一种过滤离心管式淋巴细胞培养管以及培养方法与流程

本发明属于一种细胞培养容器领域，尤其涉及一种过滤离心管式淋巴细胞培养管以及培养方法。

背景技术：

1960年nowell和morhead验证，使红细胞凝集从而能分离出白细胞的植物凝集素(phytohaemagglutinin，pha)是人和其他动物淋巴细胞的有丝分裂的刺激剂。在pha的作用下，原来处于g1期的淋巴细胞转换为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。这样经过短期培养，以秋水仙素或其衍生物秋水仙胺进行处理，经过低渗和固定，就可获得大量的处于有丝分裂时期的细胞，因为秋水仙素(或秋水酰胺)可通过干扰微管组装而抑制纺锤丝形成，无法使细胞分裂顺利进入后期而停滞于中期，从而可在短期内积累大量最适于进行染色体分析的中期分裂相。此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈现明显形态而利于辨认。淋巴细胞经过培养以后，形成了体外活跃生长的细胞群体，经过空气干燥法制片。所谓空气干燥法，实际上是将细胞经过秋水仙素—低渗处理—充分的固定—滴片等步骤之后在载玻片上得到染色体制片的技术。随着医疗检测技术的不断发展，越来越多的疾病需要通过分析染色体进行诊断，染色体核型分析已经成为一种非常常用的遗传诊断手段。

目前常见的外周血或悬浮细胞培养，需要将外周血或悬浮细胞接种到无菌、密闭的培养瓶内置于培养箱一段时间，然后转移到离心管进行操作。当样本数量较多时，我们需要进行大量繁琐的操作，离心管等实验耗材使用量较大，多次离心转移不仅提高了实验成本，而且大幅增加细胞损伤的概率。现有的离心式培养管不附带过滤装置。

在申请号为：cn201620423268.0，申请日为:20160510，名称为：一种带固定栓的无菌密闭培养管的专利中，公开了一种带固定栓的无菌密闭培养管，主要包括管体、胶塞和管盖，所述胶塞密封于管体的管口，所述管盖包括环形的盖顶和从环形外边缘下垂的盖圈，所述盖顶覆盖于胶塞的顶部，所述盖圈与管口外沿盖合连接，所述盖圈的外侧面横向或竖向设有至少一条固定栓。此种培养管不附带过滤装置。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足和实际需要，提供一种适用于人外周血淋巴细胞培养的产品，可以简化外周血的培养及制片过程，保证实验的高效率，节约实验成本。

本发明的的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种过滤离心管式淋巴细胞培养管，包括离心管1，滤器2，管盖3，所述离心管1上部分为圆柱形管；

所述滤器2为可拆卸圆柱形管，所述滤器2的底部21为圆柱形管，所述滤器2的底部21直径小于滤器2管身直径，所述底部21通过斜面与滤器2管身相连，所述滤器2的外径小于离心管1的内径；

所述滤器2的底部21为网状底面，所述底部21上方依次设置滤膜22、压环23，所述压环23设置在滤膜22上，所述压环23为环状压环，所述滤器2管口处设置外挂边24，所述外挂边24沿着管口边缘处向管外延伸，所述外挂边24的外径不大于离心管1的外径；

