药效考察模型如肝切片、3d肝细胞、转基因细胞等也仅仅是对药物原形的简单考察而忽略了代谢过程对药效的影响，因此导致了药物研发过程中体外实验与体内实验结果的差异性，造成大量新药研发资源和时间的浪费。
而且，上述的体外系统均是静态的系统，未考虑到发生在肝脏的运输和循环过程，然而机体内则是不断循环的动态过程，药物吸收进入体内后，通过血液循环进入肝脏或在其它具有代谢功能的器官中发生代谢反应；同样也是通过血液循环，药物被运输至靶器官或靶细胞从而发挥其相应的药理作用；体内这些复杂的循环运输过程等影响着药物的动力学特征，而传统的静态模型的评价无法实现对体内过程的高度拟真。
因此，建立一种可靠、准确的体外动态代谢孵育体系对药物在机体内的药动学/药效学(pharmacokinetics/pharmacodynamics，pk/pd)和药物相互作用(drug-druginteractions，ddis)进行有效的预估，提高新药研发的成药性，指导合理用药，有效规避风险，具有非常重要的理论意义和应用价值。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷，提供一套动态的体外药物代谢孵育系统，该系统全面的从动态的角度出发，考虑了化合物的扩散，分布与转运，与代谢酶的结合与反应，最终对效应细胞影响的全过程，基于物料平衡的原则，构建动态的数学模型，拟合所需的药动或药效参数。为药物在机体内的药动学/药效学和药物相互作用进行更有效，更精准的预估。
本发明所述的动态体外代谢孵育系统，由孵育体系，恒温装置，蠕动泵，效应细胞体系和采样系统构成，并进行串联循环灌注；其中，孵育体系由具有温敏特性3d结构的水凝胶作为载体，包封具有代谢能力的微粒体、重组酶或肝细胞等，加上启动因子等反应物质；采样系统由具有半透膜的微透析系统构成，进行实时游离态的取样。本系统充分考虑了在动态环境下药物的扩散，在体系中的分布与转运，与代谢酶的结合与反应，最终对效应细胞影响的全过程。
更具体的，
本发明中所述的孵育体系，由具有代谢能力的微粒体，重组酶，s9混合物和肝细胞等的亚细胞组分或细胞器，参与代谢反应的底物，抑制剂和反应因子还原型辅酶iinadph或ugdpa等，以及pbs(磷酸缓冲盐)等缓冲液构成；
其中具有代谢能力的微粒体，重组酶，s9混合物和肝细胞等的亚细胞组分或细胞器，用具有温敏特性3d结构的水凝胶作为载体，进行包封；
本发明中所述的恒温装置为，具有振荡功能和恒温功能的水浴锅或者金属浴；
本发明中所述的效应细胞体系为，具有特殊进口和出口的co2培养箱，细胞培养皿和相对应的效应细胞构成；
其中效应细胞为根据不同研究目的而设置的各种细胞；
本发明中所述的采样系统由微透析系统构成，进行水凝胶载体内的实时游离态的取样；
其中所述的微透析系统由具有半透膜的微透探针，灌注器推进泵、灌注器、灌注器支架和套管构成；
本发明的动态体外代谢孵育系统通过下述方法构建：
构建步骤如图1所示，该系统主要由蠕动泵、孵育体系、恒温装置、效应细胞体系和采样系统构成，孵育体系中主要放置微粒体-水凝胶体系，底物，抑制剂和代谢反应所需的启动因子nadph和缓冲液等；效应细胞体系主要为具有特殊进口和出口的co2培养箱，内置培养好的目标细胞；将孵育体系置于恒温装置上，设置适度的温度和转速，最佳为37℃，用聚四氟乙烯管依次联通孵育系统，蠕动泵，效应细胞体系，形成紧密的密闭环路，连通微透析系统，将微透析探针包埋于水凝胶载体内，启动蠕动泵，设置为接近于生理环境的流速，进行循环灌注；
