一株生产松刚霉素主份——灰黄霉素的菌株及方法与流程

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一株生产松刚霉素主份——灰黄霉素的菌株及方法。

背景技术

灰黄霉素作为一类医农两用的抗生素，最早为国外厂商开发的第一代抗皮肤真菌病药物，在20世纪60年代上市，曾被国际药学界誉为是对付真菌病的一大里程碑重大药物。随着生物技术及生物信息学的不断进步，灰黄霉素的应用范围也不断扩大，其中最为让人瞩目方面在抗癌药和农业的应用开发方面，其为灰黄霉素的市场拓展开辟了新途径。经过几十年的长足发展，我国现已成为灰黄霉素原料药的唯一生产国，总产能已扩大至1000吨左右。

灰黄霉素农用化使其作为生物农药成为可能，利用生物藕合技术，对灰黄霉素基团进行藕合修饰，使其具备更好的抗植物真菌病原的能力和水溶性，研制出新型抗真菌生物农药——松刚霉素，为进一步开拓灰黄霉素市场提供了广阔的空间。

目前国内采用液体深层发酵模式生产的灰黄霉素，其工业化大生产的发酵水平多年来都维持在25000μg/ml左右，糖素的转化率较低，而且在发酵周期超过240h，发酵过程中存在一段明显的停滞期，发酵效率来说还是偏低，致使发酵成本处于高位，农业推广应用受到限制。如何进一步获得高产灰黄霉素的菌株及开发高效的灰黄霉素发酵工艺，对于灰黄霉素的应用及以灰黄霉素为主效成分的生物农药——松刚霉素的开发具有重大意义。

技术实现要素：

为了有效解决上述技术问题，本发明的目的是提供一株生产松刚霉素主份——灰黄霉素的菌株及方法。

第一方面，本发明要求保护一株灰黄青霉(penicilliumgriseofulvum)fa868。

本发明所提供的灰黄青霉(penicilliumgriseofulvum)fa868，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为cctccno：m2018186。

该菌株为自行从土壤中分离获得的产灰黄霉素的出发菌株f3215(cctccno：m2018188)通过紫外线加氯化锂诱变获得的变株fh1816，再经常压室温等离子体(artp)+licl(1.0％，质量百分比，下同)作为复合诱变剂进行高产菌株的定向诱变而得。该优良菌株能够高效积累灰黄霉素，而且发酵周期较现有发酵菌种明显缩短，发酵原料来源广泛，而且无氯灰黄霉素组分含量少。

第二方面，本发明要求保护一种菌剂。

本发明所提供的菌剂的活性成分为前文所述的灰黄青霉(penicilliumgriseofulvum)fa868。

第三方面，本发明要求保护前文所述的灰黄青霉(penicilliumgriseofulvum)fa868或所述菌剂在如下任一中的应用：

(a1)生产灰黄霉素；

(a2)制备松刚霉素。

第四方面，本发明要求保护一种生产灰黄霉素的方法。

本发明所提供的生产灰黄霉素的方法，可包括如下步骤：发酵培养前文所述的灰黄青霉(penicilliumgriseofulvum)fa868，从发酵产物中获得灰黄霉素。

进一步地，对所述灰黄青霉(penicilliumgriseofulvum)fa868进行发酵培养采用的发酵培养基中的碳源为大米粉。对所述灰黄青霉(penicilliumgriseofulvum)fa868进行发酵培养采用的发酵培养基中的无有机氮源。对所述灰黄青霉(penicilliumgriseofulvum)fa868进行发酵培养采用的发酵培养基中的氯化物浓度为15-22g/l(如18g/l)。其中，所述氯化物为氯化钠和氯化钾的总和。

更进一步地，所述发酵培养基的组成具体如下：每100ml所述发酵培养基中含有大米粉15.0g，kh2po40.6g，feso4.7h2o0.1g，kcl0.8g，nacl1.0g，(nh4)2so40.5g，caco30.3g，mgso40.1g，余量为水；ph6.0-6.5。

第五方面，本发明要求保护一种用于生产灰黄霉素的试剂盒。

本发明所提供的用于生产灰黄霉素的试剂盒，含有如下(b1)或(b2)：

(b1)前文所述的灰黄青霉(penicilliumgriseofulvum)fa868和所述的发酵培养基；

(b2)前文所述的菌剂和所述的发酵培养基。

第三方面，前文所述的方法或试剂盒在制备松刚霉素中的应用也属于本发明的保护范围。

实验证明，利用本发明所提供的灰黄青霉(penicilliumgriseofulvum)fa868生产灰黄霉素，不用乳糖和玉米桨为主要原料，以大米作为碳、氮源加适量的无机盐的简单种子和发酵配方，即可完成生物合成灰黄霉素的全过程；保持了高耐前体——氯化物的特性，发酵过程中，氯化物总量可达2.0％以上，保证了去氯灰黄霉素含量在0.2％以下。本发明为开发作为抗真菌生物农药——松刚霉素提供可靠的原料来源。