所述管盖3中心处设有圆孔，所述管盖3内部设有胶塞31，所述胶塞31直径与管盖3内径相同。

优选的，所述管盖3内侧设有螺纹，所述离心管1管口设有螺纹，所述管盖3的螺纹与离心管1的螺纹相匹配。

优选的，所述外挂边24的外径与离心管1的外径相同。

优选的，所述离心管1为塑料透明管。

优选的，所述离心管1的下部分为圆锥形结构。

优选的，所述离心管1的管外壁设有刻度。

优选的，所述离心管1的体积为50毫升，所述滤器2的体积为20毫升。

一种淋巴细胞培养方法，所述培养方法使用包括权利要求1至7中任意一项所述培养管，其培养步骤如下：

s1：使用消毒棉片消毒后，使用肝素抗凝管和采血针采集外周静脉血，颠倒混匀；

s2:如权利要求1至8中所述的任意一项所述培养管的离心管1盛放培养基，并于室温下加盖放置；

s3:用一次性无菌注射器吸取外周血，将针头插入离心管1的胶塞，将外周血打入培养基，拔出针头，丢弃针头，轻轻混匀；

s4:将培养管放置于培养基架上置于37℃恒温培养箱培养72小时，每天摇动培养管一次使细胞分散，在终止培养2小时前，用注射器抽取20毫克/毫升秋水仙素打入培养管，继续培养至结束。

s5:将低渗液放于37℃水浴锅水浴，将离心管1取出，拧开管盖3，将培养物倒入滤器2，然后将滤器2放入离心管1内重新拧上管盖3，在离心机上1500rpm离心1min，倒掉滤过的培养基，将低渗液倒入滤器2，轻轻晃动悬起细胞，用滴管轻轻吹打悬起细胞，得到的悬液倒入离心管1，盖上管盖3，离心管1在37℃水浴25min；

s6：取甲醇与冰醋酸按体积比3:1混合配制成固定液，离心管1水浴结束后，开盖向悬液中加入1毫升配置好的固定液，轻轻混匀，将悬液倒入滤器2，放入培养管中，静置5min，然后1500rpm离心1min，弃去滤过液，向滤器2中加入固定液，用滴管轻轻吹打后静置20min，然后1500rpm离心1min，弃去滤过液，向滤器2中加入固定液，用滴管轻轻吹打后静置20min，1500rpm离心1min，弃去滤过液，用注射器吸取固定液打入过滤器，吹起细胞，然后用注射器吸取细胞悬液；

s7:预先冰好的冰盒，将载玻片放置于冰盒上，冷却后用注射器在玻片上方滴细胞悬液5-10滴，铺满玻片，将玻片在酒精灯火焰上烤干，制备完成的玻片可直接用吉姆萨染液染色或进行g显带分析，最终制得的染色体玻片经g显带处理后在显微镜下观察。

本发明的有益效果：

此培养管结构简单，设计巧妙，集培养、离心、过滤细胞功能于一体，使用创新的带滤器的离心式培养管，为人外周血染色体核型分析提供了便利，大大简化了操作步骤，缩短实验时间，同时能够获得稳定的实验结果。

附图说明

图1为一种过滤离心管式淋巴细胞培养管的结构示意图。

图中：1-离心管；2-滤器；21-底部；3-管盖；31-胶塞。

图2为滤器的结构示意图。

图中：2-滤器；21-底部；22-滤膜；23-压环；24-外挂边。

图3为滤器底部的结构放大示意图。

图中：21-底部；22-滤膜；23-压环。

图4为实施例二所述离心管放置培养基的结构图。

图中：1-离心管；3-管盖；31-胶塞；4-培养基。

图5为实施例二所述培养的淋巴细胞在低倍镜下观察的示意图。

图6为实施例二所述培养的淋巴细胞在油镜下观察的染色体。

具体实施方式

结合附图所示，本发明的技术方案作进一步的描述：

实施例一：

如附图1-3所示：本发明针对人外周血淋巴细胞培养和染色体制片的特点，开发了一款ph稳定的淋巴细胞培养基，可用于外周血淋巴细胞培养基的体外培养，适用于密闭培养，可在隔水式恒温培养箱或是水浴锅中培养。离心式培养管可简化后期制片流程，方便操作。

一种过滤离心管式淋巴细胞培养管，包括离心管1，滤器2，管盖3，所述离心管1上部分为圆柱形管，下部分为圆锥形，所述管盖3内侧设有螺纹，所述离心管1管口设有螺纹，所述管盖3的螺纹与离心管1的螺纹相匹配。

