本发明涉及农业微生物领域中一株耐酸的三叶草根瘤菌及其应用。
背景技术
三叶草属(trifolium)为豆科中分布最广的一属，是短期多年生豆科草本植物。三叶草种类遍及全世界，约有360多个种,其中农业经济价值较高的约25种。我国是草地大国，三叶草在我国广泛种植，主要分布在温带至热带地区，南至云南，北至黑龙江均有野生种和栽培种的分布，我国栽培较多的为红三叶、白三叶和杂三叶。三叶草是具有固氮能力的优良牧草，含丰富的蛋白质和矿物质，耐寒性强，绿期很长，同时也很耐热，对土壤要求不严，在酸性和碱性土壤上均能适应，其耐修剪、耐践踏，再生能力强，抗有害气体污染和抗病虫害能力强，还可以提高土壤肥力，保持土壤温度控制杂草生长，增加地面覆盖和减少土壤侵蚀。三叶草可作为家畜优良饲料、农作物的良好前茬、绿肥、也是良好的水土保持植物与庭园绿化植物以及蜜源和药材。
氮素是植物生长中最重要的营养元素之一，根瘤菌是一类能侵染豆科植物根部(少数是茎部)形成根瘤进行生物固氮的细菌，根瘤菌与豆科植物共生体系是生物固氮中作用最强的体系，土壤中的固氮微生物将空气中的氮气转化为植物可吸收的氨，所固定的氮约为生物固氮总量的65％。当前，在退化土壤中种植豆科植物越来越受到人们的关注，因为退化土壤中氮素营养比较贫乏，通过豆科植物与根瘤菌的共生固氮作用可以提高土壤肥力，接种根瘤菌能够提高豆科植物的产量和氮储藏量。如果种植的豆科植物没有相应的高效根瘤菌株与之共生结瘤并固定空气中的氮素，它们将完全依赖土壤中的结合态氮，不但不能补充反而会消耗土壤中的氮素，导致土壤肥力下降。因此，为了充分发挥根瘤菌与豆科植物的共生固氮作用，以维持土壤氮素平衡，需要筛选高效菌株进行人工接种。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是如何在酸性土壤中显著促进三叶草生长和/或提高三叶草产量。
为了解决以上技术问题，本发明提供了一株耐酸的根瘤菌。
本发明所提供的根瘤菌是三叶草根瘤菌(rhizobiumtrifolii)，其菌株号为92-29，该菌株已于2018年03月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmccno.15533，以下简称为三叶草根瘤菌92-29。
三叶草根瘤菌92-29属革兰氏染色阴性，短小杆状，无芽孢，具端生单鞭毛，能运动。菌体大小为0.7×2.2μm。在酵母汁甘露醇琼脂培养基平板上生长，菌落呈圆形微凸起，边缘整齐，表面光滑较湿润，浅乳白色，菌苔粘稠。三叶草根瘤菌92-29具有序列表中序列1的16srdna序列。
三叶草根瘤菌92-29在促进三叶草生长和/或提高三叶草产量中的应用也属于本发明的保护范围。
三叶草根瘤菌92-29在制备促进三叶草生长和/或提高三叶草产量的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述产品可为促进三叶草生长和/或提高三叶草产量的菌剂或含有所述菌剂的生物肥料。所述产品还可为促进三叶草生长和/或提高三叶草产量的三叶草根瘤菌种衣剂。所述产品还可为促进三叶草生长和/或提高三叶草产量的丸衣三叶草种子。
上述应用中，所述促进三叶草生长可为提高三叶草的株高、结瘤率、根瘤数量和/或根瘤重量。
上述应用中，所述促进三叶草生长可为促进三叶草在中性介质或酸性介质中的生长。
上述应用中，所述提高三叶草产量可为提高三叶草的单株重量(鲜重和/或干重)或单位面积的产量。
上述应用中，所述提高三叶草产量可为提高三叶草在中性介质或酸性介质中的产量。
上述应用中，所述介质可为土壤。
上述应用中，所述酸性介质的ph值可为大于等于4.2小于7，如4.8-6.15。
上述应用中，所述三叶草可为白三叶。
上述应用中，上述菌剂的活性成分可为三叶草根瘤菌92-29或/和三叶草根瘤菌92-29的代谢物，上述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据菌剂对三叶草植株重量和/或植株高度促进效果确定。
