一种产耐酸耐高温型木聚糖酶的基因工程菌及应用的制作方法

本发明属于基因生物工程领域，具体涉及一种产耐酸耐高温型木聚糖酶的基因工程菌及应用。

背景技术

木聚糖是构成半纤维素的重要组分，而半纤维素则是植物细胞壁结构的第二大碳水化合物，在玉米芯、麦麸等农业副产物中含量尤其丰富。木聚糖酶(ec3.2.1.8)科学命名法称之为内切-1，4-β-木聚糖酶，作为一类糖苷水解酶，负责催化断裂木聚糖中的β-1,4糖苷键，将结构复杂的木聚糖分解成小分子的低聚木糖和木糖。木聚糖酶在诸多领域都有着较为广泛的应用。如用在动物饲料行业中，可分解植物细胞壁，有效缓解由饲料中木聚糖、β-葡聚糖等非淀粉类多糖引起的抗营养作用。此外，还可降低饲料中的纤维黏度，改善饲料的消化吸收效率，提高家禽动物的体重。在面包等食品烘焙行业中，木聚糖酶能将大分子量的水不溶性阿拉伯木聚糖降解为水溶性的阿拉伯木聚糖，与其它酶制剂协同作用来改良面制品的品质；此外还可在纸浆行业中用做生物漂白剂。

然而，大多数工业过程的实现都伴随着高温和极端ph。如在饲料制备过程中，通常需要经过短暂高温(约75～93℃)处理阶段，而市场上在售的木聚糖酶最适温度普遍在40～60℃左右，高于90℃时，酶活完全丧失。不耐高温的特性限制了木聚糖酶的利用。另外，饲料在被单胃动物摄入后，到达肠道才能发挥作用。这就要求木聚糖酶在穿越胃部较强的酸环境到达作用部位小肠后，仍需保持较高活性。而动物胃部ph一般在2～7之间，目前在售的木聚糖酶最适ph一般在5～7，耐酸性差，很难在实际饲料添加过程中发挥优势，长期以来该主要营养成分一直未得到有效利用。所以耐热，耐酸型的木聚糖酶日益受到市场的青睐。研究人员尝试在生物信息学工具的辅助下，寻找编码耐热、耐酸、高活性木的木聚糖酶基因，越来越多的满足这一要求的嗜热微生物被筛选和分离出来，如热解纤维菌属(caldicellulosiruptorsp.)，嗜热脂肪芽孢杆菌属(bacillusstearothermophilus)，海洋红嗜热盐菌(rhodothermusmarinus)，嗜热子囊菌(thermoascusaurantiacus)，栖热袍菌属(thermotogasp.)等。但由于自然筛选的原始菌株的培养条件并不适于工业发酵，且后期对酶的分离纯化复杂，并不适合作为工程菌运用于工业生产当中。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种产耐酸耐高温型木聚糖酶的基因工程菌，所述的菌株已于2018年5月9日送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：cctccno：m2018258，分类命名：毕赤酵母(pichiapastoris)gs115-xyl-mut^s-5，地址：中国武汉武汉大学。

本发明的另一目的在于提供一种产耐酸耐高温型木聚糖酶的基因工程菌的应用，包括利用本发明提供的菌株制备木聚糖酶。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种高表达耐酸耐高温木聚糖酶的毕赤酵母工程菌的构建：

申请人将木聚糖酶基因进行优化后克隆到ppic9k载体上，重组表达载体线性化后电转入p.pastorisgs115感受态细胞中，g418浓度逐渐提高至8mg/ml以获得高拷贝转化子，然后再将该转化子制成感受态进行二次转化，最终得到高表达酶活菌株p.pastorisgs115-xyl-mut^s-5，该菌株在28℃下，甲醇和山梨醇按照质量比10:1作为诱导剂混合添加时产酶活性最高。经50l发酵罐高密度发酵后产酶活性达到139.54×10³u/ml，高于市场上现有工程菌的最高酶活6.00×10³u/ml。

以上所述菌株已于2018年5月9日，送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：cctccno：m2018258，分类命名：毕赤酵母(pichiapastoris)gs115-xyl-mut^s-5，地址：中国武汉武汉大学。

所构建毕赤酵母(pichiapastoris)gs115-xyl-mut^s-5工程菌株最适生长及诱导表达温度为28-30℃，温度超过32℃不利于菌株生长，造成木聚糖酶酶活降低。需氧，生长培养基为ypd培养基，bmgy、bmmy培养基用来进行木聚糖酶表达。菌体倍增时间约为2h，甲醇诱导阶段，倍增时间扩大至4-6h。

