本发明涉及DNA提取技术领域，尤其涉及一种快速提取基因组DNA的方法。
背景技术：
DNA在生物学实验中是最普遍利用的生物分子。分子生物学的发展，使DNA分子在动物、植物、微生物方面起到举足轻重的作用，这就使得DNA分子的提取方法和效率带来了极大的挑战。而且在实验室环境外的环境中(例如野外)提取DNA的难度很大。传统的方法需要训练好的技术人员和需要离心机等不便携带的机器及其他耗材，并且耗时(1-2h)耗力耗人。传统的方法需要不断的离心，洗脱等繁杂的步骤去除污染物，需要用二氧化硅材质去纯化DNA。尽管有一些顺磁性的介质可以在10min内相对较快的纯化出DNA，但是它需要电子设备，仍然在野外的生物环境下是很复杂的。
最近的有一些方法在尝试，他们利用不同类型的膜，例如三氧化二铝、纤维素为基质的弗林德斯技术、二氧化硅材质的过滤器技术来快速的提取DNA。他们省去了洗脱的步骤，这样他们的优势是：DNA的扩增免遭遇有机相或吸附纯化DNA的材料表面的化学物质，或残留的东西的巨大影响。尽管省去了这洗脱这一步，但是仍然有许多复杂的步骤，复杂的装置，多次吸液的步骤，还有辅助的电子设备。
对比文件1：申请号为“CN201611107846.0”，名称为“一种基因组DNA提取试剂盒及提取方法”，公开了一种基因组DNA提取试剂盒及提取方法，其中基因组DNA提取试剂盒包括消化液、裂解液、纳米磁珠、洗涤液A、洗涤液B和洗脱液；该方法在充分裂解的样本溶液中，加入纳米磁珠可以特异性吸附DNA，该种吸附特异性与DNA结构及片段大小无关。通过洗涤液洗涤去除溶液中的蛋白和盐离子，最后在仅留有特异吸附DNA的磁珠中加入洗脱液，将DNA释放于洗脱液中。磁珠法提取基因组DNA的优点为不使用有毒试剂，操作简单，不易污染。然而磁珠法也存在缺点：时间成本仍然需要30min，尚有提高的空间，且材料成本较高；且操作步骤仍然较复杂，使用移液枪的次数大于5次；样品适用性较窄。
因而，开发一种时间成本和材料成本更低、操作步骤更简单、样品适用性更广的快速提取基因组DNA的方法，成为亟待解决的问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种快速提取基因组DNA的方法，该方法提取基因组DNA的速度快，提取纯化步骤少，操作简便，时间成本和材料成本更低、样品适用性更广。
本发明是这样实现的：
本发明的目的在于提供了一种快速提取基因组DNA的方法，其包括如下步骤：
步骤1、制备用于结合DNA的纤维素滤纸条：将纤维素中速定性滤纸的一部分浸泡在融化的石蜡中，浸过石蜡的滤纸为所述手柄区，另一部分没有浸过石蜡的滤纸为所述核酸结合区；
步骤2、分别配制好裂解液，清洗液，以及洗脱液和/或扩增液；
步骤3、将含目标DNA的样品浸入到所述裂解液中，裂解后得到粗提液；
步骤4、将所述用于结合DNA的纤维素滤纸条浸入到所述步骤3中裂解后的粗提液中结合核酸；
步骤5、将所述用于结合DNA的纤维素滤纸条浸入到装有所述清洗液中，去除杂质；
步骤6、将所述用于结合DNA的纤维素滤纸条浸入到洗脱液中，将核酸洗脱下来，得到目标DNA的粗提液；或者将所述用于结合DNA的纤维素滤纸条直接浸入到扩增液中，将核酸洗脱下来直接用于后续扩增；或者先将所述用于结合DNA的纤维素滤纸条浸入到洗脱液中，再浸入到扩增液中。
