本发明属于生物学领域，涉及一株枯草芽孢杆菌，具体涉及一株产蛋白酶的枯草芽孢杆菌及使用方法。
背景技术：
随着水产养殖业的飞速发展，高密度的集约化养殖规模日益扩大，水产养殖的环境恶化和疾病的危害对水产养殖业的经济损失也愈加明显。而传统的解决办法是采用抗生素。众所周知，抗生素的使用容易产生耐药性菌株的问题，并且会在体内残留。益生菌是一定浓度范围内可以对动物体产生有益作用的活的微生物。益生菌通过增强动物对肠内有害微生物群落的抑制作用，或者通过增强非特异性免疫功能来预防疾病，起到了促进动物生长的作用。因此，近些年来，作为抗生素的部分领域的替代品，益生菌得到迅速的发展。目前益生菌已经广泛应用于鱼类、贝类、虾类以及刺参的养殖中。bagheri等(2008)将不同浓度的复合芽孢杆菌制剂添加到虹鳟饲料中进行两个月的投喂，结果发现高浓度的复合益生菌制剂可以明显促进虹鳟生长。doeschate等(2008)研究证明南非鲍分离得到的土著益生菌群可以提高其消化酶活力，促进生长。iehata等(2009)发现乳酸菌对鲍鱼肠道消化酶活性提高有一定的作用。发明专利申请201510896838.8提供了“一株地衣芽孢杆菌及包含该菌株的饲料添加剂”。该发明专利申请具体提供了一株新型地衣芽孢杆菌dn29(bacilluslicheniformisdn29)，其保藏编号为cctccno：m2015482。所述的地衣芽孢杆菌dn29，能有效抑制灿烂弧菌和假交替单胞菌等病原菌，减少养殖动物病害发生的几率，同时还能作为饲料添加剂，显著提高养殖动物对饲料的利用率，促进动物生长。所述地衣芽孢杆菌dn29可作为益生菌应用于刺参的养殖生产过程中，对刺参的生长具有显著的促进作用，还可以有效提高刺参的免疫力及对灿烂弧菌的抵抗能力。技术实现要素：本发明提供了一株枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，所述菌株一方面能向细胞外分泌蛋白酶，所述蛋白酶可以分解饲料和环境中的蛋白质，一方面增加了刺参的生长速度，另一方面净化了水质，减少发病率，提成活率。本发明的技术方案：一株产蛋白酶的枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌命名为枯草芽孢杆菌db005(bacillussubtilis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.15646，保藏日期为2018年4月26日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。所述枯草芽孢杆菌db00516srdna序列如seqno.1所示。所述的枯草芽孢杆菌的活化方法，将枯草芽孢杆菌接种到lb培养基中，在25-30℃的温度条件下培养8-10小时。其中，所述lb培养基的配方为：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l。所述的枯草芽孢杆菌的应用，将所述枯草芽孢杆菌应用于刺参的养殖。所述枯草芽孢杆菌应用于刺参的养殖包括两种方法：(1)采用所述枯草芽孢杆菌发酵刺参饲料；(2)将所述枯草芽孢杆菌的菌液泼洒在刺参养殖池中。其中，所述方法(1)具体为：(a)将所述枯草芽孢杆菌菌株活化(细菌含量为1.0*108cfu/ml-1.0*109cfu/ml)，然后取适量，投入到初始刺参养殖饲料中，混合均匀，得到混合刺参养殖饲料；所述枯草芽孢杆菌菌液的重量分数为2-5％。(b)向混合刺参养殖饲料中加入适量水，所述水的量为初始刺参养殖饲料重量的1.5-3倍，然后在20-32℃的温度条件下发酵12-32小时，得到最终产物，即发酵刺参饲料。发酵后得到的刺参饲料为浆状液体，具有发酵香味。用该菌株发酵刺参饲料，能使饲料中的蛋白质分解为肽类和和游离氨基酸，更加有利于刺参的消化吸收。其中，所述方法(2)具体为：将活化好的菌液，均匀投放在刺参养殖池或刺参保苗池中，使菌液的浓度为5-10ppm；并根据消耗量定期补充以维持该浓度。具体步骤为：将活化好的菌液(细菌含量为1.0*108cfu/ml-1.0*109cfu/ml)稀释10倍，然后再均匀投放到刺参保苗池或刺参养殖池中。使用浓度为5-10ppm，5天补充投放一次，每次倒池(即将池中刺参连同刺参的附着基一起移至一个经过清理消毒的养殖池)后补充投放一次。在养殖水体中泼洒该菌株，可明显降解水体中残饵和粪便中的蛋白质，净化水质，提高刺参成活率，起到提高养殖效益的作用。一种包括所述的枯草芽孢杆菌的发酵刺参饲料，通过上述方法(1)制备得到。所述发酵刺参饲料的使用方法，其特征在于：将所述发酵刺参饲料与海泥(海底的浮泥，是海水中的泥沙和少数动植物碎屑及底栖硅藻等的混合物)，按照1:4-1:6的重量比混合均匀，然后将其投放在刺参养殖水中；所述每日的投放量为待喂养刺参总重量的1-3％。