上述应用中，所述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体为矿物材料、生物材料；所述矿物材料可为草炭、粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述生物材料为各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生壳、玉米粉、豆粉、淀粉、草炭和动物的粪便中的至少一种；所述液体载体可为水；所述菌剂中，三叶草根瘤菌92-29或/和三叶草根瘤菌92-29的代谢物可以为被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
上述应用中，根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、ph调节剂等。
实验证明，本发明的三叶草根瘤菌92-29在酸性(ph值为4.8-6.15)土壤条件下显著促进三叶草生长并显著提高三叶草产量：提高三叶草的株高、结瘤率、根瘤数量和/或根瘤重量；增加三叶草的植株鲜重和干重，增加三叶草的鲜草产量和干草产量。本发明在三叶草种植业中具有广阔的应用前景。
保藏说明
菌种名称：三叶草根瘤菌(rhizobiumtrifolii)
菌株编号：92-29
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：cgmcc
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2018年3月30日
保藏中心登记入册编号：cgmccno.15533
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的固体培养基的配制方法如下：丙三醇5ml，甘露醇5g，酵母浸粉1g，k2hpo40.5g，无水mgso40.2g，caso4·2h2o0.2g，nacl0.1g，1％(nh4)6mo7o24·4h2o1ml、1％h3bo31ml，琼脂20g，用水定容至1000ml，调ph值为6.8-7.0，121℃灭菌30min。
下述实施例中的液体培养基的配制方法如下：丙三醇5ml，甘露醇5g，酵母浸粉1g，k2hpo40.5g，无水mgso40.2g，caso4·2h2o0.2g，nacl0.1g，1％(nh4)6mo7o24·4h2o1ml、1％h3bo31ml，用水定容至1000ml，调ph值为6.8-7.0，121℃灭菌30min。
下述实施例中的三叶草根瘤菌(rhizobiumtrifolii)accc18019于1981年12月19日收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心(简称accc，地址：北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081)，自该收藏日起公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株。三叶草根瘤菌(rhizobiumtrifolii)accc18019在下文中简称三叶草根瘤菌accc18019。
实施例1、三叶草根瘤菌(rhizobiumtrifolii)92-29cgmccno.15533的分离及鉴定
1、菌株的分离
从云南曲靖地区采集野生白三叶草根瘤，用平板(取甘露醇5g，丙三醇5g，酵母浸粉1g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸钙0.2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.1g，质量含量为1％的钼酸铵水溶液1ml和质量含量为1％的硼酸水溶液1ml，0.5％刚果红1ml，20g琼脂，蒸馏水1l，ph值为6.8-7.0)划线分离得到菌株92-29。
2、菌株的鉴定
2.1、形态学鉴定
