一种农杆菌介导的米曲霉PyrG营养缺陷型突变体构建的制作方法

本发明涉及分子生物学技术领域，进一步涉及米曲霉转基因体系构建技术，具体涉及到一种由农杆菌介导的米曲霉pyrg营养缺陷型突变体构建，为米曲霉转基因奠定基础。

背景技术

米曲霉作为食品安全级的真菌不仅在传统食品发酵、调味品和酿造等行业中具有十分悠久的应用历史，而且在诸如酶制剂、重组蛋白等现代生物技术产业中应用也日益广泛。米曲霉基因组在2005年已经测序完成，但是其遗传操作相对其他丝状真菌来说比较复杂，使得米曲霉功能基因研究进展缓慢。

对于米曲霉的遗传操作，筛选标记是首要考虑的问题。选择一个合适的筛选标记一方面决定了转基因能否进行，另一方面能够最大限度减少假阳性的概率，使筛选工作量最小化。但是由于米曲霉对g418、潮霉素、寡霉素、博来霉素、腐草霉素、卡那霉素等常用的抗性药物均不敏感，使得米曲霉转化筛选标记主要依赖于营养缺陷型。米曲霉常用于真菌转化的营养缺陷型标记基因有来自真菌的编码乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶pyrg基因；该基因在米曲霉中存在时可以将非毒性的5-氟乳清酸(5-foa)转化为有毒的5-氟尿嘧啶，从而抑制米曲霉的生长；而该基因敲除时则只能在外源提供uridine/uracil的培养基中生长，因此可以通过5-foa来筛选pyrg突变体，然后可以通过以uridine/uracil营养缺陷型作为筛选标记进行遗传转化。目前，筛选米曲霉pyrg突变体主要依赖于诱变，然后在含有uridine/uracil和5-foa的培养基中筛选，而利用转基因敲除主要是依赖于原生质体介导的转基因技术，转化效率低，操作复杂，导致获得营养缺陷型突变体难度大。本发明通过农杆菌介导的转基因技术敲除米曲霉pyrg基因，成功率高，操作简单。

技术实现要素：

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种米曲霉pyrg营养缺陷型突变体构建方法，以解决现有技术中针对米曲霉pyrg营养缺陷型难以获得的问题。

本发明要解决的另一个问题是，常规以原生质体介导的米曲霉转基因来敲除pyrg基因构建营养缺陷型突变体其工作量较大、转化效率较低。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

农杆菌介导米曲霉pyrg营养缺陷型突变体构建方法，包括以下步骤：

1)以米曲霉3.042基因组dna为模板，以序列为seqidno:1、seqidno:2的dna片段为引物执行pcr扩增获得上游片段；以序列为seqidno:2、seqidno:3的dna片段为引物执行pcr扩增获得下游片段；以上两种pcr产物为模板，以序列为seqidno:1、seqidno:4的dna片段为引物执行，pcr将pyrg基因基因上下游拼接到一起；将拼接好的上下游片段连接t载体，测序验证；验证正确后的t载体，通过酶切位点ecorⅰ和speⅰ将拼接好的片段连接双元载体pgreenⅱ，构建好的载体命名为pyrg-pgreenⅱ；将pyrg-pgreenⅱ转化农杆菌agl1。

2)米曲霉(3.042)孢子接种于pda或者dpy培养基培养3天，收集孢子。孢子过滤，然后4000rpm离心10min，蒸馏水洗2次，调整浓度至：1*10⁶个/ml，备用。

3)将步骤1)转化后的农杆菌agl1接种于10ml同时具有卡娜和利福平抗性的lb液体培养基中，以28℃的温度、200rmp的转速转摇瓶培养；取1ml培养液加9mlim液体培养基混合，而后液置于28℃的问题，200rmp的转速，摇瓶培养6小时，得到菌液；

4)取100μl步骤3)所得的菌液和100μl步骤2)所得的孢子悬液(浓度约为1*10⁶个/ml)混匀共涂到铺有玻璃纸im固体培养基上，于22℃，避光培养60小时；

5)将玻璃纸转移至筛选培养ⅰ，然后玻璃纸覆盖一层筛选培养基ⅱ，30℃培养5-7天；挑取生长出培养基的菌斑至新的筛选培养基ⅱ和cd培养基；正常米曲霉在cd培养基上可以生长而在筛选培养基不能生长，而pyrg营养缺陷型在cd培养基生长不能生长只能在筛选培养基上生长。

6)挑取在筛选培养基可以生长而在正常cd培养基不能生长的转化子，与cd+ura/uri培养基培养，提取dna，以序列为seqidno:5、seqidno:6的dna片段为引物执行和seqidno:5、seqidno:7的dna片段为引物执行扩增，检测orf是否成功敲除。

作为优选，步骤1)上游和下游序列片段大小为1500bp；

作为优选，步骤1)中融合片段酶切产物与pgreenⅱ通过infusion方式进行连接的；

作为优选，步骤3)所述im液体培养基是通过以下方法配制的：40mmmes，5mm葡萄糖，0.5％(w/v)甘油和200μm乙酰丁香酮溶于mm盐溶液。

作为优选，每1l所述mm盐溶液含有以下成分：k2hpo42.05g，kh2po41.45g，nacl0.15g，mgso4·7h2o0.5g，cacl2·6h2o0.1g，(nh4)2so40.5g，feso4·7h2o0.0025g。

