本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种基于片段长度多态性pcr的中药桃仁的鉴定方法。
背景技术：
中药桃仁为蔷薇科植物桃(prunuspersica(l.)batsch)或山桃(p.davidiana(carr.)franch.)的干燥成熟种子，全国各地普遍栽培，果实成熟后采收，除去果肉和核壳，取出种子晒干；具有活血化瘀，润肠通便，止咳平喘的功效，临床多用于治疗淤血阻滞的各种病症，为常用的活血化瘀类中药。作为活血化瘀药，桃仁及其提取物具有增加局部血流量、降低血液黏度、改善血液流变学等作用。杏等近缘种的核仁在外观上与桃仁相似，传统鉴定方法容易出现错误，尤其是去皮后更加难以区分，常出现混伪现象。但是桃仁与其近缘种在药效上有明显区别，尤其是苦杏仁含有较高的苦杏仁苷，具有一定的毒性，一旦混用不仅会干扰治疗效果，甚至会导致严重的健康问题。对于区别使用桃仁和苦杏仁等近缘种，必须加以重视。为防止伪充桃仁使用给消费者带来不利影响，建立一种稳定可靠、简单快捷、成本低廉的分子鉴定方法，以控制桃仁的药材质量，对桃仁及其制品的用药安全都具有十分重要的意义。
与核dna相比，叶绿体dna有以下特点：①基因序列为单拷贝，在技术上较好操作；②序列和结构上都相对保守，pcr引物通用性良好；③呈现母系遗传，世代传递中极少或不发生重组，且不受基因重叠、缺失及假基因的干扰；④除包含大量的核苷酸和氨基酸序列信息外，其基因组特征也可作为系统发育分析的有效资源，对正确理解物种之间的亲缘关系有着巨大的潜在价值；⑤分子水平上有明显的差异，对其进行分析可为生物多样性研究提供可靠和准确的信息，为比较进化研究提供大量的基本信息支持。当前，中药材dna分析鉴定技术主要有dna条形码鉴定技术、基于pcr的分子鉴定技术、dna序列分析技术等。片段长度多态性pcr是用针对特定中药材经设计并筛选出的引物进行pcr扩增，通过分析扩增片段的大小来鉴定药品真伪，具有稳定可靠、简单快捷、成本低廉等优点，与其他分子生物学技术如dna条形码、pcr-rflp(pcr-restrictionfragmentlengthpolymorphisms)、rapd(randomamplifiedpolymorphicdna)相比，片段长度多态性pcr更加便宜、更加快速、更加适合于中药材的常规鉴定。
因此，有必要开发一种基于片段长度多态性pcr的中药桃仁的鉴定方法；研究如何基于片段长度多态性pcr技术建立一种稳定可靠、简单快捷、成本低廉的桃仁真伪鉴定方法，为桃仁及其制品的用药安全提供科学依据和保障，为其他中药材的基原鉴定提供一定的参考依据。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是，提供一种稳定可靠、简单快捷、成本低廉的桃仁真伪鉴定方法基于片段长度多态性pcr的中药桃仁的鉴定方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，该基于片段长度多态性pcr的中药桃仁的鉴定方法，具体包括以下步骤：
(1)前期准备：准备好所需的原材料以及反应试剂，待用；
(2)样品dna提取：提取步骤(1)中原材料的基因组dna，待用；
(3)pcr扩增：将基因组dna、引物1、引物2、水和反应试剂构成pcr反应体系，在梯度pcr仪上，进行预变性、变性、退火、延伸、再延伸四个步骤循环若干次，将目的片段进行pcr扩增；
(4)引物设计与筛选：从genebank数据库中搜集原材料基原植物或/和同属近缘种基原植物的叶绿体peta-psbj序列；进行序列比对后设计片段长度多态性pcr引物；将设计好的引物经过步骤(3)pcr扩增后，依据种间特异性、种内通用性原则筛选出鉴定引物；
(5)pcr鉴定：经过筛选得出pcr鉴定引物为tr1和tr2；再将引物tr1和tr2经过pcr扩增进行鉴定；
(6)pcr产物的纯化、克隆与测序：根据gelextractionkit的说明进行pcr产物纯化，然后再根据pmdtm18-tvectorcloningkit的说明与t载体进行过夜连接，连接产物用感受态细胞e.colidh5α进行转化，菌落pcr后提取阳性质粒进行测序；然后在ncbi/blast/blastn中进行序列比对以确定pcr产物的片段长度及检验该方法的准确性，从而鉴定中药桃仁的种类。