将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤1分离并纯化得到的菌株92-29进行单菌落状态观察，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态、菌落边缘状态。另一方面，对处于对数生长期的菌株92-29，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。
结果表明菌株92-29属革兰氏染色阴性，短小杆状，无芽孢，具端生单鞭毛，能运动。菌体大小为0.7×2.2μm。在酵母汁甘露醇琼脂培养基平板上生长，菌落呈圆形微凸起，边缘整齐，表面光滑较湿润，质地均一，浅乳白色，菌苔粘稠。
2.2、16srdna序列同源性分析
采用菌落pcr方法扩增步骤1所得的菌株92-29的16srdna片段，相关试剂由全式金公司提供。对16srdna基因片段进行扩增并克隆测序的结果表明，菌株92-29的16srdna具有序列表中序列1的核苷酸序列。菌株92-29的16srdna与rhizobiumtrifolii菌株usda2370(t)的16srrna基因(sequenceid:mrdl01000029)的相似性最高为99.93％。
2.3、生理生化特征鉴定
参考《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京:科学出版社，2011.)和《微生物学实验》(沈萍,范秀容,李广武.微生物学实验(第三版).北京:高等教育出版社,1999.)测定菌株92-29的生理生化特征。结果表明菌株92-29为化能异养型，好氧生长，能利用葡萄糖、乳糖、d-核糖、d-纤维二糖、d-阿拉伯糖、甘露醇、木糖、d-半乳糖、果糖、卫矛醇和肌醇生长；利用铵盐、硝酸盐和多数氨基酸作为氮源，刚果红吸色反应微吸色，b.t.b反应产酸，明胶液化呈阳性，不能水解淀粉，不能利用纤维素，不能水解酪素，不利用3-酮基乳糖，不能利用柠檬酸盐，在含糖培养基上生长常伴有丰富的胞外粘液，在牛肉膏-蛋白胨培养基上不生长。
鉴于上述形态、生理生化特征分析和16srdna序列同源性分析结果，将步骤1分离纯化得到的菌株92-29鉴定为三叶草根瘤菌(rhizobiumtrifolii)。该三叶草根瘤菌(rhizobiumtrifolii)92-29已于2018年3月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmccno.15533，以下简称为三叶草根瘤菌92-29。
实施例2、三叶草根瘤菌92-29菌剂的制备
1、三叶草根瘤菌92-29的斜面培养
挑取实施例1的三叶草根瘤菌92-29接种于固体培养基进行斜面培养，在28℃下培养56小时，得到斜面培养的三叶草根瘤菌92-29。
2、菌种的活化
挑取步骤1斜面培养的三叶草根瘤菌92-29，将其接种于200ml液体培养基中，28℃、150rpm下振荡培养48小时，得到三叶草根瘤菌92-29菌液。
3、种子罐培养
取3l步骤2的三叶草根瘤菌92-29菌液，将其接入100l种子罐中(含有60l液体培养基)进行种子培养，在28℃、150rpm下通气搅拌培养48小时，得到三叶草根瘤菌92-29种子液。
4、发酵罐培养
按10％比例(体积比)将步骤3的三叶草根瘤菌92-29种子液接入1000l发酵罐中(含有600l液体培养基)进行发酵培养，在28℃、150rpm下通气搅拌培养48小时，得到三叶草根瘤菌92-29发酵液，该三叶草根瘤菌92-29发酵液中三叶草根瘤菌92-29的含量为4×109cfu/ml。
5、三叶草根瘤菌92-29菌剂的制备
将草炭自然干燥后进行粉碎，过100目筛，然后用石灰水调ph值为7.0，在121℃灭菌60min，得到无菌草炭。
将步骤4的三叶草根瘤菌92-29发酵液与该无菌草炭混匀，再在28℃条件下增殖培养50h，得到三叶草根瘤菌92-29菌剂。经检测成品合格，该三叶草根瘤菌92-29菌剂中的三叶草根瘤菌92-29的含量为3.0×108cfu/克。
实施例3、三叶草根瘤菌92-29在酸性培养基上不同ph的生长情况比较(耐受试验)
