寒地秸秆腐熟细菌菌株及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一株分离的寒地秸秆腐熟细菌菌株，还涉及所述寒地秸秆腐熟细菌菌株在低温下高效酵解水稻秸秆中的应用，属于寒地秸秆腐熟细菌的分离及应用领域。

背景技术

水稻秸秆含有丰富的纤维素、半纤维素、木质素、蛋白质和矿物质元素等营养物质，是一种可再生的生物资源。但我国秸秆利用率不足33％，由于秸秆中纤维素含量最高，因此，筛选具有高纤维素酶产酶特性的微生物成为研究秸秆腐熟剂的重要方向之一。

em菌是由光合菌群、乳酸菌群、酵母菌群、发酵丝状菌和放线菌等多种微生物组成的一个有益菌群，在应用时具有成本低、使用方法简便等优点，已经在农业领域、畜牧业领域、水产领域和水污染领域等方面被广泛应用。本研究室经过研究表明，在东北室外温度在零下12℃至25℃之间的条件下，采用em菌发酵液发酵水稻秸秆，在45d内可以实现秸秆有效酵解，本试验以高寒地带冬季em菌酵解水稻秸秆的腐熟物为研究对象，对寒地水稻秸秆腐熟细菌菌株进行分离，筛选出能够在低温条件下腐熟秸秆的高效菌株，通过形态学和分子生物学进行鉴定；探讨该菌株的耐冷性及发酵的影响因素，并进行酵解试验，确定其低温酵解水稻秸秆的能力，通过以上研究为增加寒地水稻秸秆腐熟菌剂的菌种组成及秸秆腐熟剂的应用提供实践基础和理论依据。

技术实现要素：

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一株分离的寒地秸秆腐熟细菌菌株；

本发明所要解决的第二个技术问题是提供所述寒地秸秆腐熟细菌菌株在制备水稻秸秆腐熟剂以及酵解水稻秸秆中的应用。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明从寒地em菌液酵解水稻秸秆腐熟物的微生物中分离和纯化得到了23株寒地水稻秸秆腐熟细菌菌株。本发明进一步利用不同温度培养条件对所分离的低温秸秆腐熟细菌菌株进行初筛，共筛选出7株能够在15°c低温条件下正常生长的细菌菌株。

本发明更进一步以初筛获得的7株细菌菌株分解纤维素能力的大小为依据，对寒地秸秆腐熟菌进行复筛，通过观察获得的细菌在cmc-刚果红固体培养基中透明圈直径与菌落直径之比(d/d)的大小，判断菌株产生纤维素酶的能力大小。结果发现c4菌株透明圈直径与菌落直径之比(d/d)较大，为2.86，说明菌株c4产生纤维素酶的能力较强，分解纤维素的能力也较强。

秸秆腐熟细菌c4在lb固体和液体培养基上进行培养，观察菌落及菌体形态。形态学观察结果表明，该细菌能在固体培养基上形成了单一的菌落。菌株c4的菌落为具有白色，半透明，光滑湿润，稍隆起的圆形齐整菌落，在光镜下可见两端钝圆、长短不一的杆菌，呈现为革兰氏阳性，通过以上观察，初步推断筛选的秸秆腐熟细菌菌株都为解淀粉芽孢杆菌。本发明将该菌株定名为bacillusamyloliquefaciens-c4。

耐冷性鉴定结果表明，bacillusamyloliquefaciens-c4菌株在不同温度下都可以生长，在4℃培养温度下仍然具有旺盛的生长力，表明本试验筛选获得的腐熟细菌菌株为耐冷微生物，具有较强的耐寒性，可以在北方低温地区正常生长。

本发明将分离的寒地秸秆腐熟细菌菌株bacillusamyloliquefaciens-c4提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：cgmccno.15178；分类命名为：解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2018年1月11日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明进一步公开了所述的寒地秸秆腐熟细菌菌株bacillusamyloliquefaciens-c4在酵解秸秆中的应用，尤其在酵解水稻秸秆中的应用。

