本发明涉及芽孢杆菌(bacillussp)的发酵培养方法，本发明进一步涉及芽孢杆菌菌株wxcdd105的发酵培养基及其发酵方法，属于芽孢杆菌菌株wxcdd105的发酵制备领域。
背景技术：
：番茄的灰霉病和叶霉病在番茄的生产过程中极为常见，给番茄的生产造成巨大的经济损失。目前，两种病害主要使用化学农药进行防治。近年来长期施用农药产生的危害受到极大的关注。相比而言，微生物农药具有无残留无公害等优点，是取代化学农药的首选。因此应用有益微生物防治番茄灰霉病和叶霉病的前景十分广阔。目前，用于防治番茄灰霉病和叶霉病的多数菌株抑菌谱单一，仅对其中的一种病害有效，能够同时防治两种病害的菌株较少，目前尚未有同时防治番茄灰霉病和叶霉病的微生物菌剂上市应用。但是，两种病害在生产过程中经常同时发生，因此，研究兼防灰霉病和叶霉病的生防菌株具有重要意义。近几年生物发酵工程在农业领域的应用十分广泛，主要是通过优化发酵工艺增加菌量及发酵代谢产物用于增产、防病等方面的研究。包括两方面：一是培养基成分的优化，二是发酵条件的优化。采用适合的优化方法，在提高生产效率的同时还能降低生产成本，应用性更强(陈坚，刘立明，堵国成，等.发酵过程优化原理与技术[m].北京：化学工业出版社，2009：1-5.)。培养基能为微生物的生长提供必须的营养和必要的生长环境。其中碳源和氮源对微生物的生长和繁殖尤为重要(姚文兵.生物技术制药概论[m].中国医药科技出版社，2010.)。碳源能为微生物的生长提供物质和能量(蒋新龙.发酵工程[m].杭州：浙江大学出版社，2011，61.)。常用的碳源主要有谷物淀粉(如玉米粉、马铃薯淀粉等)、蔗糖、糖蜜等。氮源(包括有机氮和无机氮)为微生物细胞和代谢物提供氮素，对微生物的繁殖及芽孢的形成有着重要的作用(梁宇.生防枯草芽胞杆菌s-16液体发酵条件的优化[d].内蒙古农业大学，2015.)。氮源按能否直接被菌体利用可分为速效氮和迟效氮。速效氮利于菌体的生长，迟效氮利于代谢产物的形成(张嗣良.发酵工程原理[m].北京：高等教育出版社，2013，42-43.)。c/n对微生物的生长代谢产生直接的影响，过大和过小均影响微生物的繁殖和代谢。合适的c/n对微生物的生长代谢非常重要(钱风光，陈守文，蔡皓.生防菌枯草芽胞杆菌bs-5在3l发酵罐中的发酵工艺优化[j].中国生物防治，2009，25(1)：73-78.)。无机盐是组成酶或辅酶的有效成分，对生物大分子和细胞结构的稳定性起到一定的维持作用，能够缓冲和调节菌体与培养基之间关系(杜娟，孙佰平，张学坤，等.正交设计优化以沼液为基质的枯草芽胞杆菌s37最优发酵培养基[j].石河子大学学报(自然科学版)，2012，30(6)：678-682.)。除此之外，发酵条件对微生物的影响也较大。合适的培养条件有利于提高发酵产量和质量(张文芝，郭坚华.微生物发酵工艺优化研究进展[j].广东农业科学，2013，40(6)：114-117.)。微生物的发酵过程中影响的因素较多，发酵工艺的优化决定着发酵水平高低(tangxj，hegq，chenqh，etal.mediumoptimizationforthepro-ductionofthermalstablebeta-glucanasebybacillussubtiliszjf-1a5usingresponsesurfacemethodology[j].bioresourtechnol，2004，93(2)：175-181.)，一些试验技术和设计方法在培养基成分及培养条件的优化组合试验中得到广泛的应用。传统的优化法当试验因素较多以及考虑各因素之间交互作用时，试验次数就会增多，导致试验结果不准确。