本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种重组牛肉的鉴别方法。
背景技术：
随着我国的经济快速发展和人民的生活水平断提高，人们的膳食结构变得越来越科学，越来越注重营养。牛肉因富含蛋白质，氨基酸组成结构比其他肉类更接近人体，且味道鲜美，深受消费者的喜爱，牛肉及其制品在人们的日常饮食中也占有越来越大的比重，牛肉市场出现供不应求的状况，随之而来的是牛肉制品的质量与安全问题。牛排，作为高档牛肉制品的一种，长期以来，受到消费者的喜爱，由于产品的供不应求和巨大的经济利益的驱使，近年来，市场上出现了“重组牛排”和“胶水牛排”冒充原切牛排的情况。
“原切牛排”指未经任何预处理、直接切割包装的整块牛外脊、牛里脊。原切牛排属于冷鲜或冷冻的分割肉，价格较高；通常情况下，原切牛排内部细菌总数不高，不必加热到熟透，“五至八分熟”也可食用。“重组牛排”也称“拼接牛排”，是借助肉的重组技术加工而成的调理肉制品。这类调理肉制品一般会添加水、酱油、调味料等辅料或使用卡拉胶、谷氨酰胺转氨酶、六偏磷酸钠等食品添加剂。重组牛排价格则相对较低。需在冷藏或冷冻条件下贮藏、运输及销售，食用前需经二次加工的非即食类肉制品。重组牛排由于经预先腌制，或由碎肉及小块肉重组而成，内部易滋生细菌，可能导致产品细菌总数偏高，在食用前应烹饪至全熟。重组牛排如果未按规定进行标示，或者掺入非食用级别的成分，则是违法的，属于商业欺诈行为，也是监管部门需要重点打击的对象。用“重组牛排”冒充“原切牛排”会造成食品安全隐患。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种重组牛肉的鉴别方法。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种重组牛肉的鉴别方法，对同一份牛肉产品进行多点取样以取得多个样品，然后对取得的多个样品依次进行性别判断、个体鉴定；所述性别判断即采用y染色体性别鉴定法，如果多个样品在进行性别判断时，属于不同性别，则直接判定牛肉产品为重组牛肉，属于相同性别，则进行下一步的个体鉴定，如多个样品经检测为来源于同一个个体，则判定牛肉产品为原切牛肉；如多个样品经检测为来源于2个或2个以上不同个体，则判定牛肉产品为重组牛肉。
优选的技术方案为：所述y染色体性别鉴定法包括采用磁珠法分别提取多个样品的dna，然后进行pcr扩增；所述pcr扩增所采用的引物为：
牛性别131-f：5′-tgatagttgatcccacagaagg-3′；
牛性别131-r：5′-tgaacttacaagcagctgagg-3′；
牛性别250-f：5′-tgaggcatggaactccgcttg-3′；
牛性别250-r：5′-ggtggttccacattccgtagg-3′。
优选的技术方案为：所述pcr扩增反应的条件为：采用10μl反应体系，dna模板1μl，上下游引物溶液各0.5μl，pcr预混夜5μl，水3μl；94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火25min，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min，4℃保存至结束，然后对扩增产物进行分析，如果扩增出131bp条带，则证明为牛肉，如果既扩增出131bp和250bp条带，则证明为公牛牛肉。
优选的技术方案为：所述个体鉴定包括采用磁珠法分别提取多个样品的dna，然后进行pcr扩增；所述pcr扩增所采用的引物为：
cssm66-f：5′-acacaaatcctttctgccagctga-3′；
cssm66-r：5′-aatttaatgcactgaggagcttgg-3′。
优选的技术方案为：所述pcr扩增反应的条件为：引物反应体系10μl，dna模板1μl，上下游引物溶液各0.5μl，pcr预混夜5μl，水3μl；94℃预变性5min，94℃变性40ｓ，58℃退火40s，72℃延伸40s，共35个循环；72℃延伸1min，4℃保存至结束，然后对扩增产物进行分析，如果出现多个条带，则该样品来源于2个或2个以上不同个体，判定牛肉产品为重组牛肉。
附图说明
图1是牛性别131引物1-6号样品电泳图和牛性别250引物1号样品引物。
图2是牛性别250引物2号、3号、5号、6号样品电泳图。
图3是牛性别131引物7-11号样品电泳图和牛性别250引物4号样品电泳图。
图4是牛性别250引物7-11号样品电泳图。
图5是引物cssm661-6号样品微卫星法检测电泳图。
图6是引物cssm667-11号样品微卫星法检测电泳图
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
本发明采用y染色体性别鉴定法对牛排样品进行初步鉴定，结合采用微卫星法进行个体鉴定，以达到快速、准确鉴别重组牛排和原切牛排的目的。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