上述液体培养基在灭菌后用灭菌的1％naoh溶液和1％hcl溶液将培养基的ph调至4.2、4.4、4.5、4.6、4.8、5.0、5.5、6.0、7.0，得到不同ph值的液体培养基，每个处理3个重复，三叶草根瘤菌92-29和三叶草根瘤菌accc18019菌株分别接种于不同ph值的液体培养基中，在150rpm，28℃条件下恒温振荡培养48小时后，以各处理未接种菌的液体培养基作为空白对照测定其od600值。结果如表1所示，表明三叶草根瘤菌92-29可在ph值为4.2-7.0的范围内生长，三叶草根瘤菌accc18019只在ph值为4.8-7.0的范围内生长，并且在ph值为4.2-7.0的范围内，三叶草根瘤菌92-29的生长状况优于三叶草根瘤菌accc18019。说明三叶草根瘤菌92-29的耐酸性优于三叶草根瘤菌accc18019，是一株耐酸的根瘤菌。
表1、三叶草根瘤菌在各ph值的液体培养基培养48小时的od600值
实施例3、三叶草根瘤菌92-29促进三叶草生长并提高三叶草产量
一、三叶草根瘤菌accc18019菌剂的制备
1、三叶草根瘤菌accc18019的斜面培养
挑取三叶草根瘤菌accc18019接种于固体培养基进行斜面培养，在28℃下培养56小时，得到斜面培养的三叶草根瘤菌accc18019。
2、菌种的活化
挑取步骤1斜面培养的三叶草根瘤菌accc18019，将其接种于200ml液体培养基中，28℃、150rpm下振荡培养48小时，得到三叶草根瘤菌accc18019菌液。
3、种子罐培养
取3l步骤2的三叶草根瘤菌accc18019菌液，将其接入100l种子罐中(含有60l液体培养基)进行种子培养，在28℃、150rpm下通气搅拌培养48小时，得到三叶草根瘤菌accc18019种子液。
4、发酵罐培养
按10％比例(体积比)将步骤3的三叶草根瘤菌accc18019种子液接入1000l发酵罐中(含有600l液体培养基)进行发酵培养，在28℃、150rpm下通气搅拌培养48小时，得到三叶草根瘤菌accc18019发酵液，该三叶草根瘤菌accc18019发酵液中三叶草根瘤菌accc18019的含量为4×109cfu/ml。
5、三叶草根瘤菌accc18019菌剂的制备
将草炭自然干燥后进行粉碎，过100目筛，然后用石灰水调ph值为7.0，在121℃灭菌60min，得到无菌草炭。
将步骤4的三叶草根瘤菌accc18019发酵液与该无菌草炭混匀，再在28℃条件下增殖培养50h，得到三叶草根瘤菌accc18019菌剂。经检测成品合格，该三叶草根瘤菌accc18019菌剂中的三叶草根瘤菌accc18019的含量为3.0×108cfu/克。
二、三叶草根瘤菌92-29在ph6.15的土壤中促进三叶草生长并提高三叶草产量
试验地点在湖南省永州市祁阳县。本试验采用随机区组设计，随机设置三个处理区，每个处理区设三个小区重复。三个处理区分别为不接菌对照处理区、92-29菌剂处理区和accc18019菌剂处理区。每个小区大小为4×4㎡,土壤ph值为6.15，土著根瘤菌平均数量2.0×102cfu/g干土。按照三叶草播种量为2kg/hm2准备种子。
选择大小均一的白三叶种子，用浓硫酸浸泡1分钟之后用无菌水洗涤数次，以去除酸为止，得到处理后的种子。将该处理后的种子进行下述三种处理：
将实施例2制备的三叶草根瘤菌92-29菌剂与白三叶种子按照1：10的质量比混合、拌匀，得到的种子称为92-29-白三叶种子。
将步骤一制备的三叶草根瘤菌accc18019菌剂与白三叶种子按照1：10的质量比混合、拌匀，得到的种子称为accc18019-白三叶种子。
将无菌草炭与白三叶种子按照1：10的质量比混合、拌匀，得到的种子称为无菌草炭-白三叶种子。
上述种子按照小区设计均匀播种到土壤中，播种方法为条播，行距为10cm。上述各处理区除所播种的种子不同外，其他条件完全相同。其中，不接菌对照处理区播种的种子为无菌草炭-白三叶种子；92-29菌剂处理区播种的种子为92-29-白三叶种子；accc18019菌剂处理区播种的种子为accc18019-白三叶种子。