为了弥补缺陷，应用统计软件(诸如sas、spss等统计软件)进行辅助试验优化得到了广泛的应用。中国专利申请公开号为cn105838656a，发明名称为“防治番茄灰霉病和叶霉病的广谱抗病促生抗逆芽孢杆菌及其应用”的发明专利申请公开了一株防治番茄灰霉病和叶霉病的广谱抗病促生抗逆芽孢杆菌，其命名为wxcdd105，为枯草芽胞杆菌(bacillussp)枯草亚种，其微生物保藏编号是cgmccno.12496。本发明人通过大量的实验发现采用现有的发酵培养基和发酵条件对逆芽孢杆菌wxcdd105进行发酵培养，发酵产物中活菌数较低，这极大了限制了枯草芽孢杆菌wxcdd105在生物防治中的应用，有待改进。技术实现要素：本发明的主要目的是对芽孢杆菌wxcdd105的发酵培养基和发酵条件进行优化，优化后的发酵培养基和发酵条件能够显著的提高枯草芽孢杆菌wxcdd105的活菌数。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：一种生防细菌芽孢杆菌wxcdd105的发酵制备方法，包括：以kb液体培养基为初始发酵培养基，将芽孢杆菌wxcdd105接种到初始发酵培养基中进行发酵培养，即得。本发明以nyd、ppm、kb以及lb这四种培养基分别作为芽孢杆菌wxcdd105发酵培养的初始发酵培养基，结果发现wxcdd105在kb液体培养基中，30℃连续培养30h，菌数最大，为2.76×108cfu/ml。抑菌活性最强，抑菌距离为6.59mm。芽胞生成率最高，为70.53％。因此，本发明优选kb培养基为芽孢杆菌wxcdd105的初始发酵培养基。在确定了kb培养基为芽孢杆菌wxcdd105的最优初始发酵培养基的基础上，本发明进一步对kb培养基中的最适碳源、最适氮源、最适无机盐以及最适无机盐组合进行了优化筛选。最适碳源的优化试验发现wxcdd105以蔗糖为碳源时，菌量最大，抑菌活性最强，其次是葡萄糖、可溶性淀粉和甘油。因此，本发明选择蔗糖作为wxcdd105的最适碳源。最适氮源的优化试验结果发现，wxcdd105的氮源筛选中，以菌量为指标，从大到小排序前三的为酵母粉、蛋白胨和牛肉膏。以抑菌活性为指标，排序为前三的为蛋白胨、牛肉膏和酵母粉。结合菌量和无菌滤液抑菌活性进行综合考虑后确定以酵母粉作为最适氮源。最适无机盐的优化试验结果发现，按照从大到小排序，wxcdd105无机盐筛选排序为磷酸二氢钾＞氯化钙＞硫酸锰＞硫酸镁＞磷酸氢二钠＞nacl＞硫酸铁＞硫酸铜。最适无机盐组合的优化试验发现，将生防细菌wxcdd105的碳源和氮源选用筛选出的最佳碳氮源，无机盐按照排序结果，分别设置前一、二、三、四和五种组合。试验结果为图7所示，wxcdd105为前三种组合菌量和抑菌活性达到最高，分别是磷酸二氢钾，氯化钙，硫酸锰。在最适碳源、最适氮源、最适无机盐以及最适无机盐组合的优化筛选结果的基础上，本发明进行了培养基成分响应面试验，最终确定了kb培养基的最佳组成为：蔗糖4.4％，酵母粉1.32％，氯化钙0.08％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸锰0.02％。优化后菌量的od600值为1.768，与模拟值相差1.98％。证明所确定的最佳培养基组成可靠。在确定了最佳培养基的配方组成后，本发明进一步对显著影响发酵产物中活菌数的培养温度、初始ph值、接种量以及装液量的参数进行了优化。根据培养温度对生防细菌wxcdd105生长的优化试验结果可见，生防细菌wxcdd105菌株在20℃，25℃，30℃和37℃4个温度下均能生长，菌株wxcdd105在37℃培养时，菌体密度和发酵液抑菌圈直径均达最大值，因此，本发明确定37℃作为生防菌株wxcdd105的最适培养温度。