保藏说明

菌种名称：灰黄青霉

拉丁名：penicilliumgriseofulvum

菌株编号：fa868

保藏机构：中国典型培养物保藏中心

保藏机构简称：cctcc

地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内武汉大学保藏中心

保藏日期：2018年4月10日

保藏中心保藏编号：cctccno：m2018186

菌种名称：灰黄青霉

拉丁名：penicilliumgriseofulvum

菌株编号：fh1816

保藏机构：中国典型培养物保藏中心

保藏机构简称：cctcc

地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内武汉大学保藏中心

保藏日期：2018年4月10日

保藏中心保藏编号：cctccno：m2018187

菌种名称：灰黄青霉

拉丁名：penicilliumgriseofulvum

菌株编号：f3215

保藏机构：中国典型培养物保藏中心

保藏机构简称：cctcc

地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内武汉大学保藏中心

保藏日期：2018年4月10日

保藏中心保藏编号：cctccno：m2018188

附图说明

图1为松刚霉素对尖孢镰刀菌fjat-3007(a)和fjat-3071(b)的抑菌效果。a为松刚霉素对尖孢镰刀菌fjat-3007的抑菌效果；b为松刚霉素对尖孢镰刀菌fjat-3071的抑菌效果。图中1、2、3和4分别表示松刚霉素浓度为0、4、8和16×10^-6mm。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、高产灰黄霉素菌株fa868的选育

一、灰黄霉素产生菌f3215的筛选

1、土样样品的采集及青霉菌初筛

(1)土样采集

一般在有机质较多的肥沃土壤中，微生物的数量最多，中性偏碱的土壤以细菌和放线菌为主，酸性红土壤及森林土壤中霉菌较多，果园、菜园和野果生长区等富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多。

用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5-15cm处的土样10-15g，装入事先准准备好的灭菌的空试管中，用棉塞封口，再用牛皮纸封存。北方土壤干燥，在10-20cm处取样。给塑料袋编号并记录地点、土壤土质、时间及环境条件。

一般样品取回后马上分离，以免微生物死亡。但有时样品较多，而且外地取样，路途遥远，难以做到及时分离，则采先用选择性培养基做好试管斜面，随身携带。到一处将取好的土样混匀，取3-4g撒到选择性培养基试管斜面上，这样避免菌株因不能及时分离而死亡。

所以，根据我们的选择目标，从我国十五省、市、自治区采集不同类型土壤，不同类型土壤中，采集了森林土、菜地土及果园土为主的土样共计3515份。

(2)菌株的选择性分离与产灰黄霉素菌株的初筛

为了容易分离到所需的青霉菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，通过配制霉菌的选择性培养基——察氏培养基，制备察氏培养基平板，通过梯度稀释的方法对不同的土样进行平板培养，培养温度设定为28℃。获得营养菌丝体色素为棕褐色的以青霉为主的真菌菌株共1536株。

其中，所述的察氏培养基配方为(％)：硝酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.1g，硫酸镁(mgso4·7h2o)0.05g，氯化钾0.05g，硫酸亚铁0.001g，蔗糖3.0g，琼脂粉2.0g，蒸馏水100ml，ph为6.0，121℃灭菌20min，备用。

进一步的，对初步分离培养获得的1536株的青霉菌菌株再次采用察氏培养基平板进行稀释分离纯化，确保获得的菌株为纯种菌株。稀释分离初花的方法为：将初步获得的菌株分别接种察氏培养基斜面，28℃培养96h，然后在培养好的斜面分别加入5ml灭菌的生理盐水，洗脱，制备孢子悬液，取孢子悬液进行梯度稀释，并将梯度稀释的孢子悬液进行平板培养，至纯菌落出现。

根据灰黄霉素的抑菌特性，选择具有代表性的拮抗菌株：石膏样毛癣菌、石膏样小孢子菌和絮状癣菌对分离纯化后的1536株菌株采用固体移块法进行拮抗性分析和检测，结果表明对这三种菌中的一种、两种或三种有拮抗作用的菌株共153株。