本发明进一步公开了所述的寒地秸秆腐熟细菌菌株bacillusamyloliquefaciens-c4在制备秸秆腐熟剂中的应用。

本发明还公开了所述的寒地秸秆腐熟细菌菌株bacillusamyloliquefaciens-c4在制备寒地水稻秸秆腐熟剂中的应用。本发明所述寒地为低温地区，其温度范围为0℃至35℃。

本发明还公开了一种水稻秸秆腐熟剂，包括：本发明所述的寒地秸秆腐熟细菌菌株bacillusamyloliquefaciens-c4的发酵液。

本发明还公开了一种水稻秸秆腐熟剂，包括：本发明所述的寒地秸秆腐熟细菌菌株bacillusamyloliquefaciens-c4的发酵液和em菌菌液。其中，所述寒地秸秆腐熟细菌菌株bacillusamyloliquefaciens-c4的发酵液与em菌菌液按体积比1：1混合。

本发明所述寒地秸秆腐熟细菌菌株的发酵液的制备包括：将所述的寒地秸秆腐熟细菌菌株bacillusamyloliquefaciens-c4接种于lb液体培养基中进行培养，收集菌液，即得。

本发明采用无氮源的赫奇逊氏无机盐培养基作为基础培养基。其中，所述液体培养基的氮源分别为蛋白胨、酵母膏、硫酸铵或尿素，氮源的添加量为0.2％(质量百分比)；按体积百分比计，所述接种的接种量为1-9％；所述培养的温度为10-40℃；液体培养基的初始ph值为4-10；培养的时间为1-7d。优选的，所述液体培养基的氮源为蛋白胨，氮源的添加量为0.2％(质量百分比)；所述接种的接种量为5％(体积百分比计)；所述培养的温度为25℃，液体培养基的初始ph值为7，培养的时间为3d。

本发明对所述em菌菌液没有特殊限制，市售的em菌菌液均适用于本发明。

本发明对所述寒地秸秆腐熟细菌菌株bacillusamyloliquefaciens-c4的发酵条件进行了优化。氮源优化结果表明，该菌株分别在添加硫酸铵或尿素作为氮源培养基上产生纤维素酶的活性较低，而在以蛋白胨或酵母膏为氮源培养基上产纤维素酶的活性较高，其中在以蛋白胨为氮源培养基上产纤维素酶的活性最高，不同氮源培养基上产纤维素酶的活性差异很显著。本发明确定适合该寒地秸秆腐熟细菌发酵培养的最佳氮源为蛋白胨。接种量优化结果表明，在接种量1-3％的范围内该菌株具有较高纤维素酶活性，接种量为5％时具有最高的产酶活性，接种量超过5％后，酶活力开始下降；综合比较，确定该寒地秸秆腐熟细菌发酵的最佳接种量为5％。培养温度优化结果表明，该菌株在温度10-25℃时酶活力逐渐增加，到25℃时酶活力最高；随着温度继续升高，产酶活力逐渐下降，在40℃时菌株的产酶活力下降到最低。本发明确定该寒地秸秆腐熟细菌发酵的最佳温度为25℃。培养基初始ph值优化结果表明，初始ph值对寒地秸秆腐熟细菌bacillusamyloliquefaciens-c4菌株产纤维素酶活力影响较大；过酸或过碱，酶活性很低，几乎无法检出纤维素酶活性；培养基初始ph在5-8的范围内，菌株产纤维素酶活力都表现为较高的水平，在初始ph为7时纤维素酶活性最高，当培养基初始ph升至8时，菌株的产酶活性呈下降趋势。因此，本发明确定酸性和中性的溶液环境有利于其产酶，寒地秸秆腐熟细菌的发酵最佳初始ph值为7。培养时间优化结果表明，寒地秸秆腐熟细菌bacillusamyloliquefaciens-c4菌株的产酶活性随着培养时间的延长，表现为先呈现快速上升，然后缓慢下降的趋势，在培养3d的时候，具有最好的产酶活性，3d后cmc酶活力逐渐降低，但仍具有较强的酶活。本发明确定该寒地秸秆腐熟细菌产纤维素酶的最佳培养时间为3d。

