巨大芽孢杆菌BM22及其芽孢液体制剂在防治仙客来黑根病中的应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，涉及巨大芽孢杆菌bm22及其芽孢液体制剂在防治仙客来黑根病中的应用。

背景技术

仙客来(cyclamenpersicummill)，别名萝卜海棠、兔耳花、兔子花、一品冠、篝火花、翻瓣莲，是报春花科、仙客来属多年生草本植物，叶片由块茎顶部生出，心形、卵形或肾形，叶片有细锯齿，叶面绿色，具有白色或灰色晕斑，叶背绿色或暗红色，叶柄较长，红褐色。仙客来性喜温暖，怕炎热，在凉爽的环境下和富含腐殖质的肥沃沙质壤土中生长最好。较耐寒，可耐0℃的低温不致受冻。秋季到第2年春季为其生长季节，夏季半休眠，冬季适宜的生长温度在12～16℃之间，促进开花时不应超过18～22℃，0℃以上植株将进入休眠，35℃以上植株易腐烂、死亡，冬季可耐低温，但5℃以下则生长缓慢，花色暗淡，开花少。冬季补充二氧化碳气体，可促进生长和开花。在生长期，要求空气湿润和日照充足的环境。

仙客来黑根病又称苗腐病，是仙客来上的一种严重病害，引起根系腐烂，整株死亡。病菌从根部侵入，病株支根腐烂消失，主根呈黑褐色腐烂，地上部分叶片抽生展开晚，展开叶枯萎、下垂。病株易与软腐病并发，导致块茎软化腐烂。由半知菌亚门的根串株霉(thielaviopsisbasicola(berk.etbr.)ferr.)引起，病菌随病残体在土壤中越冬，翌年在田间进行初侵染。在田间每克土壤带111个分生孢子和厚垣孢子。病菌通过水流或灌溉水传播蔓延，土壤潮湿，连作地，植株发病较重。目前该病主要是化学防治，但对环境友好、人畜安全、可持续利用的生物防治并未涉及。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术在防治仙客来黑根病中的缺陷，提供了巨大芽孢杆菌bm22及其液体制剂在防治仙客来黑根病中的应用。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明的巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)bm22菌株于2017年6月15日采用平板稀释涂布法分离于四川大邑仰天窝药场健康杜仲叶片，已经于2017年12月15日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmccno.15070。

本发明巨大芽孢杆菌bm22在na平板培养基上培养了2d的单菌落呈乳白色，圆形，表面粗糙，边缘波纹状，不透明，无粘性。

本发明巨大芽孢杆菌bm22的16srdna序列如seqidno.1所示。

本发明以巨大芽孢杆菌bm22为活性成分的液体制剂，由巨大芽孢杆菌bm22为菌种，经种子培养、发酵培养得到液体制剂。

本发明所述的以巨大芽孢杆菌bm22为菌种的液体制剂中含活芽孢数不低于1×10⁹cfu/g。

本发明所述的以巨大芽孢杆菌bm22为菌种的芽孢液体制剂通过以下方法制备：

1)一级斜面种子：制作牛肉膏蛋白胨斜面培养基，接种巨大芽孢杆菌bm22后，培养制成一级种子；

2)二级液体种子：营养肉质培养液经高压灭菌后，在通氧控制下盛于三角瓶，在无菌状态接种巨大芽孢杆菌bm22斜面种子，振荡培养，制成巨大芽孢杆菌bm22液体种子；

3)发酵培养液经高压灭菌后，在通氧控制下盛于三角瓶，在无菌状态接种巨大芽孢杆菌液体种子，接种量为液体总体积的15％，振荡培养4天后，制成芽孢液体制剂。

所述的牛肉膏蛋白胨斜面培养基为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，nacl3.5g，琼脂18g，水1000ml。

所述的营养肉质培养液为：牛肉膏7g，蛋白胨10g，nacl5g，仙客来根皮浸渍液1000ml。

所述的发酵培养液为：玉米面0.5-0.6％，玉米淀粉0.08～0.2％，麸皮0.9～1.2％，葡萄糖0.18～0.54％，黄豆饼粉0.05～0.15％，大豆粉0.2～0.5％，kh2po40.005～0.006％，(nh4)2so40.006～0.008％，mnso40.004～0.005％，caco30.0005～0.002％，mgso4·7h2o0.005～0.006％，以及余量的仙客来根浸渍液，ph7.0～7.5。

