本发明设涉及氨基酸生产领域，具体是一种l-硒-甲基硒代半胱氨酸的酶促合成方法。
背景技术
硒是人体必需的微量元素，它是硒代半胱氨酸的组成元素。硒代半胱氨酸被称为第二十一种氨基酸，在人体内用于二十多种重要蛋白质的合成。硒在自然界含量稀少，而且地域分布不平衡。缺硒会导致多种疾病，比较常见的有克山病，大骨节病，心脏疾病，甲状腺疾病以及免疫功能低下等。
人体缺硒可以通过硒营养强化剂来补充。最新的硒强化剂是l-硒-甲基硒代半胱氨酸。它化学结构明确，容易被人体吸收，无明显蓄积毒性，做添加剂时定量控制性好。而且，它对多种肿瘤(包括乳腺癌，前列腺癌，肝癌)有预防作用，也在癌症治疗过程中有辅助作用。美国食品及药品局和中国卫生部已批准该化学品为新型营养强化剂。
目前，l-硒-甲基硒代半胱氨酸的合成方法主要有以下几种：
(1)金属钠还原裂解法:硒代胱氨酸用金属钠在-70℃还原裂解，再用碘甲烷烷基化得l-硒-甲基硒代半胱氨酸。
(2)叔丁氧酰基保护丝氨酸法:在三烷(芳)基磷或亚磷酸盐存在下，叔丁氧酰基丝氨酸与偶氮二甲酸二酯反应生成β内酯，然后与甲硒醇或其盐反应生成叔丁氧酰基保护的硒甲基硒代半胱氨酸，最后脱保护得l-硒-甲基硒代半胱氨酸。
(3)甲硒醇钠取代氯丙氨酸法:用甲硒醇钠取代氯丙氨酸或氯丙氨酸甲酯中的氯，得l-硒-甲基硒代半胱氨酸。
(4)甲硒基乙醛法:它是先按已有工艺制得二甲基二硒醚和甲硒醇盐，再通过甲硒醇盐与氯代乙醛反应生成甲硒基乙醛，然后利用甲硒基乙醛制备甲硒基甲内酰脲，最后再通过甲硒基甲内酰脲制得l-硒-甲基硒代半胱氨酸。
(5)α氨基丙烯酸衍生物合成法:首先通过甲硒醇或甲硒醇盐水溶液与α氨基丙烯酸衍生物发生加成反应生成β-甲硒基-α-氨基丙酸衍生物，然后将β-甲硒基-α-氨基丙酸衍生物中的酯化合物经碳酸氢钠或氢氧化钠或氢氧化钾水解皂化，盐酸或硫酸酸化得其羧酸化合物，再将其中的n-酰基用盐酸或硫酸加热水解脱去得β-甲硒基-α-氨基丙酸盐酸盐或硫酸盐，最后用氨气或三乙胺中和得l-硒-甲基硒代半胱氨酸。
(6)酶法拆分混旋法：在氢氧化钠水溶液中，将混旋硒-甲基硒代半胱氨酸用乙酸酐乙酰化，盐酸等酸化得混旋n-乙酰-硒-甲基硒代半胱氨酸。然后将混旋n-乙酰-硒-甲基硒代半胱氨酸用猪肾酰化酶i拆分得光学纯l-硒-甲基硒代半胱氨酸和n-乙酰-d-硒-甲基硒代半胱氨酸，最后将n-乙酰-d-硒-甲基硒代半胱氨酸用盐酸加热水解，氨水等中和得光学纯d-硒-甲基硒代半胱氨酸。
(7)二卤丙腈与甲硒醇盐法：将2，3-二卤丙腈与甲硒醇盐反应得2-卤-3-甲硒基丙腈，然后用酸水解得2-卤-3-甲硒基丙酸，再与氨水反应得l-硒-甲基硒代半胱氨酸。
这些人工合成方法都有各自的缺点，比如：步骤复杂，或工艺冗长，或反应条件苛刻，或原料价格高，或涉及剧毒原料等。因此他们大都难以投入大规模实际生产。因此，市场上的l-硒-甲基硒代半胱氨酸仍然非常昂贵，每公斤高达三十万元。
酶是一种生物催化剂，催化生物体内的繁多的化学反应。相对于纯化学反应，酶促化学反应有许多优越性，包括反应条件温和(通常在常温、常压、水溶液中进行)，具有高度的专一性，反应步骤少，副产品少。因此，酶促化学合成更具绿色环保性。目前已有多种方法，将酶固定到一系列固体材料上，在工业过程中使用。固定化酶已在食品、医药、能源以及环境治理方面得到了比较广泛的应用。