2、灰黄霉素产生菌的复筛及菌株鉴定

(1)灰黄霉素产生菌的复筛及菌株确定

对上述获初筛获得的153株拮抗性菌株采用摇瓶发酵培养基进行摇瓶发酵复筛，测定发酵生物量及发酵液紫外吸收峰效价，采用纸片法和杯蝶法对发酵样品进行石膏样毛癣菌、石膏样小孢子菌和絮状癣菌的拮抗性测定，获得生物量大，而且对这三种检菌豆油明显拮抗作用且发酵液在289-292nm有明显吸收峰的菌株5株。具体结果见表1。

其中，所述的摇瓶发酵培养基包括：大米粉3.0g，乳糖1.0g，硫酸胺0.5g，氯化钾0.2g，氯化钠0.1g，磷酸二氢钾0.55g，硫酸镁0.05g，碳酸钙0.18g，自来水100ml，氢氧化钠调节ph为6.5，121℃灭菌20min。

所述的纸片法和杯蝶法的检测可参考文献：“纸片法快速测定庆大霉素发酵液生物效价[j].《药物生物技术》,2004,11(3):187-189”。

表1五株菌的摇瓶发酵液拮抗性能及紫外吸收峰

结果显示，编号f3215的菌株对这三种检菌的活性最高，而且生物量也是最大的。为进一步的确认f3215所产的抗菌物质为灰黄霉素，我们将其与灰黄霉素产生菌cicc4015(penicilliumurticaecicc4015，来自于中国工业微生物菌种保藏管理中心，www.china-cicc.org，菌株保藏编号为cicc4015)的发酵产物进行对比，并且以灰黄霉素标准品(卫生部药品生物制品检定所)为对照一起进行hplc检测。结果确认，菌株f3215具有与灰黄霉素产生菌cicc4015抗菌谱类似，具有产类似抗菌物质的能力(表2)，而且hplc检测结果显示，菌株f3215与菌株cicc4015均有与灰黄霉素标准品出峰时间一致的物质，进一步确认了菌株f3215是一株能够产灰黄霉素的野生型菌株。

表2f3215与cicc4015的抗菌谱比较(直径为mm)

所述的灰黄霉素hplc的检测方法参照：“hplc法测定灰黄霉素含量的研究[j].《中国药学杂志》，1990，25(6)：343-345”。

(2)菌株f3215的鉴定与保藏

形态鉴定：菌落形态——在pda固体培养基平板上28℃培养96h，菌落表面平滑疏松，菌落质地呈绒毛状，边缘全缘，菌落颜色呈龟背灰绿色。

显微形态显示：菌丝多且高度分支，分枝成帚状的分生孢子从菌丝体伸向空中，各顶端的小梗产生链状的分生孢子，分生孢子呈现近球形或宽椭圆形。结合《真菌鉴定手册》及菌落形态及显微形状与青霉属真菌相同，特别与灰黄青霉(penicilliumgriseofulvum)极为相似。

分子鉴定：采用真菌18s核糖体的通用引物its1和its4(生工生物工程(上海)股份有限公司)对菌株f3215的rdna基因的its序列进行pcr扩增，获得扩增长度约为580bp的基因片段，将获得的基因片段测定，测定结果显示其大小为585bp，具体序列如seqidno.1所示。将该序列登录ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行序列比对(blast)，结果显示与其亲缘关系最近的菌株为penicilliumgriseofulvumf-wy-12-08(灰黄青霉f-wy-12-08)。

将编号为f3215的菌株命名灰黄青霉(penicilliumgriseofulvum)f3215，并进行斜面保存及甘油保种。灰黄青霉(penicilliumgriseofulvum)f3215已于2018年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为cctccno：m2018188。

二、灰黄霉素菌株fh1816的选育

在上述获得能够产生灰黄霉素的菌株f3215的基础上，采用原生质体诱变的手段进一步提高灰黄霉素产量，同时生长速度快且遗传稳定的优良菌株。

1、菌株f3215原生质体的制备

将实施例1筛选获得的灰黄霉素菌株f3215的甘油菌接种至察氏培养基斜面，28℃培养3天后，用无菌生理盐水将斜面孢子洗脱，并使用无菌滤纸过滤所述洗脱液得到孢子悬液，并按10％接种量转接于察氏液体培养基培养(察氏培养基斜面组分包括：硝酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.1g，硫酸镁(mgso4·7h2o)0.05g，氯化钾0.05g，硫酸亚铁0.001g，蔗糖3.0g，琼脂粉2.0g，蒸馏水100ml，ph为6.0，121℃灭菌20min，若需液体培养基，则无需添加琼脂粉)，250ml的三角瓶内装液量为30ml，内含10粒玻璃珠，于恒温振荡器28℃，250rpm，培养36h，培养结束后，获得液体培养物，10000rpm离心10min收集菌丝体，并用无菌生理盐水洗涤二次，离心、无菌滤纸吸干水分，最后收集的菌丝体。