本发明所述的巨大芽孢杆菌bm22在防治仙客来黑根病中的应用。

本发明所述的巨大芽孢杆菌bm22芽孢液体制剂在防治仙客来黑根病中的应用，具体为在苗期或植物生长过程中进行喷雾或灌根施用。

所述的液体制剂在治疗仙客来黑根病的应用，其液体制剂稀释液为将液体制剂制成浓度为1×10⁹cfu/ml，然后再稀释施用。

本发明的有益效果为：

与现有仙客来黑根病的技术方案相比，本发明筛选的生防菌巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)bm22菌株，具有抗逆性强的芽孢，商品贮藏寿命长，对环境适宜性强，可生产成商品生物制剂；巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)bm22菌株无公害防控仙客来黑根病，并促进仙客来生长。

附图说明

图1是本发明巨大芽孢杆菌bm22rdna-its序列pcr扩增产物电泳图；

图2是基于16srdna序列构建的菌株bm22的系统发育树。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明技术方案作进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与改型，均落在本发明的保护范围内。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1巨大芽孢杆菌bm22的分离与鉴定

1.1内生细菌的分离、纯化与保存

在四川大邑仰天窝药场杜仲黑斑病发生区取健康杜仲叶片。采回的样本用无菌水冲洗干净，称取1.0g组织，在70％的酒精中浸泡1-2min，再用1-3％次氯酸钠溶液消毒3-5min，无菌水洗涤若干遍后，吸取最后一次洗涤液100μl涂抹na平板(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000ml，ph7.0，混匀分装后121℃高压灭菌30min)，27℃黑暗培养24h，用于表面消毒的对照，检查表面消毒是否彻底。

将已表面消毒的树皮组织剪碎，放入无菌的研钵，加入灭菌的石英砂和10ml无菌水，充分研磨，静置30min，稀释10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5共5个梯度，分别吸取100μl10^-3，10^-4，10^-5这3个梯度研磨液分别涂布na平板(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000ml，ph7.0，混匀分装后121℃高压灭菌30min)，每个处理3次重复，27℃培养48h，挑取菌落形态差异明显的单菌落进入初筛。

依据菌落的大小、颜色、是否突起，边缘特征、表面光滑与否、透明度等方面的差异，挑取单菌落在na平板上划线纯化，纯化后转接na斜面于4℃保藏备用。共获36个内生细菌。

1.2内生细菌对仙客来黑根病菌(thielaviopsisbasicola)的平板拮抗作用

平板对峙法：在培养皿中央接种7d的仙客来黑根病菌(thielaviopsisbasicola)菌饼(直径6mm)，离该病菌饼约3cm处，分别用接种环沾取培养2d的内生菌，在病菌对称两侧各划一条细线，28℃培养，以只接种病菌的平板为对照，待对照长满皿时测量病菌的菌落生长直径，每处理重复3次。按下式计算菌落生长抑制率：

菌落生长抑制率＝(对照菌落净生长直径－处理菌落净生长直径)/对照菌落净生长直径×100％。

表1是32株内生细菌中对仙客来黑根病菌(thielaviopsisbasicola)有较好拮抗作用的菌株，其中bm22抑制率达到100％。

表1内生细菌对仙客来黑根病菌的拮抗作用(7d)