根据初始ph对生防细菌wxcdd105生长的优化试验结果可见，当发酵培养基的初始ph为6.5时，菌株wxcdd105的两项指标均达到最大值。因此，本发明确定发酵培养基的最佳起始ph值为6.5。根据接种量对生防细菌wxcdd105生长的影响试验结果可见，当接种量为2％和3％，生防细菌wxcdd105的菌量和发酵液抗菌活性均较高。因此，本发明最终确定生防菌株wxcdd105的2％接种量为最佳接种量。根据装液量对生防细菌wxcdd105生长的影响试验结果可见，当装液量小于10ml和大于90ml时，两项指标均较低，当wxcdd105的装液量为70ml时两项指标的值较高，因本发明确定10ml-90ml/250ml为较为适宜的装液量，其中70ml/250ml为最佳装液量。本发明采用优化后最佳培养基以及所优选的最适发酵培养条件对生防细菌wxcdd105进行发酵培养，结果发现优化后活菌数为2.6×109cfu/ml，是采用优化前的初始培养基及初始发酵条件下培养的发酵液的17.3倍，试验结果试验，采用本发明优化的最佳培养基以及最适的发酵培养基条件能够极其显著的提高生防细菌wxcdd105的活菌数。附图说明图1生防细菌芽孢杆菌wxcdd105的生长曲线。图2生防细菌芽孢杆菌wxcdd105的菌量与吸光值相关性的测定结果。图3不同初始培养基对生防细菌芽孢杆菌wxcdd105生长的影响试验结果。图4生防细菌的碳源利用情况图。图5生防细菌的氮源利用情况图。图6生防细菌对无机盐的利用情况图。图7生防细菌对无机盐组合的利用情况图。图8蔗糖和酵母粉交互影响生防细菌芽孢杆菌wxcdd105菌量的响应面图。图9蔗糖和氯化钙交互影响生防细菌芽孢杆菌wxcdd105菌量的响应面图。图10酵母粉和氯化钙交互影响生防细菌芽孢杆菌wxcdd105菌量的响应面图。图11培养温度对生防细菌芽孢杆菌wxcdd105发酵的影响。图12ph值对生防细菌芽孢杆菌wxcdd105发酵的影响。图13接种量对生防细菌芽孢杆菌wxcdd105发酵的影响。图14装液量对生防细菌芽孢杆菌wxcdd105发酵的影响。图15生防细菌芽孢杆菌wxcdd105的发酵培养基优化前后活菌数的比较。具体实施方式以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。试验例1枯草芽孢杆菌wxcdd105的生长曲线测定试验生长曲线测定结果为图1所示，根据生长曲线可见生防细菌芽孢杆菌wxcdd105菌量增长的大致趋势为“s”型曲线，即菌量随培养时间的增加而增长。在0-9h，由于细菌刚被接入培养液中，菌量基数小，需要一定时间的调整以适应生长环境，导致菌株的繁殖速度缓慢，因此菌量增长缓慢；连续培养9-30h后，一方面由于菌株逐渐调整好了自身代谢，菌量也积累到了一定的水平，并且菌株的生长状态良好。另一方面生长环境营养较充足，生长条件适宜，因而菌株迅速繁殖，菌量急剧上升，达到对数生长期；30h之后，进入增殖后期，菌量最大；30-48h期间，由于营养物质的耗尽，菌株产生的次生代谢产物抑制菌株的生长，导致其增长速度骤减而趋于平稳，因而菌量变化趋于稳定，进入平稳期。从上述分析中可以判断18-30h为对数生长末期，此阶段为最佳的接种时期，因此确定18h为最佳接种种龄；48h为测定菌数的最佳时期，此时菌量最大。试验例2枯草芽孢杆菌wxcdd105的菌量与吸光值相关性的测定试验细菌在生长繁殖过程中，培养时间逐渐延长，菌液变得越来越浑浊，测定吸光度能体现其浊度，若吸光值与菌株数量呈现线性关系。就可以测定吸光值代替菌数。菌量与吸光值相关性的测定结果尾图3-8所示，生防菌芽孢杆菌wxcdd105菌量与吸光值相关性的测定的菌数与测定的od600值呈现良好的线性关系，菌数越大，od600值越大，因此通过测定发酵液的od600值能够准确的反映出菌株的数量。