本发明的有益效果：(1)本发明中的枯草芽孢杆菌db005分泌的蛋白酶可以分解饲料的蛋白质，提高饲料的利用率，使刺参的生长速度提高，2个月的增重率由平均236.7％增加到298.3％，增加了61.6个百分点；(2)采用本发明所述的菌株发酵的刺参饲料养殖刺参，同时还可以分解养殖水中的残饵和粪便，净化水质，减少发病率，使用2个月后，成活率由原来的平均84.7％提高到平均90.7％，提高了5.97个百分点。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步的说明。实施例1：菌株的分离与筛选1.1有益菌的分离(1)初筛：在超净工作台中，用二蒸水适当稀释刺参池塘底泥上清液，均匀涂布于2216e固体培养基上，放于恒温培养箱中30℃恒温正置培养1小时，再倒置培养至长出单菌落。同样在超净工作台中无菌操作，用无菌牙签挑取单菌落，放于装有1mllb液体培养基的1.5mlep管里，使单菌落浸于培养液里后弃去牙签，盖紧盖子编号。在30℃，180rpm摇床内培养至菌液浑浊。然后与50％甘油1:1混匀，放入-80℃冰箱保存备用。(2)复筛：菌种活化：从-80℃保存的菌液取出后放在冰上解冻。在超净工作台中无菌操作，取1.5ml离心管，加入800μllb液体培养基，200μl菌液，混匀。30℃，180rpm，摇床培养至液体浑浊。用二蒸水适当稀释活化的各个菌液，吸取适量菌液均匀涂布于酪蛋白固体培养基上，放于恒温培养箱中30℃恒温正置培养1小时，再倒置培养至长出产生蛋白水解圈的单菌落。用无菌牙签挑取可产生蛋白水解圈的单菌落，并将牙签放于装有1mllb液体培养基的1.5mlep管里，使单菌落落于培养液里后弃去牙签，盖紧盖子重新编号。30℃，180rpm，摇床培养至菌液浑浊。与50％甘油1:1混匀，-80℃冰箱保存备用。实施例2：菌株的鉴定取出-80℃保存的菌液，放在冰上解冻。在超净工作台中无菌操作，取1.5ml离心管，加入800μllb液体培养基，200μl菌液，混匀。在摇床中30℃、180rpm培养至液体浑浊。然后取大约200μl菌液至于1.5ml离心管中，5000rpm，离心5min，弃去上清，再加入30μldepc灭菌水，煮沸10min，迅速放入冰中冷却5min。4℃，12000rpm，离心5min，上清为菌液pcr模板，以27f和1492r引物进行pcr扩增。pcr反应体系(10μl)：cdna1μl、10×buffer1μl、2.5mmdntp0.8μl、10μm正反引物各0.5μl，0.05μlrtaq酶、2h2o6.15μl。pcr引物：pcr反应条件为：整个反应结束后，反应产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。在凝胶成像系统下将目的条带切回，按照上海生工sanprep柱式试剂盒说明书进行dna回收、纯化。回收dna-20℃保存或用于转化链接。将回收产物与pmd18-t克隆载体进行连接，16℃连接过夜，获得目的菌株基因序列pmd18-t重组载体。连接体系如下：回收产物4.5ulpmd18-t0.5ulsolutioni5ul将连接产物全部转入已制备好的大肠杆菌感受态dh5α中，碎冰浴30min，42℃热激30s，置于冰上。加入650μl已经预热至37℃的lb培养基，37℃震荡培养1h。然后5000rpm离心3min，弃大部分上清，将剩余约150μl上清与沉淀吹打混匀，涂布于含有100mg/ml氨苄青霉素钠(amp)的lb平板上，37℃正置培养1h后，再倒置培养12-16h。挑取平板上长势良好的单菌落，37℃培养6h后，用特异引物27f和1492r进行阳性克隆的筛选，将连接正确的菌液送至上海桑尼生物公司测序。最后，将目的菌株的cdna序列进行blast比对，确定菌株种属。实施例3：菌株活化条件将所述枯草芽孢杆菌菌株，接种到lb培养基中，在25-30℃的温度条件下培养8-10小时，得到活化后的枯草芽孢杆菌。所述lb培养基的配方为：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l。实施例4：采用所述枯草芽孢杆菌发酵刺参饲料，并喂养刺参(1)取200g活化后的枯草芽孢杆菌液(细菌含量为1.0*108cfu/ml-1.0*109cfu/ml)，投入到10kg初始刺参养殖饲料中，混合均匀，得到混合刺参饲料。(2)向10kg混合刺参饲料中加入22kg水，然后在32℃的温度条件下发酵12小时，即得到发酵刺参饲料。发酵后的刺参饲料为浆状液体，具有发酵香味。(3)喂养刺参：选取约500头/500g，大小基本相同的刺参，随机放入3个大小为15立方米水体池中，每个池内放5.0kg。