本发明所述的动态体外代谢孵育系统，依据全面分析和测定的不同时间下，底物，抑制剂及其代谢产物在循环液和水凝胶载体中的浓度，以及对效应细胞的影响；充分考虑动态环境下，药物的扩散，在孵育体系中的分布与转运，与代谢酶的结合与反应，最终对效应细胞的影响的全过程，构建相应的动态数学模型，拟合所需的药动或药效参数；结合生理药动模型预估药物趋近于真实的体内药代、药物相互作用和药效。
本发明中，动态体外代谢孵育系统的处置过程如下述，
如图2所示，底物经过该套动态体外代谢孵育系统循环灌注后，在动态环境下，依次经过了药物的扩散，在孵育体系中的分布与转运，与代谢酶的结合与反应，最终对效应细胞的影响的全过程，根据物料守恒定律，建立如下方程：
cu(t)＝cg(t+τ2)-clgcg(t+τ2)τ2/vg
am(0)＝am：0；ag(0)＝0；amtb(0)＝0
其中，a表示量；c表示浓度；v表示体积，单位；
公式中出现的参数的物理意义如下：
am：底物在循环液中的量；
vm：循环液的体积；
cm：底物在循环液中的浓度；
ag：底物在水凝胶中的量；
vg：水凝胶中液体的体积；
cg：底物在水凝胶中的浓度；
amtb：代谢物在循环液和水凝胶中的总量；
q：蠕动泵循环流速；
γ：循环管路出口端底物进入水凝胶的通过率；
τ1：药物从循环管路入口至出口所用时间；
τ2：液体在胶体中流经时间；
cu：从水凝胶中流出的底物浓度；
clg：水凝胶的清除率；
fm：药物从循环液到胶的游离系数；
d分散系数。
本发明提供了一套动态的体外药物代谢孵育系统，该系统全面的从动态的角度出发，全面的分析药物的代谢和药效行为，考虑了化合物的扩散，分布与转运，与代谢酶的结合与反应，最终对效应细胞影响的全过程，基于物料平衡的原则，构建动态的数学模型，拟合所需的药动或药效参数；为药物在机体内的药动学/药效学和药物相互作用进行更有效，更精准的预估。本发明适用于估算药物在机体内的药动学参数，清除率cl和抑制速率常数ki，kinact，ki等，真实地反映药物的药代动力学(pk)、药物相互作用(ddi)和药效学(pd)。
附图说明
图1为本发明所述的动态体外代谢孵育系统的构建示意图；
图2是本发明所述的动态体外代谢孵育系统的处置示意图；
图3是根据本发明所述的动态体外代谢孵育系统预测的大鼠体内药动行为；
图4是根据本发明所述的动态体外代谢孵育系统模拟的药效行为；
图5是根据本发明所述的动态体外代谢孵育系统预测的人体体内药动行为；
图6是根据本发明所述的动态体外代谢孵育系统预测的人体ddi行为；。
具体实施方式
以下通过具体实施例来阐明本发明，揭示本发明的优点和特点，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。基于本发明的核心原理，也可用于其他不同应用，各项细节和数学模型也可根据具体的研究进行适当调整和变更。
实施例1大鼠体内药动学行为的预测；
选用cyp2c9的特异性探针底物甲苯磺丁脲为模型药物，设置流速为q＝6.88ml/min。孵育体系总体积为3.6ml，内置10个包裹大鼠肝微粒体的水凝胶，其终浓度为0.5mg/ml，甲苯磺丁脲设有高、中、低三个浓度，分别为200μm、150μm、100μm(n＝4)，其余用缓冲液pbs补齐；连接并启动整个装置，将系统于37℃预热5min，加入终浓度为1mm的启动因子nadph，分别于0，2，4，6，8，10，20，30，40，50，60min获取循环液和水凝胶中的样品，经hplc分析，根据构建的动态的数学模型，结合生理模型预测了甲苯磺丁脲在大鼠体内的药动学行为，如图3所示，根据结果可以发现，该套动态代谢孵育系统可以拟合出更趋近于体内真实的药动参数，预估的体内药动行为与真实的大鼠药动行为比较吻合，可用于相关的动物药代的评估研究中。