试验例3枯草芽孢杆菌wxcdd105的初始发酵培养基的筛选试验如图3和表1所示。wxcdd105在kb液体培养基中，30℃连续培养30h，菌数最大，为2.76×108cfu/ml。抑菌活性最强，抑菌距离为6.59mm。芽胞生成率最高，为70.53％。因此选择kb培养基为初始发酵培养基。表1不同培养基对四株生防细菌芽胞形成的影响试验例4发酵培养基成分的优化试验1最适碳源的优化试验优化试验结果如图4所示。wxcdd105以蔗糖为碳源时，菌量最大，抑菌活性最强，其次是葡萄糖、可溶性淀粉和甘油。因此选择蔗糖作为wxcdd105的最适碳源。2最适氮源的优化试验优化试验结果如图5，wxcdd105的氮源筛选中，以菌量为指标，从大到小排序前三的为酵母粉、蛋白胨和牛肉膏。以抑菌活性为指标，排序为前三的为蛋白胨、牛肉膏和酵母粉。结合菌量和无菌滤液抑菌活性进行综合考虑后确定以酵母粉作为最适氮源。3最适无机盐的优化试验优化试验结果如图6所示，综合两项指标的结果分析，按照从大到小排序，wxcdd105无机盐筛选排序为磷酸二氢钾＞氯化钙＞硫酸锰＞硫酸镁＞磷酸氢二钠＞nacl＞硫酸铁＞硫酸铜。4最适无机盐组合的优化试验将生防细菌wxcdd105的碳源和氮源选用筛选出的最佳碳氮源，无机盐按照排序结果，分别设置前一、二、三、四和五种组合。试验结果为图7所示，wxcdd105为前三种组合菌量和抑菌活性达到最高，分别是磷酸二氢钾，氯化钙，硫酸锰。5培养基成分响应面试验(1)plackett-burman试验确定显著影响因素按照表2进行试验，结果分析见表3，蔗糖、酵母粉和氯化钙的“prob>f”＜0.05，是显著影响因素。其他因素均影响不显著。得到的回归方程如下：eq.(2)r1＝1.40+0.098a+0.14b-0.037d-0.11e-0.032g从方程eq.(2)中可以得出，显著影响因素蔗糖和酵母粉的预测模型系数为正值，对菌量具有正效应，在最陡爬坡实验中应增量。氯化钙为负值，对菌量具有负效应，应减少含量。非显著影响因素中，系数均为负值，在后续试验中均取“-1”水平。表2菌株wxcdd105的plackett-burman试验设计及结果表3菌株wxcdd105的plackett-burman试验设计分析结果(2)最陡爬坡试验选取各显著因素的低水平为爬坡起点，根据每个因素影响效应的不同进行步长设计。按表4设计试验，由表5可知，od600的值先增大后减小，在第6组试验中，蔗糖4％，酵母粉1.2％，氯化钙0.1％时，od600最大，故以第6组试验为中心点。表4菌株wxcdd105的最陡爬坡路径步长设计表5菌株wxcdd105的最陡爬坡路径实验设计与结果(3)中心组合试验根据wccdd105的最陡爬坡试验结果，以蔗糖4％，酵母粉1.2％，氯化钙0.1％为中心点(0)进行响应面分析，见表6，重复5次。表6wxcdd105的中心组合设计因子水平设计表按照表7设计进行20组试验，发酵48h，测定od600值，3次重复，把结果填入表中并用designexpert8.0.6软件对最佳的od600值进行预测，见表8。表7wxcdd105的响应面分析法中心组合设计与结果对中心组合设计试验进行回归分析，预测三个独立变量因子对菌株数量影响，通过以下多元二次方程：eq.(6)r2＝1.64+0.13a+0.095b+0.084c+0.15ab-0.16ac-0.17bc-0.16a2-0.24b2-0.082c2如表8所示，该模型的决定系数(r2＝0.9485)以及调整决定系数(r2adj＝0.9021)接近1，说明观测值和预测值高度相关。