寒地秸秆腐熟菌的对滤纸的酵解效果分析结果表明，bacillusamyloliquefaciens-c4菌株能够有效地酵解滤纸，处理后1～3d，随着处理时间的延长，滤纸的失重率显著上升，5d后滤纸的分解率呈现缓慢上升趋势，在15d时秸秆滤纸的分解率达到了81.8％以上。以上结果表明，本发明筛选的秸秆腐熟细菌bacillusamyloliquefaciens-c4具有较强的滤纸酵解能力。

本发明在低温条件下，采用细菌bacillusamyloliquefaciens-c4与em菌发酵液混合(按照体积1：1混合)进行水稻秸秆的酵解试验，低温酵解水稻秸秆30d，结果表明，相对于只用em菌发酵液的处理，复合发酵液的秸秆酵解效率提高了48.8％。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明获得的能够在低温条件下酵解腐熟水稻秸秆的高效菌株bacillusamyloliquefaciens-c4经鉴定为解淀粉芽孢杆菌，为耐冷菌，具有较好的水稻秸秆酵解效果。本发明为增加寒地秸秆腐熟菌剂的菌种组成及秸秆腐熟剂的应用提供实践基础和理论依据。

附图说明

图1为cmc-刚果红培养基上寒地秸秆腐熟细菌bacillusamyloliquefaciens-c4的透明圈

图2为寒地秸秆腐熟细菌bacillusamyloliquefaciens-c4的形态学鉴定；其中，a为c4菌株的菌落形态；b为c4菌株显微形态；

图3为寒地秸秆菌株bacillusamyloliquefaciens-c4基于16srdna序列同源性构建的系统发育树；

图4为不同氮源对寒地秸秆腐熟细菌bacillusamyloliquefaciens-c4菌株产酶的影响；

图5为不同接种量对寒地秸秆腐熟细菌bacillusamyloliquefaciens-c4产酶的影响；

图6为不同温度对寒地秸秆腐熟细菌bacillusamyloliquefaciens-c4产酶的影响；

图7为培养基初始ph对寒地秸秆腐熟bacillusamyloliquefaciens-c4产酶的影响；

图8为培养时间对寒地秸秆腐熟细菌bacillusamyloliquefaciens-c4产酶的影响；

图9为寒地秸秆腐熟细菌bacillusamyloliquefaciens-c4对滤纸分解率的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1寒地秸秆腐熟菌的分离鉴定

1、试验材料与方法

1.1试验材料

本发明中所使用em菌菌液由黑龙江省农科院提供。水稻秸秆采自东北农业大学试验田。

2.2试验方法

2.2.1寒地秸秆em菌腐熟

2016年12月份，在黑龙江省哈尔滨东北农业大学试验田，室外温度在零下12℃至25℃之间，将粉碎水稻秸秆与em菌液混合物埋于深沟中，采用未处理的秸秆及塑料布覆盖，腐熟分解60d。取出的秸秆腐熟物呈腐烂状态，偶见条状或小碎片状未完全腐熟的秸秆碎块。

2.2.2寒地秸秆腐熟细菌的分离

2.2.2.1秸秆腐熟物中菌株的分离、初筛和保存

(1)腐熟物中细菌菌株的分离：称取5g秸秆腐熟物于锥形瓶中加入50ml无菌水，37℃在摇床上培养24h。用接菌环蘸取腐熟物悬浮上清液在菌株分离培养基上划线，分离出细菌单菌落后，接在lb固体培养基上。

(2)腐熟物中菌株的初筛：利用寒地秸秆腐熟菌能够在低温条件下生长，利用不同温度对富集分离的菌株进行初筛。采用4℃、10℃、15℃、25℃和37℃等温度条件，培养所分离的菌株，观察菌株生长情况，筛选出能在低温条件下正常生长的菌株。

(3)菌株的保存：将分离出细菌接在lb液体培养基中，37℃培养24h,取细菌菌液置于已高压灭菌后的50％甘油中，-80℃保存。

2.2.2.2寒地秸秆腐熟菌的复筛

以低温筛选获得微生物是否具有分解纤维素的能力作为依据，对寒地秸秆腐熟菌进行复筛。将初筛获得的可以在低温条件下生长的细菌，接种在cmc-刚果红培养基上，观察培养基上透明圈大小，计算透明圈与菌株直径之比(d/d)。菌株在cmc-刚果红固体培养基上透明圈大小在一定程度上能够反映菌株分解纤维素能力的大小，透明圈越大，表明菌株分解纤维素的能力越强。