以上述制备的菌丝体为原料，以浓度为171.0g/l的蔗糖溶液为渗透压稳定剂，采用溶壁酶(广东微生物菌种保藏中心产品)和纤维素酶(上海生工产品)混合的酶解液，破壁条件为：溶壁酶酶解液使用浓度为0.5％-1.5％，最佳酶解浓度为1.2％(％表示g/100ml)，纤维素酶的使用浓度为0.5％-1.5％的最佳浓度为0.5％(％表示g/100ml)，酶解温度范围为25-37℃，最佳酶解温度为30℃，酶解时间为2-8h，最佳酶解时间为4.5h，酶解ph为5.0-7.0，最佳酶解ph为6.2，原生质体浓度达到1×10⁷个/ml。此即为灰黄青霉菌株f3215原生质体制备的最佳条件，制备原生质体的效率最高(显微观察显示菌丝体基本全部形成原生质体)，原生质体的再生率也较好(再生率＝再生菌落数/原生质体总数×100％)，达到40％。采用171.0g/l的蔗糖溶液重悬原生质体细胞，制备灰黄青霉菌株f3215原生质体悬液。

2、原生质体的诱变与筛选

预实验：选择诱变处理时间，方法如下：

取1ml的上述制备的原生质体悬液，于9cm的灭菌平皿中，并置于磁力搅拌器上，低速搅拌(30rpm)，距离15w的紫外灯15cm处，分别照射0(对照)、10、20、30、40、50、60s，辐射后将原生质体悬液稀释并涂布于含有1.0％(％表示g/100ml)氯化锂的再生培养基平板上(再生培养基包括：硝酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.1g，硫酸镁(mgso4·7h2o)0.05g，氯化钾0.05g，硫酸亚铁0.001g，蔗糖20.1g，琼脂粉2.0g，蒸馏水100ml，ph为6.0，121℃灭菌20min)，28℃培养3-4天后对平板菌落进行计数，计算致死率，致死率计算方法如下所示：

致死率％＝(未经诱变处理菌落数-经诱变处理菌落数)/未经诱变菌落数×100％

通过统计各处理组的致死率，选择致死率为75-85％的照射处理时间进行正式实验，处理时间为30s。

正式实验：根据预实验的结果进行，方法如下：

取1ml的上述制备的原生质体悬液，装于9cm的无菌平皿中，并置于磁力搅拌器上，低速搅拌(30rpm)，距离15w的紫外灯15cm处，照射30s。处理完毕后，将原生质体悬液稀释并涂布于含有1.0％(％表示g/100ml)氯化锂的再生培养基平板上，28℃培养3-4天。待长出单菌落，备进行筛选。

初筛：选取上述平板上的生长快速的突变菌株1500株，接种到装有1ml察氏液体培养基的96孔微孔板振荡培养，培养温度为28℃，转速为250rpm，培养3天，离心收集菌丝体，检测菌丝体中灰黄霉素效价。

选取的1500株突变菌株中，其中灰黄霉素效价提高的正突变菌株有356株，灰黄霉素含量降低的负突变菌株为1144株。与出发菌株相比，正突变菌株中的341株的灰黄霉素效价提高幅度为150％-500％，15株的灰黄霉素效价提高幅度为500％以上。

复筛：收集初筛菌株中灰黄霉素效价明显提高的正突变菌株(15株)，继续进行摇瓶发酵复筛，250ml摇瓶，装液量30ml，培养条件为28℃，250rpm，培养3天，收集菌丝体，检测其生物量(菌丝体湿重)、灰黄霉素效价。

选取灰黄霉素效价最高，且生物量较好的菌株作为下一轮诱变的出发菌株，继续采用上述步骤和方法进行选育，共进行15代的诱变育种。

最终获得的正突变菌株中，其中1株菌(即编号fh1816的菌株)的菌落形态及及产量较原始菌株都发生明显的变异。形态方面：在察氏培养基斜面中，孢子由龟背灰绿色变为纯白色，菌落表面由松散变紧密，孢子量由多变少，单菌落也较原始菌株小。显微形态显示菌株fh1816较原始菌株f3215菌丝细，而且分支较少，18srrna的序列测定显示，其序列较原始菌株f3215的相似性达99％，都属于灰黄青霉菌株。产量方面：变株fh1816灰黄霉素摇瓶发酵效价最高达到18500μg/ml，较原始菌株f3215提高37倍。将编号fh1816的菌株命名为灰黄青霉菌fh1816，进行斜面保存及甘油保种。