将所述发酵刺参饲料与海泥(海底的浮泥，是海水中的泥沙和少数动植物碎屑及底栖硅藻等的混合物)，按照1:5的重量比混合均匀，然后将其投放在刺参养殖水中。所述每日的投放量为待喂养刺参总重量的3％。即实验开始时投喂0.15kg饲料/池，于第二天上午检查剩料情况，并根据摄食情况调整饲料的投喂量。饲喂持续60天后，全池称重并计数，计算增重率和成活率。三个池重量分别为20.6kg、19.2kg和18.8kg，平均为19.5kg。增重率分别为312％、284％和276％，平均为290％。成活率分别为90％、89％和92％，平均为90.3％。对照组1(未使用本发明菌株饲料饲喂刺参)：选取约500头/500g，大小基本相同的刺参，随机放入3个大小为15立方米水体池中，每个池内放5.0kg。饲喂普通商品饲料，饲喂比率为刺参的3％/天，即实验开始时投喂0.15kg饲料/池，于第二天上午检查剩料情况，并根据摄食情况调整饲料的投喂量。饲喂时间为60天后，全池称重，三个池重量分别为15.2kg，17.1kg和16.6kg，平均为16.3kg。增重率分别为204％、242％和232％，平均为226％；成活率为87％、85％和82％，平均为84.7％。实施例5：采用所述枯草芽孢杆菌发酵刺参饲料，并喂养刺参与实施例4不同的是，(1)取300g活化后的枯草芽孢杆菌液，投入到10kg初始刺参养殖饲料中，混合均匀，得到混合刺参饲料；(2)向10kg混合刺参饲料中加入30kg水，然后在20℃的温度条件下发酵32小时，即得到发酵刺参饲料。发酵后的刺参饲料为浆状液体，具有发酵香味。(3)喂养刺参：将所述发酵刺参饲料与海泥(海底的浮泥，是海水中的泥沙和少数动植物碎屑及底栖硅藻等的混合物)，按照1:6的重量比混合均匀，然后将其投放在刺参养殖水中。所述每日的投放量为待喂养刺参总重量的2％，即实验开始时投喂0.05kg饲料/池，于第二天上午检查剩料情况，并根据摄食情况调整饲料的投喂量。饲喂持续60天后，全池称重并计数，计算增重率和成活率。三个池重量分别为19.1kg、21.0kg和20.5kg，平均为20.2kg。增重率分别为282％、320％和310％，平均为304％。成活率分别为91％、92％和90％，平均为91.0％。对照组2(未使用本发明菌株饲料饲喂刺参)：饲喂普通商品饲料，饲喂比率为刺参的1％/天，即实验开始时投喂0.05kg饲料/池，于第二天上午检查剩料情况，并根据摄食情况调整饲料的投喂量。饲喂时间为60天后，全池称重，三个池重量分别为17.4kg，17.9kg和16.1kg，平均为17.1kg。增重率分别为248％、258％和222％，平均为242.7％。成活率为86％、88％和83％，平均为85.7％。实施例6：采用所述枯草芽孢杆菌发酵刺参饲料，并喂养刺参与实施例4不同的是，(1)取500g活化后的枯草芽孢杆菌液，投入到10kg初始刺参养殖饲料中，混合均匀，得到混合刺参饲料。(2)向10kg混合刺参饲料中加入15kg水，然后在24℃的温度条件下发酵26小时，即得到发酵刺参饲料。发酵后的刺参饲料为浆状液体，具有发酵香味。(3)喂养刺参：将所述发酵刺参饲料与海泥(海底的浮泥，是海水中的泥沙和少数动植物碎屑及底栖硅藻等的混合物)，按照1:4的重量比混合均匀，然后将其投放在刺参养殖水中。所述每日的投放量为待喂养刺参总重量的2％，即实验开始时投喂0.1kg饲料/池，于第二天上午检查剩料情况，并根据摄食情况调整饲料的投喂量。饲喂持续60天后，全池称重并计数，计算增重率和成活率。三个池重量分别为20.6kg、19.8kg和19.7kg，平均为20.0kg。增重率分别为312％、296％和294％，平均为300.7％。成活率分别为93％、90％和89％，平均为90.7％。对照组3(未使用本发明菌株饲料饲喂刺参)：饲喂普通商品饲料，饲喂比率为刺参的1％/天，即实验开始时投喂0.05kg饲料/池，于第二天上午检查剩料情况，并根据摄食情况调整饲料的投喂量。饲喂时间为60天后，全池称重，三个池重量分别为17.5kg，16.8kg和16.9kg，平均为17.1kg。增重率分别为250％、236％和238％，平均为241.3％。成活率为83％、82％和86％，平均为83.7％。实施例7：采用所述枯草芽孢杆菌发酵刺参饲料，并喂养刺参(1)取400g活化后的枯草芽孢杆菌液(细菌含量为1.0*108cfu/ml-1.0*109cfu/ml)，投入到10kg初始刺参养殖饲料中，混合均匀，得到混合刺参饲料。(2)向10kg混合刺参饲料中加入25kg水，然后在28℃的温度条件下发酵18小时，即得到发酵刺参饲料。发酵后的刺参饲料为浆状液体，具有发酵香味。(3)喂养刺参：选取约500头/500g，大小基本相同的刺参，随机放入3个大小为15立方米水体池中，每个池内放5.0kg。