采用上述技术方案，基于桃及其近缘种的叶绿体peta-psbj序列，设计并筛选出了一对片段长度多态性pcr引物，根据pcr产物的片段长度来鉴定桃仁真伪，克隆测序法进一步表明桃的片段长度为138bp，杏、巴旦木和李的片段长度均为167bp，验证了该方法的准确可靠性，最后通过实例分析证明了该方法的实用性；通过引物设计与筛选，从genebank数据库中搜集原材料基原植物或/和同属近缘种基原植物的叶绿体peta-psbj序列；进行序列比对后设计片段长度多态性pcr引物；将设计好的引物经过步骤(3)pcr扩增后，依据种间特异性、种内通用性原则筛选出鉴定引物；确定引物为tr1和tr2可将桃仁与苦杏仁鉴别开，且其灵敏度高，稳定性好，可用于桃仁与苦杏仁的分子鉴别；相比于传统鉴别，其可信度较高，可用于桃仁药材分子鉴定的推广与应用，且为桃仁药材的快速现场鉴别提供了依据。此外，常规pcr的反应条件与梯度pcr的反应条件基本相同，不同之处是退火温度为梯度pcr确定的最佳退火温度，采用梯度pcr其实就是将多个的pcr反应放在一起做，不用一次一次的作很多次，温度梯度pcr可以很快的找出最适合的退火温度，或者说可以在最适合的退火温度下扩增出目的条带；相比常规pcr的好处在于，其具有梯度模块，梯度模块能同时进行多个不同退火温度的pcr反应，在梯度模块上，可实现对梯度温度和梯度宽度等参数的调整，自由编程温度，梯度实现不同样品的退火温度并同时进行热循环。仅一次实验就能确定特定体系相应的最优退火温度。从而可在短时间内对pcr实验进行优化，大大提高pcr科研效率。其中引物由天一辉远生物科技(武汉)有限公司合成；dl2000dnamarker和pmdtm18-tvectorcloningkit购于宝生物工程(大连)有限公司；gelextractionkit购于美国omega公司；对pcr产物的纯化、克隆与测序时，根据gelextractionkit的说明进行pcr产物纯化，然后再根据pmdtm18-tvectorcloningkit的说明与t载体进行过夜连接，连接产物用感受态细胞e.colidh5α进行转化，菌落pcr后提取阳性质粒进行测序。测序结果利用bioedit7.0.9.0软件进行处理，然后在ncbi/blast/blastn中进行序列比对以确定pcr产物的片段长度及检验该方法的准确性。。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤(1)和所述步骤(3)中的反应试剂为2×estaqmastermix染料型；所述步骤(1)中的原材料为新鲜桃叶或/和苦杏仁或/和桃仁或/和巴旦木或/和李子核仁。实地采集的桃叶，市售中药桃仁和苦杏仁、巴旦木、李子，所有材料均经本学院植物学教授和中药学教授的专业鉴定。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤(3)中pcr扩增的反应过程具体为：反应体系为15μl，包括：2×estaqmastermix7.5μl，引物1和引物2的浓度为20μmol/l且各0.2μl，基因组dna0.2μl，补足ddh2o至15μl；pcr扩增在梯度pcr仪上进行，反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，45～55℃退火30s，72℃延伸10s，72℃延伸5min，循环30次；反应结束后取5μlpcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统中记录实验结果。其中2×estaqmastermix购于康为世纪生物科技(北京)有限公司；其他试剂均为国产分析纯试剂。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤(5)中将引物tr1和tr2经过pcr扩增进行鉴定的反应过程为：反应体系为15μl，包括：2×estaqmastermix7.5μl，引物tr1和引物tr2的浓度为20μmol/l且各0.2μl，基因组dna0.2μl，补足ddh2o至15μl；pcr扩增在普通pcr仪上进行，反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，48.1℃退火30s，72℃延伸10s，72℃延伸5min，循环30次。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤(2)中基因组dna的提取，其中桃仁、苦杏仁、巴旦木、李子核仁的基因组dna提取的过程均包括以下步骤：