所制备的新型耐酸耐高温型木聚糖酶的酶学性质为：最适反应温度为85℃，最适反应ph为2.4。在70℃下处理该木聚糖酶60min，酶活性达到95％以上；80℃下处理30min，酶活性在80％以上。90℃下处理2min，酶活性在95％以上。在ph1.7到8.0之间处理60min剩余酶活性在70％以上。可以看出，该酶具有耐高温和耐酸性的优点，解决了目前饲料工业中所用木聚糖酶在生产过程中的高温加工处理阶段和动物肠胃的酸性条件下酶活急剧下降的难题。

一种高表达木聚糖酶毕赤酵母工程菌的摇瓶发酵方法，包括：

将活化后的毕赤酵母(pichiapastoris)gs115-xyl-mut^s-5在100mlbmgy培养基中培养至od600为3.8-4.5后，转接至100mlbmmy培养基中(含终浓度为0.5％的吐温80)，26-28℃进行诱导发酵，每10-12h补加质量比为10:1的甲醇与山梨醇的混合液0.5ml

一种高表达木聚糖酶毕赤酵母工程菌的高密度发酵方法，包括以下步骤：

1.菌体生长阶段

将p.pastorisgs115-xyl-mut^s-5种子液接种至装有bsm培养基的发酵罐中，在发酵起始阶段设置转速300-350rpm，用氨水调节ph至4.5-5.5，温度28-32℃，当bsm培养基中的甘油消耗完且do降低后又急剧上升至100％时，进入连续补甘油阶段，设置转速450-550rpm，以恒定的速率补加含有1.2％ptm1的50％甘油；

2.甲醇诱导表达阶段

当溶氧上升至100％后先让菌体饥饿1-1.5h，待甘油完全耗尽，此时开始甲醇诱导，设置搅拌速度600-800rpm，甲醇的添加量为0.8-1.2ml/h/l；整个阶段使do值尽量稳定在10％～20％之间，并保持该速率至发酵结束，所述甲醇含有1.2％的ptm1微量盐。

一种产耐酸耐高温型木聚糖酶的基因工程菌的应用，包括利用本发明提供的菌株或其发酵上清液制备木聚糖酶。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明所提出的制备耐酸耐高温型木聚糖酶方法的优势在于：①酶活性高。所构建的工程菌p.pastorisgs115-xyl-mut^s-5，经50l发酵罐高密度发酵后木聚糖酶活性达到139.54×10³u/ml,远高于市场上现有工程菌的最高酶活6.00×10³u/ml。②所表达的新型木聚糖酶耐酸耐高温。经酶学性质研究证实，该新型木聚糖酶最适反应温度为85℃，最适ph为2.4，且该酶在80℃下处理30min，酶活性仍在80％以上。解决了目前饲料工业中所用木聚糖酶在生产过程中的高温加工处理阶段和动物肠胃的酸性条件下酶活急剧下降的难题。

附图说明

图1为木聚糖酶的温度耐受曲线。

图2为木聚糖酶的ph耐受曲线。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的具体说明，不是对本发明的限制。下面结合附图及具体实施例子对本发明作进一步的说明。本发明所涉及的分子生物学方法为常规方法，为本领域人员所熟悉。本发明中未详细阐述的内容请参见《分子克隆实验指南》，j.萨姆布鲁克，d.w.拉塞尔等主编。

本发明实施例所使用的引物如下：

实施例1：

高表达耐酸耐高温型木聚糖酶菌株的构建

(1)优化后的木聚糖酶基因

经优化后的木聚糖酶基因的序列为seqidno.1所示，编码的蛋白质为seqidno.2所示。保存在puc19质粒上，命名为puc19-xyl。

(2)ppic9k-xyl载体的构建

根据基因序列设计引物，分别带有ecori和noti酶切位点，以合成的含有木聚糖酶序列的载体puc19-xyl为模板，用引物xyl-ecori-f，xyl-noti-r进行pcr扩增。经1％琼脂糖凝胶电泳检测目的产物后，得到一条1～2kb的条带，与木聚糖酶基因的理论值1,200bp大小相符，用试剂盒清洁回收目的条带。选取ecori和noti两个酶切位点对pcr回收产物及ppic9k质粒进行双酶切，酶切体系如下：

1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否完全，并将酶切产物分别用试剂盒进行清洁回收。

将上述两个酶切产物用t4连接酶酶连，酶连体系如下：

将酶连产物(不超过50ng)转化到100μle.colidh5α感受态细胞中，采用cacl2介导的转化法转化dh5α。将转化子涂布在含有100μg/mlamp的lb平板上，37℃倒置培养16-24h。长出单菌落转化子后，挑取单菌落溶于装有1ml含有100μg/mlamp的lb培养基中，37℃，225rpm培养约6h，以菌液为模板pcr检验阳性克隆子。将验证正确的转化子进行测序。