优选地，所述裂解液包括溶菌酶，20mM pH 8.0的Tris,25mM Nacl,2.5mM EDTA以及质量分数为0.05％的SDS。裂解液中，加入溶菌酶是为了破碎细胞；EDTA是螯合金属离子，抑制DNAase的活性，防止DNA降解；Tris是为了溶解DNA，pH 8.0更好溶解DNA；裂解液中的SDS为离子型去垢剂，把细胞破碎，使得DNA释放出来。
优选地，所述清洗液包括10mM pH 8.0的Tris,以及质量分数为0.1％的Tween-20。吐温20是一种非离子表面活性剂，可以洗脱蛋白质例如细胞破碎后释放的蛋白质及裂解液中的溶菌酶等，裂解液中的SDS，脂溶性的细菌细胞碎片；Tris可溶解EDTA，核酸等。
优选地，所述洗脱液包括10mM pH＝8.0的Tris、pH＝8.0的超纯水、300nM的氯化钠中的任意一种。
优选地，所述扩增液包括聚合酶体系，ddH20，以及用于扩增目标DNA的引物对。
更优选地，所述扩增液包括2×Taq master mix，ddH20，以及用于扩增目标DNA的引物对；所述扩增的反应体系为：
优选地，所述裂解液中设有若干个用于帮助破碎细胞的钢珠。本发明所用的钢珠购自上海雅联五金机电设备的淘宝店铺。钢珠材质说明：不锈钢材质，直径2mm，无磁性。在震荡的过程中，钢珠与钢珠之间摩擦，产生机械力，使细胞破碎。
优选地，所述裂解液为500μl/管，所述清洗液为1500μl/管，所述清洗液为50-100μl/管。
优选地，所述步骤1中，具体为将WhatmanNo.1滤纸的一半浸泡在融化的石蜡中，浸过蜡的滤纸产生一个疏水区域为所述手柄区；然后将滤纸裁成大于等于39mm的长方形条，其中大于等于35mm的区域有蜡覆盖，而4-6mm区域没有经过蜡处理，后将所述长方形条切割成多个宽2-3mm的小试纸条，多个所述小试纸条上均具有一个核酸结合区和一个手柄区。
这里对本发明所用的所述用于结合DNA的纤维素滤纸条作如下说明：本发明的用于结合DNA的纤维素滤纸条的原料为WhatmanNo.1滤纸，购于上海根生生物有限公司；以纤维素为基质的DNA接合材料是一种理想的材料，因为它很便宜，便携式的，可自由使用的，可修饰的。我们发明了利用纤维素纸在30s内纯化来源于动物，植物，微生物材料的DNA，不需要复杂的过滤，特定的装备，如移液枪，离心机。它是一种简单，无须设备的在实验室内外快速纯化DNA的方法；在现有技术中，在实验室应用范围中，纤维素纸通常用于沉淀物的定性分析分离，例如硫酸铅、草酸钙(热)和碳酸钙；它是纤维素酶活性、钻井液活性黏土、防护布抗性、青霉素、固体废物氯代除草剂测定用标准滤纸。在农业方面，它被用于土壤分析和种子测试等。而本发明为首次采用纤维素滤纸用于基因组DNA的提取，并获得了很好的提取效果。
本发明具有的有益效果是：
1、成份简单，仅含有四种成份，原料安全可靠，且环境友好；
2、本提取方法速度快、操作简便、步骤简洁，本试剂盒利用纤维素纸在30s内即可纯化来源于动物，植物，微生物材料的DNA。
3、利用本提取方法的试剂盒提取DNA，不需要复杂的过滤，特定的装备，如移液枪，离心机；
4、本试剂盒提取的DNA浓度及纯度良好，且提取效果稳定。
总之，本提取方法操作步骤简单，成份少，对操作者要求低，可广泛的应用于来源于动物，植物，微生物材料的DNA纯化及提取。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的快速提取基因组DNA的方法中用于结合DNA的纤维素滤纸条的结构示意图；其中1为核酸结合区，2为手柄区；
图2为本发明实施1提供的快速提取基因组DNA的方法的流程图；
图3为本发明实施例2提供的用所述方法提取的基因组的电泳检测图，模板为大肠杆菌MG1655突变株，扩增的产物为卡那霉素抗生素基因；