(1)配制sds提取缓冲液：1.25％sds，100mmol/ltris-hcl，ph8.0；500mmol/lnacl，50mmol/ledta，0.1％(v/v)β-巯基乙醇；
(2)取上述原材料一颗，用剪刀剪碎后放在研钵中，加入少量石英砂研磨成粉末状，称取30mg至研钵中，迅速加入700μl经65℃预热的sds提取缓冲液，充分研磨后，转移至1.5ml离心管中，放入65℃水浴锅中保温30min；
(3)加入700μl苯酚/氯仿/异戊醇，其中酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1，缓慢颠倒混匀，静置10min，12000r/min离心10min；
(4)取上清液，重复步骤(3)；
(5)取上清液，加入2.5倍体积的预冷的无水乙醇，轻轻混匀，-20℃静置30min，10000r/min离心10min，弃去上清液，70％乙醇洗涤沉淀，12000r/min离心2min，乙醇自然挥发30min；(6)加入30μlte于65℃水浴溶解约10min备用；
(7)取5μl所提取的基因组dna用一滴loadingbuffer染色，并在1％琼脂糖凝胶中进行电泳检测。影响植物基因组dna提取效果的因素很多，如植物材料的选取、细胞提取液的用量、酚/氯仿/异戊醇的用量及其比例、氯仿/异戊醇用量及其所选用的方法等，要根据不同的植物选用不同的方法，常用的方法有sds法和ctab法，但对不同的植物材料还要根据需要对传统方法进行改造，该试验就是以改进的sds法对杏仁基因组进行了提取。由于桃仁、杏仁含粗脂肪50～60％，蛋白质23～27％，导致其基因组难以分离；且由于桃仁、杏仁所含脂肪太高，很难研磨均匀，将其在65℃预热的sds提取液先加入再研磨，由此增大样品与提取液的接触，从而细胞充分破碎，脂肪分散均匀，有利于dna高效释放。此外，增加苯酚/氯仿/异戊醇抽提次数，可以更好地除去蛋白等杂质，以便得到纯度和浓度较好的基因组dna样品；基因组dna模板的质量直接影响pcr反应的效率，基因组dna降解严重时甚至导致无扩增，而dna的质量则受提取方法的影响，因此提取方法很重要。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤(2)中基因组dna的提取，其中新鲜桃叶的基因组dna提取具体包括以下步骤：
(1)取桃叶100～200mg，蒸馏水冲洗后置于研钵中，加入500μl氯仿研磨；叶片组织研碎之后，加入1500μldna提取液，所述提取液为100mmol/ltris-hcl，ph8.0，1.4mmol/lnacl，2％(w/v)ctab，20mmol/ledta，0.2％(v/v)β-巯基乙醇研磨稍许，将组织提取液移入离心管，10000r/min离心5min；
(2)上清液移入300μl酚仿试剂的离心管中，摇动约30s，12000r/min离心6min；
(3)重复(2)；
(4)将上清液慢慢滴入500μl预冷异丙醇的离心管中，轻轻倒置2～3次，使dna沉淀，12000r/min离心6min；
(5)去上清液，用体积分数70％乙醇100μl冲洗沉淀2～3次，风干后加入30μlte溶解备用；
(6)取5μl所提取的基因组dna用一滴loadingbuffer染色，并在1％琼脂糖凝胶中进行电泳检测。