作为优选，步骤3)中，所述1ml该培养液与9mlim液体培养基混合之后，其od600值为0.2～0.3。

作为优选，步骤3)中，所述摇瓶培养6h之后，其中od600值为0.6～0.8。

作为优选，步骤5)中，所述筛选培养基ⅰ配方为：cd培养基+cefotaxime(300μg/ml)+ura/uri(0.5％)+5-foa(2mg/l)，所述筛选培养基ⅱ配方为：cd培养基+ura/uri(0.5％)+5-foa(2mg/l)。

作为优选，步骤6)中，所述orf特异性引物的序列分别如seqidno:5、seqidno:6所示，检测orf敲除特异性引物序列分别如seqidno:7、seqidno:8所示.

本发明的有益效果：

本发明首次建立了农杆菌介导的米曲霉pyrg营养缺陷型米曲霉构建方法，较原来的诱变和原生质体介导的转基因体系减少工作量，提高了转化效率，为米曲霉遗传操作奠定了基础。

附图说明

图1pyrg-pgreenⅱ载体构建过程的原理及引物所在位置示意图；

图2米曲霉3.042对5-foa敏感性分析；

图3筛选培养基生长的转化子；

图4转化子在不同培养基培养生长和dna验证。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。

以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。

除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

实施例1

1、载体构建：①在米曲霉3.042基因组信息中找到pyrg基因及基因上下游序列seqidno8；②以引物p1(gaattccaactatgatagtttggtaatac)和p2(tggcgatggaggggtagcgttggcgatggaggggtagc)扩增pyrg基因上游序列；③以引物p3(cccctccatcgccaacgtagtggtggatacgtactcc)和p4(actagtagccttgtaaggtgatgtgtgccagg)扩增pyrg基因下游序列；④以上两种pcr产物为模板，用p1和p4引物，pcr将pyrg基因基因上下游拼接到一起连接t载体，测序验证；⑤通过酶切位点ecorⅰ和speⅰ将拼接好的片段连接双元载体pgreenⅱ，构建好的载体命名为pyrg-pgreenⅱ；⑥将pyrg-pgreenⅱ转化农杆菌agl1(以上引物序列加粗部分为酶切位点，用于将拼接后的片段连接目的载体；划线部分为上下游片段同源部分，用于拼接上下游片段)。

2、米曲霉3.0425-foa敏感性检测：pyrg基因编码乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶(omp)，该酶是尿嘧啶核苷酸合成途径中一种关键酶，缺失后不能在尿嘧啶(ura)缺陷的培养基生长。另外，omp能催化5-氟乳清酸(5-foa)转化为5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)，5-fluorouracil对细胞生长是有害的，可以抑制真菌细胞生长。因此，首先检测了米曲霉3.042对5-foa敏感性，发现野生型米曲霉3.42不能在含有5-foa的培养基中生长，因此5-foa可以用于筛选pyrg-敲除菌株。

3、米曲霉(3.042)孢子准备：米曲霉(3.042)孢子接种于pda或者dpy培养基培养3天，收集孢子。孢子过滤，然后4000rpm离心10min，蒸馏水洗2次，调整浓度至：1*10⁶个/ml，备用。

4、农杆菌菌液准备：①将转化含有pyrg-pgreenⅱ质粒的农杆菌接种于10mllb(含卡娜和利福平抗性)，28℃，200转，摇菌过夜；②取1ml培养液加9mlim液体培养基[40mmmes，5mm葡萄糖，0.5％(w/v)甘油和200μm乙酰丁香酮溶于mm盐溶液；mm盐溶液配方为(g/l)：k2hpo4,2.05g；kh2po4,1.45g；nacl,0.15g；mgso4.7h2o,0.5g；cacl2.6h2o,0.1g；(nh4)2so4,0.5g；feso4.7h2o,0.0025g]，od600为0.2至0.3；③混合液置于28℃，200转，摇菌6小时至od600为0.6至0.8。

5、共培养：取100μl菌液和100μl的孢子悬液(浓度约为1*10⁶个/ml)涂到im固体培养基上(预先铺玻璃纸)。培养皿置于22℃，暗培养60小时。

6、转化子筛选：①将玻璃纸转移至筛选培养[cd培养基+cefotaxime(300μg/ml)+ura/uri(0.5％)+5-foa(2mg/l)]，然后玻璃纸覆盖一层筛选培养基，30℃培养5-7天；②挑取生长出培养基的菌斑至新的筛选培养基[cd培养基+ura/uri(0.5％)+5-foa(2mg/l)]和cd培养基生长，正常米曲霉在cd培养基上可以生长而在筛选培养基不能生长，而pyrg营养缺陷型在cd培养基生长不能生长只能在筛选培养基上生长。

7、pyrg营养缺陷型鉴定：

提取在筛选培养基可以生长和cd培养不能生长的转化子dna，通过引物对seqidno:5和seqidno:6；seqidno:5和seqidno:7验证其pyrg基因是否敲除(敲除后的扩增片段比野生型小800bp)。

序列表

<110>江西科技师范大学

<120>一种农杆菌介导的米曲霉pyrg营养缺陷型突变体构建

<130>2018

<160>8

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