将所述发酵刺参饲料与海泥(海底的浮泥，是海水中的泥沙和少数动植物碎屑及底栖硅藻等的混合物)，按照1:3.5的重量比混合均匀，然后将其投放在刺参养殖水中。所述每日的投放量为待喂养刺参总重量的3％。即实验开始时投喂0.15kg饲料/池，于第二天上午检查剩料情况，并根据摄食情况调整饲料的投喂量。饲喂持续60天后，全池称重并计数，计算增重率和成活率。三个池重量分别为20.1kg、19.8kg和18.9kg，平均为19.6kg。增重率分别为302％、296％和278％，平均为292％。成活率分别为90％、89％和92％，平均为90.3％。对照组4(未使用本发明菌株饲料饲喂刺参)：选取约500头/500g，大小基本相同的刺参，随机放入3个大小为15立方米水体池中，每个池内放5.0kg。饲喂普通商品饲料，饲喂比率为刺参的3％/天，即实验开始时投喂0.15kg饲料/池，于第二天上午检查剩料情况，并根据摄食情况调整饲料的投喂量。饲喂时间为60天后，全池称重，三个池重量分别为15.4kg，16.9kg和16.3kg，平均为16.2kg。增重率分别为208％、238％和226％，平均为224％；成活率为86％、85％和83％，平均为84.7％。表1实施例4-7有益菌株发酵饲料对刺参生长及成活率的影响初重，kg末重，kg增重率,％成活率,％实施例45.019.5290.790.3对照组15.016.3226.084.7实施例55.020.2304.091.0对照组25.017.1242.785.7实施例65.020.0300.190.7对照组35.017.1241.383.7实施例75.019.6292.090.3对照组45.016.2224.084.7实施例8：将所述枯草芽孢杆菌的菌液泼洒在刺参养殖池中(1)将所述枯草芽孢杆菌菌株，按照实施例3所述方法活化。(2)选取约500头/500g，大小基本相同的刺参，随机放入3个大小为15立方米水体池中，每个池内放5.0kg。将活化好的菌液(细菌含量为1.0*108cfu/ml-1.0*109cfu/ml)先用养殖池的海水稀释10倍，然后再均匀投放到刺参养殖池中。使用浓度为5-10ppm，每5天补充投放一次，每次倒池(即将池中刺参连同刺参的附着基一起移至一个经过清理消毒的养殖池)后补充投放一次。用普通未发酵饲料饲喂60天后，重量分别为18.3kg、17.6kg和18.1kg，平均为18.0kg；增重率分别为266％、252％和262％，平均为260％；成活率分别为89％、91％和90％，平均为90.0％。对照组5：(如发酵饲料的对照)选取约500头/500g，大小基本相同的刺参，随机放入3个大小为15立方米水体池中，每个池内放5.0kg。饲喂普通商品饲料，饲喂比率为刺参的2％/天，即实验开始时投喂0.1kg饲料/池，于第二天上午检查剩料情况，并根据摄食情况调整饲料的投喂量。饲喂时间为60天后，全池称重，三个池重量分别为16.2kg，17.2kg和17.1kg，平均为16.8kg；增重率分别为224％、244％和242％，平均为236.7％；成活率为86％、84％和83％，平均为84.3％。在泼洒有益菌的养殖池和对照池中，分别取出水样，在3天、5天和7天用碱性高锰酸钾法分别测定其cod值的大小，记录实验数据。通过所测得的实验数据分析复合菌剂降解养殖水中有机物的能力。降解率＝(初始cod值-最终cod值)/初始cod值。对有机物的降解率3天时分别为7.4％、6.8％和6.2％，平均为6.8％；5天时分别为19.3％、16.5％和17.4％，平均为17.7％；7天时，分别为38.6％、37.5％和36.9％，平均为37.7％。表2有益菌株泼洒水体对刺参生长、成活率及水体中有机物降解率的影响由表1可知，采用本申请所述的枯草芽孢杆菌发酵刺参饲料，并喂养刺参；60天后增重率为290.7％-304.0％，成活率为90.3％-91.7％；而对照组的刺参，增重率为224.0％-242.7％，成活率为83.7％-85.7％。与对照组相比，采用本申请所述的枯草芽孢杆菌发酵的刺参饲料喂养的刺参，增重率上涨了61.6个百分点，而成活率也增加了近6个百分点。由表2可知，将本申请所述的枯草芽孢杆菌的菌液泼洒在刺参养殖池中，采用普通养殖饲料喂养刺参，60天后，刺参增重率为260％，成活率为90％；而对照组(未泼洒菌液)的刺参增重率为236.7％，成活率为84.3％。与对照组相比，将枯草芽孢杆菌的菌液泼洒在刺参养殖池中的刺参，增重率上涨了23.3个百分点，成活率增加了5.7个百分点。综上可知，本申请所述的枯草芽孢杆菌，用于刺参的饲养，可以使刺参的生长速度加快，提高刺参的成活率。此外，向刺参养殖池中泼洒枯草芽孢杆菌的菌液，对有机物的降解率3天时为6.8％；5天时为17.7％；7天时为37.7％；而对照组则无法对有机物进行降解。这是由于，向刺参养殖池中喷洒的枯草芽孢杆菌的菌液，可以降解水体中残饵和粪便中的蛋白质，净化了水质，从而提高刺参的成活率，将产生良好的经济效益，对刺参产业的发展具有良好的推动作用。序列表<110>青岛农业大学<120>产蛋白酶的枯草芽孢杆菌及使用方法<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1573<212>dna<213>枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)<400>1tgcagcttgctgcctgcaggtcgacgattagagtttgatcctggctcaggacgaacgctg60gcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttag120cggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaa180accggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcaaacataaaaggtggcttc240ggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcacc300aaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacgg360cccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacgg420agcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaa480caagtaccgttcaaatagggcggtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaac540tacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgt600aaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggcttaaccggggagg660gtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcgg720tgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaact780gacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggaatagataccctggtagtccacgcc840gtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcat900taagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaagggattgacgggggc960ccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtc1020ttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtg1080gtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgca1140acccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaa1200ccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacg1260tgctacaatggacagagcaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatc1320tgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaat1380cgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacac1440cacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaaccttttaggagccagccgccgaag1500gtgggacagatgattggggtgaagtcgtaacaaggtaaccaatctctagaggatccccgg1560taccgagctcgaa1573当前第1页12