回归模型达到极显著(p<0.0001)，拟合度还是比较高的。表中各项对方程的影响均达到显著，所以确定此回归方程即为响应面分析所用方程。表8wxcdd105的中心组合设计二次模型的方差分析注：a：蔗糖；b：酵母粉；c：氯化钙；r2＝0.9485；r2adj＝0.9021note:a:sucrose；b:yeastextractpowder；c:calciumchloride；r2＝0.9485；r2adj＝0.9021用3d响应面图形来表示回归方程(eq.(6))，如图8所示。随着蔗糖和酵母粉含量的升高，菌量呈现先升高后下降的趋势，并具有最大值。两者对菌量的影响均较大。表明高浓度的碳、氮源会抑制细菌的生长繁殖。如图9所示。随着蔗糖和氯化钙含量的升高呈现先升高后下降的趋势，具有最大值。其中蔗糖对菌量的影响较大。表明兩者在高浓度时抑制细菌的生长繁殖。如图10所示。菌量随酵母粉和氯化钙含量的升高呈先升高后下降的趋势，具有最大值。其中酵母粉对菌量的影响较大。高浓度时，两者均抑制细菌的生长繁殖。(4)模型验证用design-expert软件对各菌株的显著因素的最佳值和菌量的最大值进行优化。重复3次。菌株wxcdd105预测值(od600值)为1.7878，优化后配方为：蔗糖4.4％，酵母粉1.32％，氯化钙0.08％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸锰0.02％，余量为水。优化后菌量的od600值为1.768。与模拟值相差1.98％。证明此模型可靠。试验例5发酵条件的优化试验1培养温度对四株生防细菌生长的影响如图11所示，菌株在20℃，25℃，30℃和37℃4个温度下均能生长，菌株wxcdd105在37℃培养时，菌体密度和发酵液抑菌圈直径均达最大值，因此37℃作为菌株wxcdd105的最适培养温度。2初始ph对四株生防细菌生长的影响如图12所示，当ph为6.5时，菌株wxcdd105的两项指标均达到最大值。因此，选择发酵培养基的起始ph值为6.5。3接种量对四株生防细菌生长的影响由图13可见，接种量为2％和3％，生防细菌的菌量和发酵液抗菌活性均较高。因此，菌株wxcdd105选2％为最适接种量。4装液量对四株生防细菌生长的影响由图14可见，当装液量小于10ml和大于90ml时，两项指标均较低，当wxcdd105的装液量为70ml时两项指标的值较高，因wxcdd105选择70ml为最佳装液量。试验例6菌株wxcdd105发酵优化前后结果比较试验本试验分为2组，试验1组将生防菌株wxcdd105按照优化前的kb液体培养基和优化前的发酵培养条件进行培养，其中，优化前的kb液体培养基组成如下：蛋白胨20.0g，甘油10ml，k2hpo41.5g，mgso41.5g，蒸馏水1000ml，kb液体培养基的初始ph7.0；优化前的发酵培养条件如下：初始发酵培养基的装液量90ml/250ml，菌株的接种量5％,发酵培养温度为30℃，连续培养30h；试验2组将生防菌株wxcdd105在优化后的kb液体培养基以及优化的发酵培养条件中进行培养，其中，优化后的kb液体培养基组成是：蔗糖4.4％，酵母粉1.32％，氯化钙0.08％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸锰0.02％，余量是水。初始发酵培养基的初始ph为6.5，初始发酵培养基的装液量70ml/250ml，菌株的接种量2％，发酵培养温度为37℃，连续培养30h。发酵优化前后结果比较如图15所示，优化后活菌数为2.6×109cfu/ml，是初始培养基及初始发酵条件下培养的发酵液的17.3倍。当前第1页12当前第1页12