应用本方法提取核酸大约需30min，纯化dna大约需40min，全过程需1h左右。氯仿是核酸提取中重要的试剂，新方法将其用作研磨液来变性蛋白质。在同一提取液的情况下，使用氯仿和不使用氯仿的试验结果表明，氯仿具有明显变性蛋白质的作用；同时也具有降低核酸含量的负作用；降低核酸提取液中蛋白质含量是有效提取的保证。该提取方法采用先加氯仿研磨，再用提取液抽提dna的方法，这与在液氮中研磨的原理和效果相似，延迟了dna的释放时间，减少了研磨期间dna酶对dna的降解作用，又能提前使细胞质中释放的蛋白质失活变性，比在液氮中研磨更为廉价和方便。此方法能使蛋白质和dna酶随着其从植物组织中释放而逐渐被氯仿失活变性，在加入提取液后dna集中释放，其释放后在液体中存留时间短，使dna片段能保持相对完整。另外，本方法提取核酸时减少了保温、预冷、液体多次转移、长时间离心等程序，缩短了提取时间，使核酸提取过程减少到30min，其中从抽提到乙醇沉淀dna仅20min，减少了dna被dna酶降解的机会，从而大大缩短了提取核酸的时间，减少了dna被降解和提取液转移时机械损伤的各种机会，因此可提高dna的相对产量和质量。
本发明进一步改进在于，该基于片段长度多态性pcr的中药桃仁的鉴定方法还包括确定引物的最佳退火温度，将桃仁鉴定引物tr1和tr2分别对桃基因组dna和杏基因组dna进行了梯度pcr扩增反应，反应结束后各取5μlpcr产物在1％琼脂糖凝胶中进行电泳检测，凝胶成像系统中记录实验结果，从而通过实验结果得出最佳的退火温度。
本发明还提供一种鉴定中药桃仁的引物，该引物是具有种间片段长度多态性，能根据pcr产物的片段鉴定桃仁的真伪，包括引物tr1和引物tr2。
优选的，所述引物tr1的序列为：5’-aggttctatgctattagt-3’；所述引物tr2的序列为：5’-cgttaagggattcaga-3’。
其中，引物tr1，seqidno.1：aggttctatgctattagt；
引物tr2，seqidno.2：cgttaagggattcaga。
优选的，所述引物tr1和所述引物tr2的摩尔比为1:1。
与现有技术相比，具有以下优势：桃仁为常用活血化瘀类中药，由于杏等近缘种的核仁与桃仁外观相似，常出现混伪现象，不仅会干扰治疗效果，甚至会导致严重的健康问题，因此对桃仁进行真伪鉴定具有十分重要的意义，是保障安全用药的前提和基础；通过引物设计与筛选，从genebank数据库中搜集原材料基原植物或/和同属近缘种基原植物的叶绿体peta-psbj序列；进行序列比对后设计片段长度多态性pcr引物；将设计好的引物经过步骤(3)pcr扩增后，依据种间特异性、种内通用性原则筛选出鉴定引物；确定引物为tr1和tr2可将桃仁与苦杏仁鉴别开，且其灵敏度高，稳定性好，可用于桃仁与苦杏仁的分子鉴别；相比于传统鉴别，其可信度较高，可用于桃仁药材分子鉴定的推广与应用，且为桃仁药材的快速现场鉴别提供了依据。
附图说明
图1为引物tr1和tr2在梯度pcr反应中不同退火温度的电泳实验结果，其中(a)为桃基因组dna(dl2000dnamarker,45.0℃,45.9℃,48.1℃,49.4℃,51.9℃,54.1℃)；(b)为杏基因组dna(dl2000dnamarke,45.0℃,45.9℃,48.1℃,49.4℃,51.9℃,54.1℃)；
图2为引物tr1和tr2的种间片段长度多态性的电泳实验结果，其中依次为dl2000dnamarker,p.persica,p.armeniaca,p.dulcis,p.salicina；
图3为采用引物tr1和tr2测试种内通用性的电泳实验结果，其中依次为dl2000dnamarker,桃叶样品1-5；
图4为采用引物tr1和tr2鉴定桃仁样品的实验结果，其中依次为dl2000dnamarker,阳性对照,桃仁样品1-7。
具体实施方式
实施例：该基于片段长度多态性pcr的中药桃仁的鉴定方法，具体包括以下步骤：
(1)前期准备：准备好所需的原材料以及反应试剂，待用；
(2)样品dna提取：提取步骤(1)中原材料的基因组dna，待用；
(3)pcr扩增：将基因组dna、引物1、引物2、水和反应试剂构成pcr反应体系，在梯度pcr仪上，进行预变性、变性、退火、延伸、再延伸四个步骤循环若干次，将目的片段进行pcr扩增；
(4)引物设计与筛选：从genebank数据库中搜集原材料基原植物或/和同属近缘种基原植物的叶绿体peta-psbj序列；进行序列比对后设计片段长度多态性pcr引物；将设计好的引物经过步骤(3)pcr扩增后，依据种间特异性、种内通用性原则筛选出鉴定引物；