3、优良变株的遗传稳定性检测及保藏

菌株保藏：灰黄青霉菌(penicilliumgriseofulvum)fh1816于2018年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为cctccno：m2018187。

灰黄青霉fh1816的遗传稳定性：将灰黄青霉fh1816进行传代培养以考察其遗传稳定性，每3天传代一次，传代15代，每隔一代进行摇瓶发酵测定菌株的生物量及灰黄霉素效价，结果显示灰黄青霉fh1816传代过程中发酵灰黄霉素效价无明显变化，具有良好的遗传稳定性。

三、高产灰黄霉素菌株fa868的选育

以上述获得的灰黄青霉菌(penicilliumgriseofulvum)fh1816为出发菌株，采用常压室温等离子体(artp)+licl(1.0％，质量百分比，下同)作为复合诱变剂进行高产菌株的定向诱变育种。

1、artp诱变致死率的确定

取培养好灰黄霉素产生菌fh1816首先制备斜面(18×180mm)，然后在斜面中加入5ml无菌水，刮下孢子制成孢子悬液，全部移入灭过菌的带玻璃株的100ml小三角瓶中，打散孢子，制成单孢子悬液，孢子个数约为1.0×10⁷个/ml，artp分别诱变60、90、120、150s，诱变后再涂布于含有1.0％licl的平板上，未诱变的菌悬液作为对照，28℃恒温培养7d。用平板计数法计算不同诱变时间对孢子致死率。

表3诱变时间对致死率影响

表3结果显示：诱变120-150s致死率约为85-95％，根据诱变育种要求，选择致死率在85％-95％，其诱变率较高，故而选择150s处理时间为最佳诱变处理时间。

2、artp的诱变处理及筛选

采用上述方法对出发菌株fh1816的孢子悬液进行artp诱变，处理时间为150s，并采用大米孢子进行固体发酵培养进行初筛。

(1)出发菌株孢子悬液的制备

将出发菌株灰黄霉素菌株fh1816的甘油菌接种至察氏培养基斜面，28℃培养3天后，用无菌生理盐水将斜面孢子洗脱，并使用无菌滤纸过滤所述洗脱液得到孢子悬液。

所述的察氏培养基斜面组分包括：硝酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.1g，硫酸镁(mgso4·7h2o)0.05g，氯化钾0.05g，硫酸亚铁0.001g，蔗糖3.0g，琼脂粉2.0g，蒸馏水100ml，ph为6.0，121℃灭菌20min，若需液体培养基，则无需添加琼脂粉。

(2)灰黄霉素产生菌fh1816常压室温等离子体(artp)诱变

取10μl的上述制备的孢子悬液，均匀涂布在金属载片的上表面，干燥后用镊子将载片转移至载物台。采用高纯氦气作为等离子体的工作气体处理菌物载片，设置电源功率80w，照射距离4mm，等离子体的温度26-30℃，气流量10l/min，处理时间为20s。样品处理完毕后，用无菌镊子将载片放至装有800μl察氏液体培养基的ep管中，形成新的菌悬液。并每100μl涂布至含有1.0％licl的平板上，28℃避光培养至有单菌落长出。

(3)诱变菌株的初筛

为了高效的检测诱变菌株的效价，直接采用固体培养的方式检测诱变菌株的产抗性能。挑取不同的单菌落分别接种察氏斜面培养基培养7d后，制备孢子悬液转接入大米培养基中28℃培养，周期14天。培养结束，以出发菌株fh1816为对照，直接取固体培养物进行灰黄霉素效价测定。

所述的大米孢子的制备包括：称取市售大米10g，加入90ml营养液(配方：单位g/100ml，蔗糖5.0，kcl0.4，kh2po40.05，mgso40.05，nano30.2，feso40.001，ph自然)，隔水煮沸45分钟，取出放凉后，称取20g煮熟后的大米培养基装入茄子瓶(20g大米培养基/瓶)，扎口，121℃灭菌30分钟。

结果显示：选取的759株突变菌株中，其中灰黄霉素效价提高的正突变菌株有89株，正突变率为11.7％。与出发菌株fh1816相比，正突变菌株中的78株的灰黄霉素效价提高幅度为150％-500％，11株的灰黄霉素效价提高幅度为500％以上，占正突变株的12.4％。