在富含l-硒-甲基硒代半胱氨酸的植物中，存在一种酶，叫“硒代半胱氨酸-硒甲基转移酶”(ec2.1.1.280)。这种酶以s-甲基-l-蛋氨酸(或s-腺苷蛋氨酸)为甲基供体，以l-硒代半胱氨酸为甲基受体，催化合成l-硒-甲基硒代半胱氨酸。硒代半胱氨酸-甲基转移酶的mrna已从多种植物中克隆出来，包括美国黄芪，青花菜和山茶花。当把美国黄芪中硒代半胱氨酸-硒甲基转移酶中的丙氨酸-184变异为苏氨酸-184时，酶的活力可以增加4-5倍。
有鉴于此，本发明以硒代半胱氨酸-硒甲基转移酶为生物催化剂，以l-硒代半胱氨酸和s-甲基-l-蛋氨酸(或s-甲基腺苷蛋氨酸)为底物，一步催化合成l-硒-甲基硒代半胱氨酸。
技术实现要素：
针对上述现有技术的不足，本发明提供一种l-硒-甲基硒代半胱氨酸的酶促合成方法，该合成途径绿色环保，条件温和，步骤简单，易于控制，反应高度专一，不产生有害杂质。
本发明提供的技术方案：一种l-硒-甲基硒代半胱氨酸的酶促合成方法，以l-硒代半胱氨酸和s-甲基-l-蛋氨酸为底物，以硒代半胱氨酸-硒甲基转移酶(ec2.1.1.280)为催化剂，在连续或批量过程下进行酶促反应，产物经过分离提纯后，得到l-硒-甲基硒代半胱氨酸。
一种l-硒-甲基硒代半胱氨酸的酶促合成方法，具体步骤如下：
(1)采用现有的常规方法，将硒代半胱氨酸-硒甲基转移酶固定到固体物表面或内部，固体物为微颗粒或者纤维，酶和固体物的重量比为1:1000-1:50。
(2)l-硒代半胱氨酸的制备：在氮气保护环境下，采用强还原剂在水溶液中将l-硒代胱氨酸还原为l-硒代半胱氨酸，所述强还原剂为β-巯基乙醇或硼氢化钠。
(3)将s-甲基-l-蛋氨酸溶解到除氧后的缓冲溶液中，缓冲溶液为醋酸氨或醋酸钠。
(4)酶促合成反应：将上述l-硒代半胱氨酸溶液和s-甲基-l-蛋氨酸溶液混合，然后和固定化的硒代半胱氨酸-硒甲基转移酶在反应罐中接触反应。整个反应过程保持在氮气下，其中反应时溶液的ph值范围是ph6-8，温度范围是15-40℃，反应时间是10分钟至24小时。
(5)收集步骤(4)所得的反应液，高温减压干燥，加入乙醇溶解干物质，静置。l-硒-甲基硒代半胱氨酸仅微溶于乙醇而析出，过滤，得l-硒-甲基硒代半胱氨酸。
进一步的，所述步骤(4)的反应过程为连续过程或者批量过程，采用连续反应过程时，将固定化的硒代半胱氨酸-硒甲基转移酶装成柱状反应器，让含有s-甲基-l-蛋氨酸和l-硒代半胱氨酸的溶液从柱中流过，从反应器的出口收集液体。
进一步的，所述步骤(4)中l-硒代半胱氨酸和s-甲基-l-蛋氨酸的质量浓度各为1g/l-20g/l，两者的质量比为1:1-1:2。
进一步的，所述硒代半胱氨酸-硒甲基转移酶从非转基因的或者转基因的植物、菌类、藻类或微生物中提取获得，或者通过微生物发酵方法获得。
进一步的，所述硒代半胱氨酸-硒甲基转移酶的氨基酸序列为野生型或者经过人工改变得到，所述人工改变包括对野生型的硒代半胱氨酸-硒甲基转移酶的氨基酸序列改变、增加或删除一个或多个氨基酸。
进一步的，所述s-甲基-l-蛋氨酸采用s-腺苷蛋氨酸替换使用。
进一步的，所述硒代半胱氨酸-硒甲基转移酶为游离状态，在批量条件下合成l-硒-甲基硒代半胱氨酸。