2.2.3寒地秸秆腐熟菌的鉴定

2.2.3.1寒地秸秆腐熟菌的形态学鉴定

复筛到的细菌菌株分别接种于lb固体和lb液体培养基中，24h后观察菌落外观和菌体形态，采用革兰氏染色法对细菌进行分类鉴定。

2.2.3.2寒地秸秆腐熟菌的分子鉴定

从lb平板培养基上接种已经纯化好的单菌落到30ml的lb液体培养基中，37℃培养24h，采用sds细菌的dna，利用细菌鉴定的16srdna序列通用引物27f/541r作为寒地秸秆腐熟细菌的分子鉴定引物进行pcr扩增，将pcr产物至哈尔滨博仕生物技术有限公司进行测序。采用mega5.0软件构建系统发育树，对细菌的种属进行分子鉴定。

2.2.4寒地秸秆腐熟菌的耐冷性鉴定

将前期筛选和鉴定获得秸秆腐熟细菌分别接种于lb固体和lb液体培养基，记录菌株在5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃的培养条件下的生长状况，确定筛选的秸秆腐熟菌的耐冷性。

2.2.5寒地秸秆腐熟菌的发酵条件优化

2.2.5.1培养基不同的氮源对腐熟菌发酵的影响

为了研讨培养基不同氮源的对腐熟菌发酵的影响，本试验采用无氮源的赫奇逊氏无机盐培养基作为基础培养基，在此基础上添加不同的氮源，添加的氮源分别是蛋白胨、酵母膏、硫酸铵和尿素，添加量为0.2％(质量百分比)，每个处理4瓶，设3个重复。在25℃培养3d时，取菌液0.2ml，用于纤维素酶活性测定，测定方法为dns法。

2.2.5.2菌种接种量对腐熟菌发酵的影响

为了研讨不同菌种接种量对腐熟菌发酵的影响，本试验设计不同的菌种接种量。设置1％、3％、5％、7％、9％五个接种量(体积百分比)处理。在以蛋白胨为氮源的液体发酵培养基中接种，培养基初始ph值为7.0，25℃培养，每个处理5瓶，设3个重复。在培养7d时，分别取菌液0.2ml，用于纤维素酶活性测定。

2.2.5.3培养温度对腐熟菌发酵的影响

为了研讨不同培养温度对腐熟菌纤维素酶活性的影响，本试验设计不同的菌株培养温度。设置了10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃共7个培养温度处理。在以蛋白胨为氮源的液体发酵培养基中分别以5％的接种量接种，培养基初始ph值为7.0，每个处理7瓶，设3个重复。在培养7d时，分别取菌液0.2ml，用于纤维素酶活性测定。

2.2.5.4培养基初始ph值对腐熟菌发酵的影响

为了研讨不同培养基初始ph值对腐熟菌发酵的影响，本试验设计不同的培养基初始ph值。设置了4、5、6、7、8、9、10共7个不同培养基初始ph值处理。以蛋白胨为氮源的液体发酵培养基为基础培养基，调节培养基初始ph，以5％的接种量接种，25℃培养，每个处理7瓶，设3个重复。在培养7d时，分别取菌液0.2ml，用于纤维素酶活性测定。

2.2.5.5培养时间对腐熟菌发酵的影响

为了研讨不同培养时间对腐熟菌发酵的影响，本试验设计不同的培养时间。设置1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d共7个不同培养时间处理。以蛋白胨为氮源的液体发酵培养基，培养基初始ph值为7，以5％的接种量接种，25℃培养，每个处理7瓶，设3个重复。按实验设计的培养时间培养后，分别取菌液0.2ml，用于纤维素酶活性测定。