1.3内生拮抗菌的种类鉴定

经形态学观察，结合生理生化指标(表2)和分子生物学鉴定该内生菌bm22为巨大芽孢杆菌。

表2菌株bm22生理生化指标

在na平板培养基上培养了2d的bm22菌株的单菌落乳白色，圆形，表面粗糙，边缘波纹状，不透明，无粘性。

分子生物学鉴定(16srdna)：通过提取细菌dna进行pcr扩增及电泳，回收产物送至生物技术公司测序；将所测序列与genbank数据库中已经报道的序列进行同源性blast分析，并用clustalx(1.83)软件进行多重序列比较，再用mega4.0软件中的邻接法构建系统发育树，确定bm22菌株在微生物系统发育学上的地位。分子生物学鉴定得到长度为949bp的dna片段(图1)，将bm22菌株的16srdna序列递交genbank数据库进行blast分析，选取其中与之同源性较高的细菌16srdna序列，并用clustalx软件进行多重匹配排列分析，用mega分析软件构建系统发育树(图2)。可以看出，bm22菌株与jx286698以99％的16srrna基因核苷酸序列相似性和较高的自展值支持聚为1个分支，而与其他芽孢杆菌相距较远，表明bm22与bacillusmegaterium的亲缘关系最近。

基于以上特征，上述bm22菌株其分类命名为巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)bm22，已于2017年12月15日保存在中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.15070。

实施例2巨大芽孢杆菌bm22芽孢液体剂的制备

1.1芽孢液体剂的制备

根据实施例1得到的巨大芽孢杆菌bm22，经过种子培养、发酵培养制成液体制剂，具体通过以下方法：

常规方法制作牛肉膏蛋白胨斜面培养基(牛肉膏5g，蛋白胨10g，nacl3.5g，琼脂18g，水1000ml)，接种巨大芽孢杆菌后，培养制成一级种子。

营养肉质培养液(牛肉膏7g，蛋白胨10g，nacl5g，厚朴根皮浸渍液1000ml)经高压灭菌后，在通氧控制下，按100ml液体盛于300ml三角瓶比例装瓶，在无菌状态接种巨大芽孢杆菌斜面种子，每瓶接种2支斜面种子，振荡培养，制成巨大芽孢杆菌液体种子。其中将10g仙客来根系在1000ml水中煮沸10分钟，过滤，得到的滤液为仙客来根浸渍液。

芽孢液体发酵：玉米面0.5-0.6％，玉米淀粉0.08～0.2％，麸皮0.9～1.2％，葡萄糖0.18～0.54％，黄豆饼粉0.05～0.15％，大豆粉0.2～0.5％，kh2po40.005～0.006％，(nh4)2so40.006～0.008％，mnso40.004～0.005％，caco30.0005～0.002％，mgso4·7h2o0.005～0.006％，以及余量的仙客来根浸渍液，ph7.0～7.5。培养液经高压灭菌后，在通氧控制下盛于三角瓶，在无菌状态接种巨大芽孢杆菌液体种子，接种量为液体总体积的15％，振荡培养4天后，制成芽孢液体剂，含活芽孢数不低于1×10⁹cfu/g。该菌剂在使用时可稀释液对仙客来苗木灌根。

制剂保存：瓶装制剂常温保存1年或低温(4℃)2年不影响生防和促生效果。

实施例3灌根施用防病促生实验

分不同发病程度，在春季，用bm22芽孢液体制剂稀释成不同浓度灌根土壤100ml/株各一次，30天后统计结果。防效与促生见(表3－6)。轻度发生，以1000倍液为经济浓度，中度发生以800倍液为经济浓度，重度发生以50倍至原液为经济浓度。

表3bm22芽孢液体制剂生防仙客来黑根病

表4bm22菌株促进仙客来生长(1年生苗，轻度发生区)

表5bm22菌株促进仙客来生长(1年生苗，中度发生区)

表6bm22菌株促进仙客来生长(1年生苗，重度发生区)

综上所述，生防菌商品贮藏寿命长，对环境适宜性强是商品化生物制剂和成功生防的前提和保障。本发明筛选出的控制仙客来黑根病的bacillusmegateriumbm22菌株，具有抗逆性强的芽孢体，贮藏性好，抗高温、低温、耐干燥，适宜于商品化生产，且施用一次可长期有效、能持续控病，大幅降低成本。本发明筛选出的bacillusmegateriumbm22菌株对仙客来具有防病促生双重功能。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110>四川农业大学

<120>巨大芽孢杆菌bm22及其芽孢液体制剂在防治仙客来黑根病中的应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>949

<212>dna

<213>巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)

<400>1

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