本发明属于生物技术领域,涉及非损伤性取样材料中提取DNA的方法,具体涉及一种人类粪便DNA提取方法。
背景技术:
肠道系统是人体最大的消化器官,也是人体最大的排毒器官,其可直接影响人体正常生理功能,与人体健康息息相关。人体携带有1014的细菌,总重量大约为1270g,这些细菌在人出生后就开始定植,并保持数量和种类的动态平衡。正常的微生物群大部分定植于肠道,它们参与宿主的生长发育,促进免疫系统的成熟,为宿主提供营养等。因而,肠道微生态系统也成为宿主生理系统中不可分割的组成部分。
与肠道有关的疾病有阑尾炎、肠梗阻、肠炎、息肉、肿瘤和癌症等,临床上可通过各种检测予以确诊,包括血液检测,彩超,组织活检等,其中肠镜检测最为准确,但其侵入性高,易造成受检查者身体创伤和痛苦,受检者接受度低。
肠道微生态系统包括多种多样的细菌微生物,其中包含大量人体有益菌群,亦有对人体有害的菌群,有越来越多的证据表明这些菌群与人自身免疫系统、肥胖、糖尿病、心血管疾病、血压调节、癌症等有关,加强肠道菌群的研究对防治、治疗和疾病预后都有重要的意义。
对粪便中肠道脱落细胞和细菌DNA的检测可得到大量相关信息,诸多证据显示脱落细胞DNA与多种癌症高度相关,而通过对细菌DNA的检测可判别其细菌种类及细菌的相对含量,从而给出对人体健康状况的解读。
然而要从粪便中得到高质量的DNA来进行相应的研究和转化应用还有很多问题亟待解决,例如在粪便的采集过程中可能会发生DNA的降解,粪便中也存在着各种PCR反应抑制剂(各种细菌、食物残渣、多糖、胆酸和消化液等),严重影响后续的检测和试验。市场上已有的粪便DNA提取试剂盒以硅胶膜柱结合法为主,不能完全满足要求,且价格昂贵。
从粪便中提取DNA的方法多种多样,例如直接提取粪便DNA,富集肠壁脱落细胞后提取人基因组DNA等,其中直接提取法获得的DNA总量高,但人源DNA含量较少,不适合应用于对人源DNA模板数量要求高的下游检测方法;而富集肠壁脱落细胞后提取能保证提取的DNA全部来源于人,特异性高,抑制性成分去除彻底,但只能获得未凋亡细胞,DNA含量和多样性的损失较大,产量低且成本高。
技术实现要素:
本发明的目的是解决以上提出的问题,提供一种简单快速、成本低、稳定性高的人粪便DNA提取方法。
本发明是通过以下技术方案实现的:
本发明是一种人类粪便DNA提取方法,所述方法包括以下步骤:
步骤一,粪便样品的采集:
人排出粪便后,立即采集2-5g粪便样品放入采集管中,采集管中装有10-15mL粪便保存液,摇匀采集管使粪便样品与粪便保存液充分混匀;
所述粪便保存液成分:0.3-0.6M EDTA,3-6M NaCl,0.3-1.5M Tris;
步骤二,粪便样品的运输:
在常温(22-26℃)或低温(4℃及以下)条件下常规物流运输采集的粪便样品,并在3天内到达实验室进行处理;
步骤三,粪便样品的取样:
粪便样品到达实验室后,充分混匀,吸取800μL-2000μL粪便样本放入离心管中,再次混匀;
步骤四,粪便样本的DNA提取:
(1)细胞沉淀
将装有粪便样本的离心管在10000rpm-13000条件下离心2-5分钟,保留沉淀,去除上清液;
(2)细胞裂解释放DNA
向步骤(1)的离心管中加入800-1000μL粪便裂解液,在68-75℃条件下温育10分钟,裂解肠道脱落细胞,释放DNA至液体中;
所述粪便裂解液成分:0.5-1.2%(m/v)CTAB,0.8-1.4M NaCl,0.08-0.12%(m/v)Tris,10-15mM EDTA,0.1-0.2M异巯基乙醇;
(3)沉淀杂质