(3)线性化ppic9k-xyl质粒转化毕赤酵母

将ppic9k-xyl质粒用saci/bglii酶切线性化,37℃保温12h，反应体系如下：

向上述线性化产物中加入2.5倍体积的无水乙醇和1/10体积的3mol/lnaac，进行乙醇沉淀回收。将10μg经过线性化的重组质粒加入80μl的p.pastorisgs115感受态细胞中，混匀后转入冰预冷的电转杯中冰浴5min；设置电激参数(电压1500v，时间5ms)电击后，迅速加入1ml冰预冷的1mol/l山梨醇溶液，混匀后转至1.5ml离心管中；30℃低速摇床中孵育1～2h后将菌体悬液涂布于md平板上；将平板于30℃培养箱倒置培养2天，直至长出单菌落。从每种重组质粒单菌落的平板上挑取6个转化子，用lb+amp/kan液体培养基培养。菌液pcr验证正确的菌株中选取1～2株，用lb+amp/kan活化后送去华大基因测序，将测序正确的菌株用30％的甘油1:1保存。

(4)高g418浓度筛选高拷贝转化子

将电转后md平板上获得的转化子，分别在含有2mg/mlg418的md平板上划线，30℃倒置培养一天后，将生长状况良好的转化子转接至含有4mg/mlg418的md平板上划线，同样，30℃倒置培养一天后，将生长状况良好的转化子再次转接至含有6mg/mlg418的md平板上划线。挑取抗性较高的转化子进行摇瓶发酵，检测转化子的产酶能力。随着g418浓度的增加，转化子的数量依次减少，抗性较弱的转化子不断被淘汰。根据转化子在平板上的生长情况，从而筛选得到能够在含有较高g418浓度平板上生长良好的高拷贝转化子。

质粒dna线性化位置不同，转化gs115后可产生两种转化子his⁺mut⁺及his⁺mut^s。，mut^s细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。mut⁺(methanolutilizationplus)是指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。分别挑取5个mut⁺和mut^s型重组酵母进行摇瓶产酶发酵，mut⁺型重组酵母每12h补加甲醇1ml，mut^s型重组酵母每12h补加甲醇0.5ml。

(5)筛选转化子的摇瓶产酶发酵

将筛选出来的转化子保存后接种到100ml的bmgy培养基中(500ml容量瓶)，30℃，250rpm培养至od600＝4；8000rpm离心，菌体转接到100ml的bmmy诱导培养基中，30℃，250rpm培养，每12h补加甲醇至终浓度为1％，每24h取样1ml，样品离心收集上清，测定酶活。酶液适当稀释后与1％的木聚糖底物置于85℃水浴预热2min，然后混合均匀于85℃水浴精确反应5min，dns试剂终止反应，在540nm处测定各样品的吸光度，根据标准曲线计算样品酶活性。

(6)高拷贝转化子的二次电转与复筛

挑选出的5个mut⁺和mut^s型重组酵母进行摇瓶产酶发酵结果来看，9k-xyl-gs115-mut⁺-1#，9k-xyl-gs115-mut^s-1#，转化子酶活分别高于其余转化子。分别再将9k-xyl-gs115-mut⁺-1#、9k-xyl-gs115-mut^s-1#转化子活化后制备成感受态细胞，将ppic9k-xyl线性化后作为目的片段，二次转化进入上述感受态细胞中，增加拷贝数插入机会，使用含有10mg/mlg418的md平板进行筛选，得到重组菌。

将上述筛选得到的转化子及原始菌株进行摇瓶产酶发酵，同时进行产物耐酸耐高温的筛选，申请人发现，即便在不同转化子中木聚糖酶基因拷贝数相同的情况下，其产物对酸和温度的耐受程度也有差异，最终获得一个转化子9k-xyl-gs115-mut^s-5#在120h时的酶活最高，且对酸和温度的耐受程度最好，达到5103.57u/ml，该木聚糖酶在80℃和85℃的半衰期分别为45h和3h。在ph3.0和4.5-5.0附近分别有两个最大的酶活性峰，在ph1.5-6.0孵育1h后仍然残留有80％的酶活性。

申请人已于2018年5月9日，将该菌株送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：cctccno：m2018258，分类命名：毕赤酵母(pichiapastoris)gs115-xyl-mut^s-5，地址：中国武汉武汉大学。

实施例2：

毕赤酵母(pichiapastoris)gs115-xyl-mut^s-5的摇瓶发酵与50l发酵罐高密度发酵

(1)摇瓶发酵

将毕赤酵母(pichiapastoris)gs115-xyl-mut^s-5活化后，转接至100mlbmgy培养基中，28℃，250rpm条件下培养，待od600为4.0时，转接至100mlbmmy培养基中(含终浓度为0.5％的吐温80)，28℃进行诱导发酵，每12h补加甲醇与山梨醇的混合液0.5ml(甲醇与山梨醇的质量比10:1)，诱导168h，木聚糖酶的产量最高，达到9526.65u/ml。