图4为本发明实施例3提供的用所述方法提取的基因组的电泳检测图，模板为DH5α(质粒pMal-c2x)，扩增的产物为MalE基因；
图5为本发明实施例4提供的用所述方法提取的基因组的电泳检测图，模板为搜集购买自湖北省疾控中心的C57BL/6J小鼠的粪便，扩增的产物为编码细菌的16sRNA的基因；
图6为本发明实验例提供的所述试剂盒的稳定性测试结果；(a)为0h扩增的电泳检测图；(b)为提取24h时扩增的电泳检测图。
具体实施方式
实施例1快速提取基因组DNA的方法
一、一种快速提取基因组DNA的方法，其包括如下步骤：
1、制备用于结合DNA的纤维素滤纸条：将纤维中速定性滤纸的一部分浸泡在融化的石蜡中，浸过石蜡的滤纸为所述手柄区，另一部分没有浸过石蜡的滤纸为所述核酸结合区；
(1)用于结合DNA的纤维素滤纸条：如图1所示，包括核酸结合区(无石蜡)和手柄区(有石蜡)。
(2)所述用于结合DNA的纤维素滤纸条的制备：
a、材料：WHATMAN No.1纤维中速定性滤纸(购于上海根生生物科技有限公司)高纯度的石蜡paraolastplus，Fluka固体石蜡。
b、方法：将WhatmanNo.1滤纸的一部分浸泡在融化的石蜡(60度左右)中，浸过蜡的滤纸可以防水，产生一个疏水区域。然后将滤纸裁成大于等于39mm的长方形，其中大于等于35mm的区域有蜡覆盖，而4-6mm的区域没有经过蜡处理，随后将这个长方形条切割成宽2-3mm的试纸条，这样每根试纸条上具有一个核酸结合区1(没有蜡的滤纸，长度为4-6mm)和一个手柄区2(泡过蜡，疏水并且好拿，长度大于等于35mm)。
2、分别配制好裂解液，清洗液，以及洗脱液和/或扩增液；
(1)裂解液：包括溶菌酶，20mM pH 8.0的Tris，25mM Nacl，2.5mM pH8.0的EDTA以及质量分数为0.05％的SDS。
(2)清洗液：包括10mM pH 8.0的Tris，以及质量分数为0.1％的Tween-20。
作为以上的实施方式之一，所述裂解液为500μl/管，所述清洗液为1500μl/管。
作为以上的实施方式之一，当所述快速提取基因组DNA的方法不包括扩增液时，可直接用洗脱液洗脱下来结合的基因组DNA，4度冷藏保存。后续如需扩增，操作者可自己分别购买聚合酶体系，ddH20，以及用于扩增目标DNA的引物对。
作为以上的实施方式之一，所述快速提取基因组DNA的方法，还包括所述扩增液时，所述扩增液包括聚合酶体系，ddH20，以及用于扩增目标DNA的引物对。所述用于扩增目标DNA的引物对为常规的通用引物。优选地，作为所述扩增的反应体系为：
作为以上的实施方式之一，所述快速提取基因组DNA的方法，所述扩增液包括聚合酶体系，ddH20；该试剂盒不包括用于扩增目标DNA的引物对，因为有的目标DNA不能用通用引物进行扩增，此时需要操作者自己另外在引物合成公司购买引物对，稀释成10μM，然后分别加入1μl上引物和1μl下引物于所述扩增液中混匀即可。
3、将菌液浸入到含有500微升所述裂解液试管中，所述试剂盒还设有单独包装的钢珠，裂解时将钢珠放入2-3个于所述装有裂解液的试管中，裂解后得到粗提液。
4、将所述用于结合DNA的纤维素滤纸条浸入到所述裂解后的试管中结合核酸。
5、将所述用于结合DNA的纤维素滤纸条浸入到装有清洗液的试管中，去除杂质。
6、为了得到PCR扩增的模板，将所述用于结合DNA的纤维素滤纸条浸入到洗脱液或扩增液中，将核酸洗脱下来。