(4)摇瓶发酵复筛

收集大米孢子固体培养初筛菌株中灰黄霉素效价明显提高的正突变菌株(11株)，继续进行摇瓶发酵复筛，250ml摇瓶，装液量30ml，培养条件为28℃，250rpm，培养3天，收集菌丝体，检测其生物量(菌丝体湿重)、灰黄霉素效价。

对初筛的大米孢效价在50000μg/ml的11株菌株进行摇瓶发酵复筛，挑诱变单菌落的斜面菌种接到种子摇瓶培养2d后，按10％移种量移到发酵摇瓶，28℃，220r/min恒温振荡培养10天，测定灰黄霉素效价，并以出发菌株fh1816为对照。

表4诱变菌种的摇瓶复筛

结果显示：fh1-55、fh1-63和fh1-86三株诱变株的效价最高，较对照菌株分别提高12.4％，13.0％和11.1％，选取效价较高的三株菌进行保存和进一步的细胞融合选育。

3、变株fa868的获得

(1)原生质体的制备

将上述复筛获得的效价较高三株灰黄霉素菌株fh1-55、fh1-63和fh1-86的菌株接种至察氏培养基斜面，28℃培养3天后，用无菌生理盐水将斜面孢子洗脱，并使用无菌滤纸过滤所述洗脱液得到孢子悬液，并按10％接种量转接于察氏液体培养基培养(察氏培养基斜面组分包括：硝酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.1g，硫酸镁(mgso4·7h2o)0.05g，氯化钾0.05g，硫酸亚铁0.001g，蔗糖3.0g，琼脂粉2.0g，蒸馏水100ml，ph为6.0，121℃灭菌20min，若需液体培养基，则无需添加琼脂粉)，250ml的三角瓶内装液量为30ml，内含10粒玻璃珠，于恒温振荡器28℃，250rpm，培养36h，培养结束后，获得液体培养物，10000rpm离心10min收集菌丝体，并用无菌生理盐水洗涤二次，离心、无菌滤纸吸干水分，最后收集的菌丝体。

以上述制备的菌丝体为原料，以浓度为171.0g/l的蔗糖溶液为渗透压稳定剂，采用溶壁酶(广东微生物菌种保藏中心产品)和纤维素酶(上海生工产品)混合的酶解液，破壁条件为：溶壁酶酶解液使用浓度为0.5％-1.5％，最佳酶解浓度为1.2％，纤维素酶的使用浓度为0.5％-1.5％，最佳浓度为0.5％，酶解温度范围为25-37℃，最佳酶解温度为30℃，酶解时间为2-8h，最佳酶解时间为4.5h，酶解ph为5.0-7.0，最佳酶解ph为6.2，原生质体浓度达到1×10⁷个/ml。此即为灰黄青霉菌株fh1-55、fh1-63和fh1-86的原生质体制备的最佳条件，制备原生质体的效率最高(显微观察显示菌丝体基本全部形成原生质体)，原生质体的再生率也较好(再生率＝再生菌落数/原生质体总数×100％)，达到40％。采用171.0g/l的蔗糖溶液重悬原生质体细胞，制备灰黄青霉菌株fh1-55、fh1-63和fh1-86原生质体悬液。

(2)原生质体的融合

首先，进行原生质体的灭活条件的确定。灰黄青霉菌株fh1-55、fh1-63和fh1-86原生质体的灭活条件为紫外照射。取300μl原生质体，均匀涂布于再生培养基上(再生培养基包括：硝酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.1g，硫酸镁(mgso4·7h2o)0.05g，氯化钾0.05g，硫酸亚铁0.001g，蔗糖20.1g，琼脂粉2.0g，蒸馏水100ml，ph为6.0，121℃灭菌20min)，距离30w紫外灯下5-10cm处开盖，避免白光干扰条件下垂直照射5-10min进行紫外灭活，其最佳灭活条件为：距离紫外灯10cm处，照射10min，其灭活率达到100％。

然后，进行灭活原生质体的融合与再生，以0.05mol/l氯化钙溶液配制的35％聚乙二醇(peg-6000)溶液为促融剂，分别取灭活的灰黄青霉菌株fh1-55、fh1-63和fh1-86原生质体各500μl混合并离心，加入1ml促融剂重悬，并在30℃水浴中预热5min后，再迅速置于35℃水浴摇床中，60转/分钟，振荡融合30min。细胞融合结束之后，2000r/min，4℃离心10min，弃上清液，再用0.6mol/lkcl渗稳剂洗涤三次，去除peg。将得到的原生质体沉淀用0.6mol/lkcl渗透压稳定剂稳剂稀释至10⁵个/ml浓度，取其稀释液涂布于再生培养基上，置于28℃恒温培养箱中，避光培养，长出的即为再生融合菌落。