将步骤(2)的离心管在10000-13000rpm条件下离心1分钟,此时肠道脱落细胞已经裂解,DNA已释放到上清液中,沉淀多为杂质,将上清液转移至新的离心管中,除去沉淀杂质,若上清中有残留杂质,则转移时弃去颗粒状杂质;
(4)去杂质纯化DNA
在步骤(3)得到的上清液中加入杂质分离液500-600μL,彻底混匀5-10分钟,然后在10000-13000rpm条件下离心5-10分钟,液体分为三层,上层即是含有DNA的溶液,杂质已沉淀至中下层,将上层清液转移至新的离心管中,除去中下层沉淀杂质,此步骤中转移上层清液需在生物安全柜中进行,吸取时保留一部分上层清液防止吸到中层白膜;
所述杂质分离液成分:氯仿;
(5)磁珠结合DNA
向步骤(4)得到的上清液中加入磁珠结合液600-800μL,磁珠30-100μL,室温条件下孵育15-30分钟,得到磁珠混合液;
所述磁珠结合液成分:异丙醇;
(6)磁珠洗涤及DNA洗脱
将步骤(5)得到的磁珠混合液放置于磁力架上3-10分钟,待磁珠彻底吸附后使用磁珠洗涤液清洗2次,加入100-200μL磁珠洗脱液,室温洗脱10分钟后置于磁力架上,待磁珠吸附后,吸取洗脱液到新的离心管中,该洗脱液即为含DNA的溶液。
所述磁珠洗涤液成分:体积分数为75%-80%的乙醇;
所述磁珠洗脱液成分:无核酸酶水。
本发明的有益效果如下:
1、本发明得到的DNA片段长度大于20Kb,OD260/OD280比值大于1.8,可直接用于PCR扩增和其它分子生物学用途。
2、本发明DNA提取过程方便快捷,所得DNA纯度与浓度符合要求,磁珠的应用可大大提高实验通量,可用于粪便DNA提取的自动化应用,迅速从800μL-2000μL体积样品中提取到高质量可用于PCR扩增及高通量测序的DNA。
3、本发明具有较高的重复性及稳定性,在96例样品DNA提取中,只需一次提取即可得到所需的高质量DNA,采用荧光定量PCR法进行细胞内参基因ACTB的扩增,均可产生正常的扩增曲线,且DNA片段大小符合预期。
4、与市售商品化粪便DNA提取试剂盒比较,按照试剂盒要求步骤进行操作,在26个样本中,其平均浓度为67.3ng/μL,OD260/OD280平均比值为1.8,同样的样本使用本发明方法所得平均浓度为172.5ng/μL,OD260/OD280平均比值为1.94;分别取等量的两种方法提取的DNA,采用荧光定量PCR法进行内参基因扩增实验,两者都有正常扩增曲线,且Ct值区别小于1(△Ct<1),说明两种提取方法所得DNA质量无显著性差异。
附图说明
图1:实例1中采用本发明方法提取的粪便总DNA分子量大小分布;
图2:实例3中分别采用商业试剂盒Q方法和本发明方法提取DNA的琼脂糖凝胶电泳图,Q方法拖尾现象严重,DNA有降解,本发明方法则无此现象。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例进行进一步详细说明:
实施例1:
以一正常人粪便为例,实施叙述如下:
步骤一,粪便样品的采集:
采集人刚排出的粪便样品2g放入装有15mL粪便保存液的采集管中,摇匀采集管使粪便样品与粪便保存液充分混匀;
粪便保存液成分:0.4M EDTA,4MNaCl,0.4M Tris;
步骤二,
在常温条件下常规物流运输,将采集的粪便样品送到实验室,3天内到达实验室进行处理即可;
步骤三,粪便样品的取样:
粪便样品到达实验室后,充分混匀,吸取800μL粪便样本放入离心管中,再次混匀;
步骤四,粪便样本的DNA提取:
(1)细胞沉淀
将装有粪便样本的离心管在10000rpm条件下离心5分钟,沉淀肠道脱落细胞到管底,保留沉淀,去除上清液;
(2)细胞裂解释放DNA