播种100天后在相同条件下，记录各个植株地下部分根瘤数量(简称结瘤数量)、地下部分根瘤鲜重(简称根瘤重量)、地下部分结瘤率(简称结瘤率)、地上部分植株高度、地上部分植株鲜重、地上部分植株干重，并计算出各组的平均值，分别得到平均结瘤率、平均根瘤数量、平均根瘤鲜重、地上部分植株平均高度(简称植株平均高度)、地上部分植株平均鲜重(简称植株平均鲜重)、地上部分鲜草重量(简称鲜草重量)、地上部分植株平均干重(简称干草重量)。
表2、各处理的试验结果
结果如表2所示，表明：
1、92-29菌剂处理区的白三叶与不接菌对照处理区的白三叶相比，结瘤率增加1125％、结瘤数量增加2800％、根瘤重量增加143.75％，每株植株平均高度增加96.15％、每株植株平均鲜重增加213.33％、鲜草重量增加108.91％、干草重量增加87.67％。
2、92-29菌剂处理区的白三叶与accc18019菌剂处理区的白三叶相比，结瘤率增加30.67％、结瘤数量增加112.20％、根瘤重量增加85.71％，每株植株平均高度增加37.84％、每株植株平均鲜重增加51.61％、鲜草重量增加36.61％、干草重量增加48.91％。
上述结果表明本发明的三叶草根瘤菌92-29对白三叶比三叶草根瘤菌accc18019在中性偏酸性土壤中具有更显著的促进生长和增产效果。
三、三叶草根瘤菌92-29在ph4.8的土壤中促进三叶草生长并提高三叶草产量
试验设不接菌对照处理、92-29菌剂处理和accc18019菌剂处理这三个处理。
选择大小均一的白三叶种子，用浓硫酸浸泡1分钟之后用无菌水洗涤数次，以去除酸为止，得到处理后的种子。将该处理后的种子进行下述三种处理：
将实施例2制备的三叶草根瘤菌92-29菌剂与白三叶种子按照1：10的质量比混合、拌匀，得到的种子称为92-29-白三叶种子。
将步骤一制备的三叶草根瘤菌accc18019菌剂与白三叶种子按照1：10的质量比混合、拌匀，得到的种子称为accc18019-白三叶种子。
将无菌草炭与白三叶种子按照1：10的质量比混合、拌匀，得到的种子称为无菌草炭-白三叶种子。
将上述无菌草炭-白三叶种子、92-29-白三叶种子和accc18019-白三叶种子分别播种到装有相同土壤的盆中(15cm×18cm的盆中装有1.5kg土壤，该土壤的ph值为4.80，取自湖南省永州市祁阳县)，每盆播种30粒种子。各处理中除所播种的种子不同外，其他条件完全相同。其中，不接菌对照处理播种的种子为无菌草炭-白三叶种子；92-29菌剂处理播种的种子为92-29-白三叶种子；accc18019菌剂处理播种的种子为accc18019-白三叶种子。实验重复四次，每次重复每个处理4盆。播种后放温室在相同条件下培养至开花期，记录各个处理的地下部分结瘤率(简称结瘤率)、植株地上部分高度、地上部分鲜重(植株鲜重)和地上部分干重(植株干重)，并计算出各组的平均值，分别得到结瘤率、地上部分植株平均高度(简称植株平均高度)、地上部分植株平均鲜重(简称植株平均鲜重)和地上部分植株平均干重(简称植株平均干重)。
表3、各处理的试验结果
结果如表3所示，表明：
1、92-29菌剂处理的白三叶与不接菌对照处理的白三叶相比，结瘤率增加1550％、每株植株平均高度增加66.67％、每株植株平均鲜重增加121.43％、每株植株平均干重增加107.14％。
2、92-29菌剂处理的白三叶与accc18019菌剂处理的白三叶相比，结瘤率增加88.57％、每株植株平均高度增加40.00％、每株植株平均鲜重增加55.00％、每株植株平均干重增加51.63％。
上述结果表明本发明的三叶草根瘤菌92-29对白三叶比三叶草根瘤菌accc18019在酸性土壤中具有更显著的促进生长和增产效果。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
<110>中国农业科学院农业资源与农业区划研究所
<120>一株耐酸的三叶草根瘤菌及其应用
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<213>三叶草根瘤菌（rhizobiumtrifolii）
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