实施例2大鼠体内药效行为的动态模拟
采用经典前药环磷酰胺在该动态系统中进行循环灌流，设置流速为q＝6.88ml/min。孵育体系总体积为5ml，内置5个包裹大鼠肝微粒体的水凝胶，其终浓度为0.5mg/ml，环磷酰胺设有高、中、低三个浓度，分别为20mm、10mm、5mm(n＝4)，选用mcf-7细胞株为药效评价细胞，真空泵吸走6孔板中的培养基，加入nadph终浓度为1mm的ctx溶液(培养基配制)，5ml/孔，连接并启动整个装置，将系统于37℃预热5min，分别于0，5，10，20，30，45，60，180，360，720，1440min获取循环液和水凝胶中的样品，经hplc分析，同时mtt法测定6孔板中的细胞存活率。根据构建的动态的数学模型，结合生理模型预测了甲苯磺丁脲在大鼠体内的药动行为。在效应模型中选择了经典emax模型来模拟浓度与效应之间的关系。如图4所示，根据结果可以发现，在该套动态代谢孵育系统中环磷酰胺经过代谢后，可显著增加它的药理活性，说明该系统可用于相关的药代/药效的评估研究中。
实施例3人体内药动学行为的预测；
选用cyp2c9的特异性探针底物甲苯磺丁脲为模型药物，设置流速为q＝10ml/min。孵育体系总体积为3ml，内置1个包裹人肝微粒体的水凝胶，其终浓度为0.5mg/ml，甲苯磺丁脲设有高、中、低三个浓度，分别为200μm、100μm、50μm(n＝3)，其余用缓冲液pbs补齐，将微透析探针包埋入水凝胶中，连接并启动整个装置，将系统于37℃预热5min，加入终浓度为1mm的启动因子nadph，分别于0，20，40，60，80，100，120，180，240min获取循环液和水凝胶中的样品，经lc-ms/ms分析，根据构建好的动态的数学模型，结合生理模型预测了甲苯磺丁脲在人体内的药动行为。如图5所示，根据结果可以发现，该套动态代谢孵育系统可以拟合出更趋近于体内真实的药动学参数，预估的体内药动行为与真实的人体药动行为比较吻合，可用于相关的药代动力学评估研究中。
实施例4人体内药物相互作用(ddi)行为的预测；
选用cyp2c9的特异性探针底物甲苯磺丁脲和其特异性抑制剂磺胺苯吡唑作为模型药物，在动态循环系统中，分别加入终浓度为50，100和200μm的甲苯磺丁脲，终浓度为0.05，0.1和1μm的磺胺苯吡唑和终浓度为0.5mg/ml的微粒体水凝胶，用pbs补足孵育体系总体积到3ml；连接微透析系统，将微透析探针包埋于微粒体水凝胶中，以1μl/min的流速灌流ringer’s灌流液，将孵育体系置于37℃的恒温金属浴中，打开蠕动泵，以10ml/min的流速循环灌注，预孵5min后，加入1mm的nadph启动反应，孵育4h。分别于0，20，40，60，80，100，120，180，和240min时收集水凝胶中的样品和循环液中的样品。循环液中样品加入2倍量的含内标的冰甲醇，涡旋混合2min终止反应，然后以138000×g的转速离心10min，获取上清液，经lc-ms/ms检测分析。透析液中的样品直接经lc-ms/ms检测分析。根据构建的动态数学模型，结合生理药动学模型，预测了连续给予2000mg的磺胺苯吡唑(每12小时1次，每次500mg)后，口服500mg甲苯磺丁脲的人体药动学行为，如图6所示，结果表明，该套动态模型可以拟合出更加趋近于人体内的ddi行为，可用于药物ddi的评估研究中。