(3)融合菌株的筛选

根据上述方法，采用同样的大米孢子和摇瓶复筛的方法进行融合菌株的筛选。

筛选获得一株灰黄霉素高产菌株，其菌落形态、孢子颜色及菌丝显微形态都与fh1816基本一致，其18srdna序列也同fh1816一致，都属于灰黄青霉菌，编号fa868，其摇瓶发酵的的灰黄霉素效价为24523.5μg/ml，较原始出发菌株fh1816提高35.9％，较灰黄青霉菌株fh1-55、fh1-63和fh1-86分别提高20.9％、20.2％和22.3％。

(4)变株fa868的遗传稳定性

变株fa868经斜面连续进行传代10代，并对第1、3、6、9、10代进行了摇瓶发酵培养，并以原始出发菌株fh1816为对照，测定效价，结果如表5。

表5变株fa868遗传稳定性

结果显示：灰黄青霉fa868传代过程中灰黄霉素效价无明显变化，显示良好的遗传稳定性。

(5)变株fa868的保藏

灰黄青霉(penicilliumgriseofulvum)fa868于2018年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为cctccno：m2018186。

实施例2、变株fa-868的发酵应用及特性

1、不同碳源对变株fa868发酵的影响

在菌株fh1816的基础上，进一步比较不同碳源对变株fa868发酵水平的影响，进行了乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖浆、小麦粉、玉米粉及大米粉等七种碳源的单因素比较试验，并以原始菌株f3215为对比，结果如表6。

表6不同碳源对变株fh1816灰黄霉素发酵效价的影响

结果显示：变株fa868同样在在这几种氮源中生长并发酵生产灰黄霉素，但以乳糖为碳源，在七种碳源中发酵单位最低，其发酵单位的顺序是大米粉>玉米粉>小麦粉>葡萄糖>蔗糖>麦芽糖浆>乳糖。可见变株fa868仍保持着菌株fh1816不以乳糖为主要碳源，而主要利用大米粉为碳源的发酵特性，而且其具备更好的大米粉利用效率和发酵性能，这点对灰黄霉素的发酵成本而言非常关键。

2、不同氮源对变株fa868发酵的影响

为比较不同氮源对变株fa868发酵水平的影响，进行了添加玉米浆、花生饼粉、酵母膏、蛋白胨和黄豆饼粉五种有机氮源的单因素比较试验，结果列入表7。

表7不同有机氮源对变株fh1816灰黄霉素发酵效价的影响

结果显示：变株fa868在添加五种不同有机氮源的发酵培养基中，玉米浆、黄豆饼粉对生物合成灰黄霉素是不利的。并且整体来说，有机氮的添加对灰黄霉素的效价来说贡献不大，这点较fh1816来说表现的更为突出，鉴于工业化规模发酵的需要及成本原因，变株fa868不需添加有机氮源进行发酵，这对简化原料品种是十分有利的。

3、氯化物浓度对变株fa868灰黄霉素发酵的影响

氯离子(cl^-)作为灰黄霉素生物合成的重要前体之一，对灰黄霉素的合成至关重要，但过高的cl^-对菌体的生长会有一定的抑制，所以非常有必要对其进行添加量的优化。

表8不同氯化物浓度对灰黄霉素发酵效价的影响

注：氯化物浓度以氯化钠或(和)氯化钾之和计，％表示质量百分比，即g/100ml。

结果显示(表8)：突变株fa868经氯化锂处理后，本身具备了一定浓度cl^-的耐受性，这对灰黄霉素的合成来说非常有利。从基础氯化物浓度0.3％提高到2.3％时，其产量可提高36％，而且菌株生长也不受影响，并且当氯化物浓度为1.8％时生物量最高。最终，确认氯化物的添加量为1.8％，其中氯化钠1.0％，氯化锂0.8％。

4、变株fa868优化的发酵配方

整体来说，变株fa868同fh1816具备类似的营养需求，根据上述碳源、氮源及氯的优化工艺，结合菌株的生长及发酵需要，设计多因素多水平的均匀设计优化发酵培养基配方，考察生物量、灰黄霉素效价。

最终，得到优化的变株的配方同fh1816配方一致，其灰黄霉素发酵培养基配方：每100ml发酵培养基中含有大米粉15.0g，kh2po40.6g，feso4.7h2o0.1g，kcl0.8g，nacl1.0g，(nh4)2so40.5g，caco30.3g，mgso40.1g，余量为水，ph6.0-6.5，121℃灭菌20min。