本发明以硒代半胱氨酸-硒甲基转移酶(ec2.1.1.280)为生物催化剂，以l-硒代半胱氨酸和s-甲基-l-蛋氨酸为底物，一步合成l-硒-甲基硒代半胱氨酸。所使用的底物(l-硒代半胱氨酸和s-甲基-l-蛋氨酸)容易制备或在市场上相当便宜。其中，l-硒代半胱氨酸可以通过成熟简单的方法获得。具体是首先用3-氯-丙氨酸和二硒化钠合成l-硒代胱氨酸，然后用强还原剂将其还原为l-硒代半胱氨酸。s-甲基-l-蛋氨酸(也称“维生素u”)是一种广泛便宜的化学品。本发明的合成反应在温和条件下进行，绿色环保，反应具有专一性和高效性，步骤简单，易控制，反应中不产生有害杂质，本发明适合工业生产，具有较高的实用推广价值。
附图说明
图1是本发明的酶促反应的路径；
图2是以固定化硒代半胱氨酸-硒甲基转移酶为催化剂在连续过程条件下合成l-硒-甲基硒代半胱氨酸的示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步的说明。
实施例1(连续过程)
步骤1：事先将1.0g硒代半胱氨酸-硒甲基转移酶固定到100g高分子微颗粒表面，并装填到200ml的玻璃柱中。
步骤2：取200ml水，室温下通氮气30min除氧。加入l-硒代胱氨酸(3.34g,10mmol)和β-巯基乙醇(14ml，200mmol)，磁铁搅拌30min直至l-硒代胱氨酸完全溶解并被还原为l-硒代半胱氨酸。过程中，液面保持在氮气下。
步骤3：取0.8l醋酸氨缓冲液(50mm，ph6.0)，加入s-甲基-l-蛋氨酸(3.60g，22mmol)，醋酸镁(0.3g，2.1mmol)，搅拌溶解，然后加入步骤2所得的l-硒代半胱氨酸溶液。
步骤4：将上述溶液(步骤3)保持在37℃下，液面保持在氮气下，用小型液体泵泵入装有固定化酶的玻璃柱中(步骤1)，流速为2ml/min。
步骤5：从玻璃柱下端出口收集液体，高温减压干燥。加入乙醇溶解干物质，静置过夜。l-硒-甲基硒代半胱氨酸仅微溶于乙醇而析出，过滤，得l-硒-甲基硒代半胱氨酸，3.1g。
实施例2(连续过程)
步骤1：事先将0.5g硒代半胱氨酸-硒甲基转移酶固定到100g聚酯纤维表面，并装填到200ml的玻璃柱中。
步骤2：取200ml水，室温下通氮气30min除氧。加入l-硒代胱氨酸(1.67g,5mmol)和硼氢化钠(3.78g，100mmol)，磁铁搅拌30min直至l-硒代胱氨酸完全溶解并被还原为l-硒代半胱氨酸。过程中，液面保持在氮气下。
步骤3：取0.8l醋酸氨缓冲液(20mm，ph7.0)，加入s-甲基-l-蛋氨酸(1.80g，11mmol)，醋酸镁(0.3g，2.1mmol)，搅拌溶解，然后加入步骤2所得的l-硒代半胱氨酸溶液。
步骤4：将上述溶液(步骤3)保持在30℃下，液面保持在氮气下，用小型液体泵泵入装有固定化酶的玻璃柱中(步骤1)，流速为2ml/min。
步骤5：从玻璃柱下端出口收集液体，高温减压干燥。加入乙醇溶解干物质，静置过夜。l-硒-甲基硒代半胱氨酸仅微溶于乙醇而析出，过滤，得l-硒-甲基硒代半胱氨酸，1.5g。
实施例3(批量过程)
步骤1：事先将0.25g硒代半胱氨酸-硒甲基转移酶固定到50g高分子微颗粒表面，备用。