(5)pcr鉴定：经过筛选得出pcr鉴定引物为tr1和tr2；再将引物tr1和tr2经过pcr扩增进行鉴定；
(6)pcr产物的纯化、克隆与测序：根据gelextractionkit的说明进行pcr产物纯化，然后再根据pmdtm18-tvectorcloningkit的说明与t载体进行过夜连接，连接产物用感受态细胞e.colidh5α进行转化，菌落pcr后提取阳性质粒进行测序；然后在ncbi/blast/blastn中进行序列比对以确定pcr产物的片段长度及检验该方法的准确性，从而鉴定中药桃仁的种类。
其中所述步骤(1)和所述步骤(3)中的反应试剂为2×estaqmastermix染料型；所述步骤(1)中的原材料为新鲜桃叶或/和苦杏仁或/和桃仁或/和巴旦木或/和李子核仁。其中引物由天一辉远生物科技(武汉)有限公司合成；dl2000dnamarker和pmdtm18-tvectorcloningkit购于宝生物工程(大连)有限公司；gelextractionkit购于美国omega公司。
所述步骤(3)中pcr扩增的反应过程具体为：反应体系为15μl，包括：2×estaqmastermix7.5μl，引物1和引物2的浓度为20μmol/l且各0.2μl，基因组dna0.2μl，补足ddh2o至15μl；pcr扩增在梯度pcr仪上进行，反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，45～55℃退火30s，72℃延伸10s，72℃延伸5min，循环30次；反应结束后取5μlpcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统中记录实验结果。其中2×estaqmastermix购于康为世纪生物科技(北京)有限公司；其他试剂均为国产分析纯试剂。
所述步骤(5)中将引物tr1和tr2经过pcr扩增进行鉴定的反应过程为：反应体系为15μl，包括：2×estaqmastermix7.5μl，引物tr1和引物tr2的浓度为20μmol/l且各0.2μl，基因组dna0.2μl，补足ddh2o至15μl；pcr扩增在普通pcr仪上进行，反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，48.1℃退火30s，72℃延伸10s，72℃延伸5min，循环30次。
所述步骤(2)中基因组dna的提取，其中桃仁、苦杏仁、巴旦木、李子核仁的基因组dna提取的过程均包括以下步骤：
(1)配制sds提取缓冲液：1.25％sds，100mmol/ltris-hcl、ph8.0，500mmol/lnacl，50mmol/ledta，0.1％(v/v)β-巯基乙醇；
(2)取上述原材料一颗，用剪刀剪碎后放在研钵中，加入少量石英砂研磨成粉末状，称取30mg至研钵中，迅速加入700μl经65℃预热的sds提取缓冲液，充分研磨后，转移至1.5ml离心管中，放入65℃水浴锅中保温30min；
(3)加入700μl苯酚/氯仿/异戊醇，其中酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1，缓慢颠倒混匀，静置10min，12000r/min离心10min；
(4)取上清液，重复步骤(3)；
(5)取上清液，加入2.5倍体积的预冷的无水乙醇，轻轻混匀，-20℃静置30min，10000r/min离心10min，弃去上清液，70％乙醇洗涤沉淀，12000r/min离心2min，乙醇自然挥发30min；(6)加入30μlte于65℃水浴溶解约10min备用；
(7)取5μl所提取的基因组dna用一滴loadingbuffer染色，并在1％琼脂糖凝胶中进行电泳检测。
所述步骤(2)中基因组dna的提取，其中新鲜桃叶的基因组dna提取具体包括以下步骤：
(1)取桃叶100～200mg，蒸馏水冲洗后置于研钵中，加入500μl氯仿研磨；叶片组织研碎之后，加入1500μldna提取液，所述提取液为100mmol/ltris-hcl、ph8.0，1.4mmol/lnacl，2％(w/v)ctab，20mmol/ledta，0.2％(v/v)β-巯基乙醇研磨稍许，将组织提取液移入离心管，10000r/min离心5min；