参见图1~6所示，须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
实施例：一种重组牛肉的鉴别方法
采样：菜场随机购买商品牛排10种；整块牛肉1块。
pcrmix预混夜购自上海前尘生物科技有限公司；引物购自南京金斯瑞公司；组织基因组dna提取试剂盒（磁珠法）购自北京百泰克生物科技有限公司。
pcr梯度扩增仪购自美国appliedbiosystems；全自动dna/rna分析系统购自瑞士qiagen；恒温混匀仪购自德国eppendorf；核酸磁珠提取仪购自美国invitrogen。
第一步：性别判断
收集11份牛排样品，每份牛排分成五份（即对同一份牛肉产品进行多点取样以取得多个样品）分别提取dna，牛排dna采用磁珠法提取：取0.1mg牛排于2mlep管中，加1ml的dna裂解液和10μl的蛋白质酶k，65℃孵育1h，12000rpm离心10min，取上层清夜，按照磁珠提取试剂盒说明加入各试剂于5联排管中后送入磁珠提取仪中，提取好的dna样品。-20℃保存备用。
采用10μl反应体系：dna模板1μl，上下游引物溶液各0.5μl，pcr预混夜5μl，水3μl。
扩增程序94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火25min，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min，4℃保存至结束。使用dna分析系统对扩增产物进行分析。
牛性别131-f：5′-tgatagttgatcccacagaagg-3′；
牛性别131-r：5′-tgaacttacaagcagctgagg-3′；
牛性别250-f：5′-tgaggcatggaactccgcttg-3′；
牛性别250-r：5′-ggtggttccacattccgtagg-3′。
分别设计了2对引物来区分公牛和母牛，选择常染色体基因设计了牛性别131-f和牛性别131-r，故公牛和母牛就能检出131bp。选择y染色体设计牛性别250-f和牛性别250-r引物，故仅有公牛才能扩出250bp。
11组牛肉样品pcr扩增后电泳结果见图1~4，电泳结果表明：11组样品均扩出131bp和250bp条带，所检11组样品均是公牛。因此，均需要进行下一步的个体鉴别。
每份牛排分成五份分别提取dna，牛排dna采用磁珠法提取：取0.1mg牛排于2mlep管中，加1ml的dna裂解液和10μl的蛋白质酶k，65℃孵育1h，12000rpm离心10min，取上层清夜，按照磁珠提取试剂盒说明加入各试剂于5联排管中后送入磁珠提取仪中，提取好的dna样品。-20℃保存备用。
引物反应体系10μl，dna模板1μl，上下游引物溶液各0.5μl，pcr预混夜5μl，水3μl。
扩增程序94℃预变性5min；94℃变性40ｓ，58℃退火40s，72℃延伸40s，共35个循环；72℃延伸1min，4℃保存至结束。使用dna分析系统对扩增产物进行分析。
cssm66-f：5′-acacaaatcctttctgccagctga-3′；
cssm66-r：5′-aatttaatgcactgaggagcttgg-3′。
11组牛肉样品pcr扩增后电泳结果见图5~6，电泳结果表明：11组样品中5组样品检出一块牛排中含有来自2个或2个以上牛个体，分别为3号、5号、8号、10号和11号，说明是重组牛肉，从拼接牛排外观上以及结合牛排包装上（牛排标签注明有卡拉胶）综合判断是一致的。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
序列表
<110>安徽出入境检验检疫局检验检疫技术中心；安徽中医药大学
<120>一种重组牛肉的鉴别方法
<160>6
<210>1
<211>22
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
tgatagttgatcccacagaagg
<210>2
<211>390
<212>prt
<213>人工序列
<400>2
tgaacttacaagcagctgagg
<210>3
<211>21
<212>dna
<213>人工序列
<400>3
tgaggcatggaactccgcttg
<210>4
<211>21
<212>dna
<213>人工序列
<400>4
ggtggttccacattccgtagg
<210>5
<211>24
<212>dna
<213>人工序列
<400>5
acacaaatcctttctgccagctga
<210>6
<211>26
<212>dna
<213>人工序列
<223>mrlfy-r+saci
<400>6
aatttaatgcactgaggagcttgg