2.2.6寒地秸秆腐熟细菌酵解试验

2.2.6.1秸秆腐熟细菌滤纸酵解试验

取筛选到的秸秆腐熟细菌以5％的接种量接种于培养基初始ph为7的含滤纸的lb液体培养中，15℃培养。在接种后，每24h测量滤纸的失重率，连续测量8d。每个处理8瓶，设3个重复。滤纸失重率的测定方法是取发酵液过滤，将残留物质置于烘箱中80℃烘干至恒重，进而测定滤纸失重率。

2.2.6.2低温高效酵解秸秆细菌与em菌复配酵解秸秆试验

采用发酵后的低温高效酵解秸秆细菌发酵液与em菌发酵液1:1混合，在4℃条件下酵解水稻秸秆。水稻秸秆的处理方法：用2mol/l的naoh溶液浸泡水稻秸秆段24h，水洗至ph＝7，干燥箱80℃烘干，烘干后的秸秆段粉碎100目过筛备用。发酵的组成，根据发酵水稻秸秆的量添加5％em菌发酵液，5％低温高效酵解秸秆细菌发酵液，1％红糖，湿度控制在35％-65％之间，发酵30d，以em菌发酵液为对照。酵解结束后，测定秸秆的失重率，测定方法同滤纸失重率方法相同。

3、试验结果

3.1寒地秸秆腐熟细菌的分离

3.1.1寒地秸秆腐熟菌的初筛

通过对寒地秸秆腐熟物中的微生物进行6次分离和纯化，共获得了23个菌株。在不同温度培养条件下，对分离的菌株进行培养，观察其生长情况，进行低温秸秆腐熟菌的初筛。结果表明，筛选出的能够在15℃低温条件下正常生长细菌为7株，分别为a3、c4、c1、c4、d7、e5和e14。

3.1.2寒地秸秆腐熟细菌的复筛

对初筛到的能在低温条件下正常生长的7株细菌菌进行复筛，主要是通过cmc-刚果红固体培养基上的透明圈直径大小进行复筛。观察筛选获得细菌的cmc-刚果红固体培养基中透明圈直径与菌落直径之比(d/d)大小，其中c4具有较大的透明圈直径与菌落直径之比(d/d)，为2.86，透明圈大小在一定程度上说明菌株产生纤维素酶的能力，说明菌株c4具有较强的酵解能力(见图1)。

3.2寒地秸秆腐熟菌的形态学观察

将筛选出来的秸秆腐熟细菌c4在lb固体和液体培养基上进行培养，观察菌落及菌体形态。结果表明，该细菌都能在固体培养基上形成了单一的菌落。菌株c4的菌落为具有白色，半透明，光滑湿润，稍隆起的圆形齐整菌落，在光镜下可见两端钝圆、长短不一的杆菌(见图2-a)。呈现为革兰氏阳性(见图2-b)，通过以上观察，初步推断筛选的秸秆腐熟细菌菌株都为芽孢杆菌。

3.3寒地秸秆腐熟菌的分子鉴定

通过细菌16srdna序列分析，对筛选获得的腐熟菌c4进行分子生物学鉴定，其中，扩增的获得16srdna序列片段长度为1449bp。对获得的序列进行blast比对及系统发育树构建，结果如图3所示。根据系统发育树的结果，确定c4为短小芽胞杆菌(bacillusamyloliquefaciens)，这个结果同前面的形态学鉴定具有一致性，将该菌株定名为bacillusamyloliquefaciens-c4。

本发明将分离的bacillusamyloliquefaciens-c4菌株提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，其微生物保藏编号为：cgmccno.15178。

3.4寒地秸秆腐熟菌的耐冷性鉴定

对筛选获得的bacillusamyloliquefaciens-c4菌株进行耐冷性鉴定。将筛选的腐熟细菌接种在lb的培养基中，在不同培养温度下进行培养，结果表明该菌株在不同温度下都可以生长，在4℃条件下，仍然具有旺盛的生长力，表明这些腐熟菌具有较强的耐冷性。本试验筛选获得的腐熟菌株为耐冷微生物，可以在北方低温地区正常生长。