向步骤(1)的离心管中加入800μL粪便裂解液,在70℃条件下温育10分钟,裂解肠道脱落细胞,释放DNA至液体中;
粪便裂解液成分:0.9%(m/v)CTAB,1M NaCl,0.09%(m/v)Tris,10mM EDTA,0.1M异巯基乙醇;
(3)沉淀杂质
在常温下将步骤(2)的离心管在10000rpm条件下离心1分钟,此时肠道脱落细胞已经裂解,DNA已释放到上清液中,沉淀多为杂质,将上清液转移至新的离心管中,除去沉淀杂质;
(4)去杂质纯化DNA
在步骤(3)得到的上清液中加入杂质分离液500μL,彻底混匀10分钟,然后在13000rpm条件下离心10分钟,液体分为三层,上层即是含有DNA的溶液,杂质已沉淀至中下层,吸取上层清液转移至新的离心管中,除去中下层沉淀杂质,此步骤中转移上层清液需在生物安全柜中进行,吸取时保留一部分上层清液防止吸到中层白膜;
杂质分离液成分:氯仿;
(5)磁珠结合DNA
向步骤(4)得到的上清液中加入磁珠结合液600μL和磁珠30μL,室温条件下孵育15分钟,得到磁珠混合液;
磁珠结合液成分:异丙醇;
(6)磁珠洗涤及DNA洗脱
将步骤(5)得到的磁珠混合液放置于磁力架上3分钟,待磁珠彻底吸附后使用1mL磁珠洗涤液清洗2次;
然后加入200μL磁珠洗脱液,室温洗脱10分钟后置于磁力架上,待磁珠吸附后,吸取洗脱液到新的离心管中,该洗脱液即为含DNA的溶液;
磁珠洗涤液成分为75%乙醇,磁珠洗脱液成分为无核酸酶水。
采用Qubit仪器测定最后得到溶液的DNA浓度,为145ng/μL,使用Nanodrop2000测定其260/280比值,为1.91。同时对DNA进行毛细管电泳检测,结果见图1。
实施例2:
以一直肠癌患者粪便为例,实施叙述如下:
步骤一,粪便样品的采集:
采集人刚排出的粪便样品5g放入装有15mL粪便保存液的采集管中,摇匀采集管使粪便样品与粪便保存液充分混匀;
粪便保存液成分:0.6M EDTA,5MNaCl,1M Tris;
步骤二,
在常温条件下常规物流运输,将采集的粪便样品送到实验室,在3天内到达实验室进行处理即可;
步骤三,粪便样品的取样:
粪便样品到达实验室后,充分混匀,吸取1000μL粪便样本放入离心管中,再次混匀;
步骤四,粪便样本的DNA提取:
(1)细胞沉淀
将装有粪便样本的离心管在10000rpm条件下离心5分钟,沉淀肠道脱落细胞到管底,保留沉淀,去除上清液;
(2)细胞裂解释放DNA
向步骤(1)的离心管中加入1000μL粪便裂解液,在75℃条件下温育10分钟,裂解肠道脱落细胞,释放DNA至液体中;
粪便裂解液成分:1%(m/v)CTAB,1M NaCl,0.1%(m/v)Tris,15mM EDTA,0.2M异巯基乙醇;
(3)沉淀杂质
在常温下将步骤(2)的离心管在13000rpm条件下离心1分钟,此时肠道脱落细胞已经裂解,DNA已释放到上清液中,沉淀多为杂质,将上清液转移至新的离心管中,除去沉淀杂质;
(4)去杂质纯化DNA
在步骤(3)得到的上清液中加入杂质分离液500μL,彻底混匀10分钟,然后在13000rpm条件下离心10分钟,液体分为三层,上层即是含有DNA的溶液,杂质已沉淀至中下层,将上层清液转移至新的离心管中,除去中下层沉淀杂质,此步骤中转移上清液需在生物安全柜中进行,吸取时保留一部分上层清液防止吸到中层白膜;
杂质分离液成分:氯仿;
(5)磁珠结合DNA
向步骤(4)得到的上清液中加入磁珠结合液800μL和磁珠80μL,室温条件下孵育15分钟,得到磁珠混合液;
磁珠结合液成分:异丙醇;
(6)磁珠洗涤及DNA洗脱