步骤2：取200ml水，室温下通氮气30min除氧。加入l-硒代胱氨酸(1.67g,5mmol)和β-巯基乙醇(7.0ml，100mmol)，磁铁搅拌30min直至l-硒代胱氨酸完全溶解并被还原为l-硒代半胱氨酸。过程中，液面保持在氮气下。
步骤3：取0.8l醋酸氨缓冲溶液(25mm，ph6.0)，加入s-甲基-l-蛋氨酸(1.80g，11mmol)，醋酸镁(0.3g，2.1mmol)，磁铁搅拌溶解。
步骤4：将固定化酶(步骤1)、l-硒代半胱氨酸溶液(步骤2)和s-甲基-l-蛋氨酸缓冲溶液(步骤3)混合。液面保持在氮气下，在37℃下，用磁铁缓慢搅动。16小时后，过滤。保留固定化酶以便重新使用。
步骤5：过滤液高温减压干燥。加入乙醇溶解干物质，静置过夜。l-硒-甲基硒代半胱氨酸仅微溶于乙醇而析出，过滤，得l-硒-甲基硒代半胱氨酸，1.4g。
实施例4(批量过程)
步骤1：事先将0.5g硒代半胱氨酸-硒甲基转移酶固定到50g高分子微颗粒表面，备用。
步骤2：取200ml水，室温下通氮气30min除氧。加入l-硒代胱氨酸(3.34g,10mmol)和硼氢化钠(3.78g，100mmol)，磁铁搅拌30min直至l-硒代胱氨酸完全溶解并被还原为l-硒代半胱氨酸。过程中，液面保持在氮气下。
步骤3：取0.8l醋酸钠缓冲溶液(25mm，ph7.0)，加入s-甲基-l-蛋氨酸(3.60g，22mmol)，醋酸镁(0.3g，2.1mmol)，磁铁搅拌溶解，然后在室温下通氮气30min除氧。
步骤4：将固定化酶(步骤1)、l-硒代半胱氨酸溶液(步骤2)和s-甲基-l-蛋氨酸缓冲溶液(步骤3)混合。溶液保持在氮气下，在30℃下，用磁铁缓慢搅动。20小时后，过滤。保留固定化酶以便重新使用。
步骤5：过滤液高温减压干燥。加入乙醇溶解干物质，静置过夜。l-硒-甲基硒代半胱氨酸仅微溶于乙醇而析出，过滤，得l-硒-甲基硒代半胱氨酸，2.6g。
实施例5(游离酶，批量过程)
步骤1：事先准备0.25g硒代半胱氨酸-硒甲基转移酶。
步骤2：取200ml水，室温下通氮气30min除氧。加入l-硒代胱氨酸(1.67g,5mmol)和β-巯基乙醇(7.0ml，100mmol)，磁铁搅拌30min直至l-硒代胱氨酸完全溶解并被还原为l-硒代半胱氨酸。整个过程中，液面保持在氮气下。
步骤3：取0.8l醋酸钠缓冲溶液(50mm，ph6.0)，加入s-甲基-l-蛋氨酸(1.80g，11mmol)，醋酸镁(0.3g，2.1mmol)，磁铁搅拌溶解，然后在室温下通氮气30min除氧。
步骤4：将酶(步骤1)、l-硒代半胱氨酸溶液(步骤2)和s-甲基-l-蛋氨酸缓冲溶液(步骤3)混合。液面保持在氮气下，在37℃下，用磁力搅拌器缓慢搅动。
步骤5：20小时后，加入三氯乙酸至10％(v/v)终浓度以沉淀酶蛋白，过滤除去酶蛋白。
步骤6：过滤液高温减压干燥。加入乙醇溶解干物质，静置过夜。l-硒-甲基硒代半胱氨酸仅微溶于乙醇而析出，过滤，得l-硒-甲基硒代半胱氨酸，1.2g。
以上所述仅为本发明的具体实施方案的详细描述，并不以此限制本发明，凡在本发明的设计思路上所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。