(2)上清液移入300μl酚仿试剂的离心管中，摇动约30s，12000r/min离心6min；
(3)重复(2)；
(4)将上清液慢慢滴入500μl预冷异丙醇的离心管中，轻轻倒置2～3次，使dna沉淀，12000r/min离心6min；
(5)去上清液，用体积分数70％乙醇100μl冲洗沉淀2～3次，风干后加入30μlte溶解备用；
(6)取5μl所提取的基因组dna用一滴loadingbuffer染色，并在1％琼脂糖凝胶中进行电泳检测。
该基于片段长度多态性pcr的中药桃仁的鉴定方法还包括确定引物的最佳退火温度，将桃仁鉴定引物tr1和tr2分别对桃基因组dna和杏基因组dna进行了梯度pcr扩增反应，反应结束后各取5μlpcr产物在1％琼脂糖凝胶中进行电泳检测，凝胶成像系统中记录实验结果，从而通过实验结果得出最佳的退火温度。实验结果如图1所示，从图1中可知，tr1和tr2对桃基因组和杏基因组的最佳退火温度均为48.1℃，最后确定tr1和tr2鉴定桃仁的最佳退火温度为48.1℃。
为了评估桃仁鉴定引物tr1/2的种间片段长度多态性，将tr1和tr2分别对桃及其易混近缘物种杏、巴旦木和李的基因组dna进行了pcr扩增反应，反应结束后各取5μlpcr产物在2％琼脂糖凝胶中进行电泳检测，凝胶成像系统中记录实验结果，实验结果如图2所示，pcr产物具有片段长度多态性，桃的pcr产物小于近缘种杏、巴旦木和李的pcr产物，且长度符合预期大小。
为了进一步评估引物tr1和tr2的种间片段长度多态性，将桃、杏、巴旦木和李的pcr产物进行了克隆测序，序列比对结果显示它们的序列分别与桃(与p.persica的相似性为100％)、杏(与p.armeniaca的相似性为99％)、巴旦木(与p.dulcis的相似性为100％)和李(与p.salicina的相似性为99％)的亲缘关系最近，且序列长度分别为138bp、167bp、167bp和167bp。序列比对结果表明，引物tr1和tr2具有种间片段长度多态性，可根据pcr产物的片段长度来进行桃仁真伪鉴定，同时也证明了基于引物tr1和tr2的片段长度多态性pcr用于桃仁真伪鉴定是准确可靠的。
优良的鉴定引物除了具有种间特异性，还必须同时具有种内通用性，为了评估桃仁鉴定引物tr1和tr2的种内通用性，我们从不同地方实地采集了不同品种的桃叶，依次标记为1-5，将tr1和tr2对这5种桃叶样品的基因组dna进行了pcr扩增，反应结束后各取5μlpcr产物在1％琼脂凝胶中进行电泳检测，凝胶成像系统中记录结果，实验结果如图3所示，从图3中可知，5种桃叶基因组dna扩增出的目的片段符合预期大小，且各目的片段大小无明显差异，因此引物tr1和tr2具有种内通用性，可用于桃仁的真伪鉴定。
最后，为了评估本方法的实用性，我们随机从四家药店购买了七份桃仁样品，然后采用本方法对它们进行了鉴定，鉴定结果见图4。从图4中可知，桃仁样品1、3、5和7为伪品，因为它们的pcr产物大于阳性对照组的pcr产物。这一结果表明，中药材市场上确实存在桃仁混伪现象，本方法在桃仁鉴定中具有一定的实用性，可用于桃仁药材的质量控制。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，例如引物在扩增体系中的浓度，扩增退火温度在45-55℃内选择等，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110>九江学院
<120>基于片段长度多态性pcr的中药桃仁的鉴定方法
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>18
<212>dna
<213>引物tr1(prunuspersica)
<400>1
aggttctatgctattagt18
<210>2
<211>16
<212>dna
<213>引物tr2(prunuspersica)
<400>2
cgttaagggattcaga16