(2)50l发酵罐高密度发酵

ⅰ.种子液的培养；将毕赤酵母(pichiapastoris)gs115-xyl-mut^s-5用ypd培养基活化后，按1％接种量转接至装有100ml的ypg培养基的500ml的三角瓶中，30℃，250rpm培养18h，至od600为4。

ⅱ.菌体生长阶段；将1l的种子液接种到装有20lbsm培养基的50l的发酵罐中，在发酵起始阶段设置转速300rpm，用氨水调节ph至5.0，温度30℃，当bsm培养基中的甘油消耗完且do降低后又急剧上升至100％时，进入连续补甘油阶段，设置转速500rpm，以恒定的速率(1ml/h/l)补加含有1.2％ptm1的50％甘油4l。随着菌体生物量的增加，溶氧do迅速下降，因此需要根据do值不断提高转速和增加罐压，保持do值在20％-40％的范围内，防止溶氧过低使菌体死亡。

ⅲ.甲醇诱导表达阶段；补加甘油结束后，为了使目的蛋白高效表达，充分激活醇氧化酶启动子(aox)的活性，在甲醇诱导前，当溶氧上升至100％后让菌体饥饿1h，让甘油完全耗尽，解除对aox的限制。甲醇诱导开始时设置搅拌速度700rpm，含有1.2％的ptm1微量盐的甲醇的添加量为1ml/h/l。整个阶段观察监测do值。根据do值的变化逐渐增加甲醇添加量以及通气量，使do值尽量稳定在10％～20％之间，并保持该速率至发酵结束。随时观察ph值和do的变化，每6h取样，用于检测菌体湿重以及酶活。在发酵初期，甘油是酵母生长的主要碳源，在培养48h左右，甘油几乎为0，待培养基中的溶氧值提高到100％，酵母饥饿1-2h后，确保培养基中不再含有甘油，再添加甲醇进入诱导阶段。通过自动补料系统给培养基中持续补加甲醇，在诱导阶段根据溶氧值和ph值来调整甲醇的补加速率。

发酵结果显示，在甲醇开始诱导时，在菌体湿重达到242.67g/l，发酵液上清酶活为870.00u/ml，甲醇诱导期间，发酵液上清酶活在不断增加，甲醇诱导120h后，菌体湿重达到497.67g/l，发酵液上清中酶活提高到139538.13u/ml，将该发酵上清用于以下实施例。

实施例3：

高拷贝表达新型耐酸耐高温型木聚糖酶耐高温性质鉴定：

木聚糖酶反应最适温度及热稳定性实验表明，所构建新型木聚糖酶最适反应温度为85℃；

将稀释后的酶液在不同温度下分别处理60min，并在不同时间2、5、8、10、15、20、30和60min取样后迅速置于冰上，将处理后的酶液在85℃，ph2.4下检测酶活。该酶液在70℃下处理5min以内，酶活基本不变，处理60min以内，酶活性保持在94％以上。80℃下处理30min以内，酶活性保持在80％以上，处理60min以内，酶活保持在50％以上。90℃下处理2min以内，酶活性保持在98％以上，处理5min以内，酶活仍保持在18％，热稳定性试验结果显示，所构建新型木聚糖酶对高温具有较强耐受性。新型木聚糖酶高温耐受性实验结果如图1所示。

实施例4：

高拷贝表达新型耐酸耐高温型木聚糖酶耐酸性质鉴定：

为模拟所构建新型木聚糖酶对胃部极端酸环境ph的耐受性，进行了木聚糖酶的最适ph及ph稳定性实验，结果表明木聚糖酶最适ph为2.4；将酶液在不同ph值的缓冲液中于37℃下保温60min，之后在ph2.4，85℃条件下测定该木聚糖酶活性。实验结果如下图示，在ph1.7到8.0之间木聚糖酶剩余酶活性在72％以上，显示出对酸环境较强的耐受性。在ph＝9.0时，木聚糖酶酶活性为32％，在ph＝10.0时，木聚糖酶酶活趋于10％。在ph＝12时，木聚糖酶几乎全部失活(图2)。模拟实验结果显示：所构建新型木聚糖酶对极端酸环境具有较强耐受性，弥补了目前市场上木聚糖酶对酸环境耐受性差的不足。

序列表

<110>四川润格生物科技有限公司

<120>一种产耐酸耐高温型木聚糖酶的基因工程菌及应用

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