将步骤(5)得到的磁珠混合液放置于磁力架上3分钟,待磁珠彻底吸附后使用1mL磁珠洗涤液清洗2次;
加入200μL磁珠洗脱液,室温洗脱10分钟后置于磁力架上,待磁珠吸附后,吸取洗脱液到新的离心管中,该洗脱液即为含DNA的溶液;
磁珠洗涤液成分为80%乙醇,磁珠洗脱液成分为无核酸酶水。
采用Qubit仪器测定最后得到溶液的DNA浓度,为230ng/μL,使用Nanodrop2000测定其260/280比值为1.98。
实施例3:
以五份不同未知来源人的粪便为例,实施叙述如下:
步骤一,粪便样品的采集:
采集人刚排出的粪便样品2g放入装有15mL粪便保存液的采集管中,摇匀采集管使粪便样品与粪便保存液充分混匀;
粪便保存液成分:0.5M EDTA,6MNaCl,1.2M Tris;
步骤二,
在常温条件下常规物流运输,将采集的粪便样品送到实验室,在3天内到达实验室进行处理即可;
步骤三,粪便样品的取样:
粪便样品到达实验室后,充分混匀,吸取800μL粪便样本放入离心管中,取两份粪便样本,再次吸打混匀;
步骤四,粪便样本的DNA提取:
(1)细胞沉淀
将装有粪便样本的离心管在10000rpm条件下离心5分钟,沉淀肠道脱落细胞到管底,保留沉淀,去除上清液;
(2)细胞裂解释放DNA
向步骤(1)的离心管中加入800μL粪便裂解液,在75℃条件下,温育10分钟,裂解肠道脱落细胞,释放DNA至液体中;
粪便裂解液成分:1.2%(m/v)CTAB,1.2M NaCl,0.08%(m/v)Tris,12mM EDTA,0.2M异巯基乙醇;
(3)沉淀杂质
在常温下将步骤(2)的离心管在13000rpm条件下离心1分钟,此时肠道脱落细胞已经裂解,DNA已释放到上清液中,沉淀多为杂质,将上清液转移至新的离心管中,除去沉淀杂质,若上清中有残留杂质,则转移时弃去颗粒状杂质;
(4)去杂质纯化DNA
在步骤(3)得到的上清液中加入杂质分离液500μL,彻底混匀10分钟,然后在13000rpm条件下离心10分钟,液体分为三层,上层即是含有DNA的溶液,杂质已沉淀至中下层,将上层清液转移至新的离心管中,除去中下层沉淀杂质,此步骤中转移上层清液需在生物安全柜中进行,吸取时保留一部分上层清液防止吸到中层白膜;
杂质分离液成分:氯仿;
(5)磁珠结合DNA
向步骤(4)得到的上清液中加入磁珠结合液800μL和磁珠90μL,室温条件下孵育15分钟,得到磁珠混合液;
磁珠结合液成分:异丙醇;
(6)磁珠洗涤及DNA洗脱
将步骤(5)得到的磁珠混合液放置于磁力架上10分钟,待磁珠彻底吸附后使用1mL磁珠洗涤液清洗2次;
加入200μL磁珠洗脱液,室温洗脱10分钟后置于磁力架上,待磁珠吸附后,吸取洗脱液到新的离心管中,该洗脱液即为含DNA的溶液;
磁珠洗涤液成分为80%乙醇,磁珠洗脱液成分为无核酸酶水。
采用Qubit仪器测定最后得到溶液的DNA浓度平均为97ng/μL,使用Nanodrop 2000测定其260/280比值平均为1.91。同时将同样五份样本用商业试剂盒Q提取粪便,采用其推荐步骤,其浓度为平均为74ng/μL,Nanodrop 2000测定其260/280比值平均为1.89。将两种方法得到的DNA进行琼脂胶电泳比较,结果如图2显示,Q方法DNA有拖尾现象,即DNA有降解现象,本发明方法无此现象。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域中的普通技术人员来说,在不脱离本发明核心技术特征的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。