整体来说，变株fa-868仍然保持fh1816的优良发酵特性，主要表现为：

(1)不用乳糖和玉米桨为主要原料，以大米作为碳、氮源加适量的无机盐的简单种子和发酵配方，即可完成生物合成灰黄霉素的全过程。

(2)大米孢子培养基的高效价灰黄霉素，进一步验证了以大米为碳、氮源的发酵特性。

(3)保持了高耐前体——氯化物的特性，发酵过程中，氯化物总量可达2.0％以上，保证了去氯灰黄霉素含量在0.2％以下。

实施例3、松刚霉素生产方法及应用

一、松刚霉素生产方法

利用实施例2制备的灰黄霉素生产松刚霉素，其关键技术在于实现松刚霉素主份——灰黄霉素的水溶性。

1、基于灰黄霉素为非水溶性，作为生物农药基本特性为水溶性，此前采用4-(p-叠氮水扬基氮基)丁胺为交联剂，在uv照射下，与灰黄霉素萃取液进行羧基反应，灰黄霉素由非水溶性成为水溶性。

2、本方法将发酵终了后的发酵液，经固液分离，灰黄霉素在孢内，菌丝体经造粒烘干而成菌体颗粒，灰黄霉素含量在20万μ/g，按30％溶于二甲基甲酰胺，搅拌过滤，滤液含8万μ/ml。

3、含8万μ/ml水溶性灰黄霉素，即成为松刚霉素，使用时稀释到80μ/ml，即松刚霉素成品用水稀释1000倍使用，可达到抑菌浓度。

4、灰黄霉素高产变株fa868的获得，极大的降低了作为生物农药松刚霉素主要成分——灰黄霉素的生产成本，大大促进其在农业应用上的推广。

二、松刚霉素的应用

1、松刚霉素对农作物真菌病害的防治效果

农作物枯萎病是由尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)引起的一种世界性的真菌性病害，一般导致减产20％～30％，严重田块可达50％～80％，甚至绝产，已成为限制着我国作物生产发展。尖孢镰刀菌有着寄主专化性。尽管生产上采用的种子消毒、种苗嫁接、土壤处理等方法具有一定的防治效果，但还不能彻底解决枯萎病的危害，目前在防治上还没有特效化学药剂。选择采自甜瓜、黄瓜、西瓜、苦瓜、辣椒和西红柿的不同专化型的10株致病性尖孢镰刀菌作为试验对象，系统研究了松刚霉素对尖孢镰刀菌的抑菌作用。

(1)松刚霉素对尖孢镰刀菌的抑制作用

在抑菌圈试验中(见表9和图1)，不同尖孢镰刀菌菌株对松刚霉素的敏感性存在显著性差异；松刚霉素对来自不同寄主的尖孢镰刀菌均表现出良好的抑制作用，对西瓜专化型的fjat-129和fjat-130、黄瓜专化型的fjat-3007、香蕉专化型的fjat-3071和fjat-3076优于其它菌株。如松刚霉素浓度为4×10^-6mm时，对黄瓜专化型fjat-3007和香蕉专化型fjat-3071的抑菌圈直径为23.6mm和22.9mm。

表9松刚霉素对尖孢镰刀菌的抑制效果

注：以溶剂二甲基亚砜作为阴性对照，+++，抑菌圈直径大于24mm；++，抑菌圈直径大于20mm小于24mm；+，抑菌圈直径大于16mm小于20mm；-，无抑制效果。

(2)松刚霉素对尖孢镰刀菌菌丝生长的影响

松刚霉素对所有供试的病原菌表现出广谱的抑制作用，并对菌丝生长的抑制作用与其浓度成正相关。

(3)松刚霉素对尖孢镰刀菌菌丝形态的影响

利用体视显微器，观察了经松刚霉素处理的尖孢镰刀菌的菌丝形态的变化，在dmso处理的对照中，供试菌株的菌丝形态皆为纤细、均匀细长、表面平滑。经4×10^-6mm松刚霉素处理后，尖孢镰刀菌的菌丝变得稀疏、畸形、膨大、扭曲。

综上所述：松刚霉素对尖孢镰刀菌具有广谱抑制作用，对其菌丝具有显著的致畸作用，从而影响其生长。

2、通过盆栽试验和田间小区试验测定松刚霉素对植物重要真菌性病害白粉病和白锈病的防治效果可达80％以上。

<110>福州工微生物科技有限公司

<120>一株生产松刚霉素主份——灰黄霉素的菌株及方法

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