3.5寒地秸秆腐熟菌发酵条件优化

3.5.1最佳氮源筛选

对筛选的寒地秸秆腐熟细菌bacillusamyloliquefaciens-c4发酵的最佳氮源进行筛选。结果如图4所示，由结果可以看出，在以蛋白胨和酵母膏为氮源培养基上产纤维素酶的活性较高，而在添加硫酸铵和尿素作物氮源培养基上产生纤维素酶的活性较低，并且差异很显著。综合比较结果，适合于寒地秸秆腐熟细菌产纤维素酶的培养最佳氮源为蛋白胨。

3.5.2接种量对发酵的影响

对筛选的寒地秸秆腐熟细菌发酵的最佳接种量进行筛选，结果如图5所示。由结果可以看出，接种量的不同会影响菌株液体发酵产纤维素酶的活性，随着接种量的增加，秸秆腐熟细菌产纤维素酶的活性呈现先上升，后下降的趋势，该细菌都具有较高纤维素酶活性。接种量为1％和3％时，产酶和酶活力逐渐增高。接种量超过5％后，酶活力开始下降，可能是由于菌含量过多，环境中营养物质有限，菌体生长大量消耗营养物质而产酶能力下降。综合比较结果，最佳接种量为5％。

3.5.3温度对发酵的影响

由图6可看出，菌株bacillusamyloliquefaciens-c4是在温度10-30℃时酶活力逐渐增加，到30℃时酶活力最高，但产酶的活力同25℃比，差异不显著。随着温度升高，产酶活力开始下降，在40℃时，菌株的产酶活力都下降到最低。由这些结果可以看出，本试验筛选的菌株具有一个很宽的产酶活性区间，低温更有利于其产酶。综合比较结果，确定该菌株发酵的最佳温度为25℃。

3.5.4培养基初始ph对发酵的影响

由图7可看出，在过酸、过碱的环境中秸秆腐熟细菌bacillusamyloliquefaciens-c4的cmc酶活力很低，甚至不产酶。在ph为5至8时，腐熟细菌具有产酶活性，在培养基初始ph为7时，具有最高的cmc酶活力，当ph升高到8时，产酶的活性都出现了显著性下降，在强碱性条件下，该菌株根本不产酶。这些结果表明，本试验筛选的低温秸秆腐熟菌株更适于在酸性和中性条件下产酶，确定最佳培养基初始ph值为7。

3.5.5培养时间对产酶的影响

由图8可以看出，bacillusamyloliquefaciens-c4菌株的产酶活性随着培养时间的延长，呈现先上升，后下降的趋势。在培养3d的时候，都具有最好的产酶活性，3d后cmc酶活力逐渐降低，但仍具有较强的酶活性。确定寒地秸秆腐熟细菌发酵的最佳培养时间为3d。

3.6寒地秸秆腐熟菌的酵解效果分析

3.6.1细菌对滤纸的酵解效果

为了验证筛选的寒地秸秆腐熟细菌的酵解效果，采用腐熟细菌进行滤纸酵解试验。细菌处理后，滤纸的分解率如图9所示。由结果可以看出，在采用bacillusamyloliquefaciens-c4菌株处理后1～3d，随着处理时间的延长，滤纸的失重率显著上升，5d后滤纸的分解率呈现缓慢上升趋势，在第15d达到了最高，分解率为81.8％，由以上结果可以看出，本试验筛选的秸秆腐熟细菌都具有较强的滤纸酵解效果。

3.6.2低温高效酵解秸秆细菌与em菌配合酵解秸秆试验

在低温条件下，采用低温高效酵解秸秆细菌bacillusamyloliquefaciens-c4与em菌配合进行水稻秸秆的酵解试验，在30d的时候，两种处理中，秸秆出现了失重和变黑现象，但是在添加了低温高效酵解秸秆细菌组合中，秸秆失重和变黑的程度更大，测定水稻秸秆的失重率，添加了低温高效酵解秸秆细菌组合的失重率为61％，而只用em菌发酵液的处理，秸秆的失重率为41％，说明将低温高效酵解秸秆细菌bacillusamyloliquefaciens-c4与em菌配合使用，秸秆酵解效率提高了48.8％，并且在秸秆腐熟过程中添加了低温高效酵解秸秆细菌，发酵30d时，秸秆腐烂的程度较好，更易于破碎。