所述滤器2为可拆卸圆柱形管，所述滤器2的底部21为圆柱形管，所述滤器2的底部21直径小于滤器2管身直径，所述底部21通过斜面与滤器2管身相连，所述滤器2的外径小于离心管1的内径。

所述滤器2的底部21为网状底面，所述底部21上方依次设置滤膜22、压环23，所述压环23设置在滤膜22上，所述压环23为环状压环，所述滤器2管口处设置外挂边24，所述外挂边24沿着管口边缘处向管外延伸，所述外挂边24的外径不大于离心管1的外径。

所述管盖3中心处设有圆孔，所述管盖3内部设有胶塞31，所述胶塞31直径与管盖3内径相同。

本实施例中，其中离心管的容积为50毫升，滤器2的体积为20毫升，其中离心管1的外径为29毫米，内径为27毫米。其中，滤器2的外径25毫米，内径为23毫米，外挂边24的外径与离心管1的外径相同，为29毫米。滤器2的底部21直径10毫米，深度5毫米。离心管1的管外壁以5毫升为单位设有刻度。

本实施例中，离心管1和管盖3之间可通过螺纹旋紧。管盖3中央有圆孔，内侧贴有胶塞，起到密封作用的同时也便于用注射器向管内注入外周血或者细胞悬液。滤器2与离心管1可分离，其底部中央为一圆形网状镂空结构，起支撑滤膜22的作用，另有环状压环23固定滤膜22。当细胞培养完毕需要进行离心操作时，先将细胞悬液倒入滤器2，再套入管中，拧上旋盖进行离心。

实施例二：

如附图1-6所示：

一种淋巴细胞培养方法，所述培养方法使用包括上述培养管。

使用消毒棉片消毒后，使用肝素抗凝管和采血针采集外周静脉血2毫升，颠倒混匀。取本发明中一管外周血淋巴细胞培养基(如附图4所示)放置于室温下化冻，在超净工作台中，用2毫升一次性无菌注射器吸取约0.3毫升外周血，将针头插入离心管1的胶塞，将外周血打入培养基，拔出针头(丢弃)，轻轻混匀。将培养管放置于培养基架上置于37℃恒温培养箱培养72h，每天摇动培养管一次使细胞分散，在终止培养2h前，用2毫升注射器(不丢弃在后续操作继续使用)抽取0.1毫升20毫克/毫升秋水仙素打入培养管，继续培养至结束。

将低渗液放于37℃水浴锅水浴，将离心管1取出，拧开管盖3，将培养物倒入滤器2然后将滤器2放入离心管1内重新拧上盖子，在离心机上1500rpm离心1min，倒掉滤过的培养基，将8毫升低渗液倒入过滤器，轻轻晃动悬起细胞(用滴管轻轻吹打)，将悬液倒入离心管1，盖上管盖3，放置在37℃水浴25min，取甲醇与冰醋酸按体积比3:1混合配制成固定液，水浴结束后，向悬液中加入1毫升配置好的固定液，轻轻混匀，将悬液倒入滤器2，放入离心管1中，静置5min，然后1500rpm离心1min，弃去滤过液，向滤器2中加入9毫升固定液，用滴管轻轻吹打后静置20min，然后1500rpm离心1min，弃去滤过液。再向滤器2中加入9毫升固定液，用滴管轻轻吹打后静置20min，1500rpm离心1min，弃去滤过液。用2毫升注射器吸取0.5毫升固定液打入过滤器，吹起细胞，然后用注射器吸取细胞悬液。

取预先冰好的冰盒，将载玻片放置于冰盒上，冷却后用注射器在玻片上方20cm处滴细胞悬液约5-10滴，铺满玻片，然后将玻片在酒精灯火焰上烤干，制备完成的玻片可直接用吉姆萨染液染色或进行g显带等分析。最终制得的染色体玻片经g显带处理后在显微镜下观察，结果如附图5和附图6所示。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围，而所附权利要求意在涵盖落入本发明精神和范围中的这些修改或者等同替换。