若放入洗脱液中可直接用洗脱液洗脱下来结合的基因组DNA，4度冷藏保存，备用；
若放入扩增液中稀释后可以直接作为PCR扩增的模板，然后放入PCR仪，设定好扩增程序，来实现目的核酸的扩增。
实施例2
1、取大肠杆菌MG1655突变株(KanR，卡那霉素抗性)的菌液浸入到含有500微升所述裂解液试管中，裂解时将钢珠放入2-3个于所述装有裂解液的试管中，裂解后得到粗提液；大肠杆菌MG1655突变株(KanR，卡那霉素抗性)为华中科技大学生命学院刘智实验室保存。
2、将用于结合DNA的纤维素滤纸条浸入到所述裂解后的试管中结合核酸。
3、将所述用于结合DNA的纤维素滤纸条浸入到装有清洗液的试管中,去除杂质。
4、为了得到PCR扩增的模板，将所述用于结合DNA的纤维素滤纸条浸入到扩增反应液中，将核酸洗脱下来。洗脱液可以直接作为PCR扩增的模板，然后放入PCR仪，设定好扩增程序，来实现目的核酸的扩增。
(1)其中扩增体系为：
其中，所述引物P1序列5’-3’：TGTAGGCTGGAGCTGCTTC(如序列表SEQ NO：1)
引物P2序列5’-3’：TCCTCCTTAGTTCCTATTCC(如序列表SEQ NO：2)
(2)其中扩增程序为：
94℃预变性10min；
94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min；30个循环；
最后再72℃延伸10min；于4℃放置2h
5、将扩增完成的产物进行电泳检测，扩增产物为卡那霉素抗生素基因，其大小为：1466bp(如序列表SEQ NO：3)；电泳检测结果如图3所示，条带大小与预期一致。且将所述产物用于测序得到的序列比对后，确定为卡那霉素抗生素基因。图3中，1泳道的PCR模板为30s提取基因组原液，2泳道的模板为所述基因组原液稀释10倍，3泳道的模板为所述基因组原液稀释100倍，4泳道为所述基因组原液稀释1000倍，5泳道为ddH2O(作为阴性对照)，6泳道为水裂解基因组(本发明的裂解液中裂解菌液后，然后直接把裂解后的菌液加入扩增液中扩增，即省去了纤维素滤纸条的吸附以及后面的去杂质的过程)；7泳道则为直接将菌液加到扩增液中进行扩增的产物；1泳道(1号加样孔)都没有扩增出目的条带，是由于此处把吸附有基因组的纤维素条洗杂后直接放到扩增反应液里了(未经过洗脱液洗脱这一步骤)，残留的裂解液的成分对PCR反应有抑制作用；2、3、4泳道经过稀释后，残留的裂解液的成分对PCR反应的抑制作用减小，因而能扩增出条带，这里看到2泳道的条带最粗，因而推断稀释10倍是最合适的。6泳道为水裂解基因组(本发明的裂解液中裂解菌液后，然后直接把裂解后的菌液加入扩增液中扩增，即省去了纤维素滤纸条的吸附以及后面的去杂质的过程)，虽能扩增出目标带，但是杂质较多；7泳道直接将菌液加到扩增液中进行扩增，得到的目标条带细，浓度稀。对于大肠杆菌MG1655突变株(KanR，卡那霉素抗性)的样品，扩增的KanR基因是特异性存在的，其他的细菌中不会存在，因而具备特异性，不会存在假阳性。
实施例3
1、取质粒pMal-c2x的菌液浸入到含有500微升所述裂解液试管中，裂解时将钢珠放入2-3个于所述装有裂解液的试管中，裂解后得到粗提液；DH5α(质粒pMal-c2x)为华中科技大学生命学院刘智实验室保存。
2、将用于结合DNA的纤维素滤纸条浸入到所述裂解后的试管中结合核酸。
3、将所述用于结合DNA的纤维素滤纸条浸入到装有清洗液的试管中，去除杂质。
4、为了得到PCR扩增的模板，将所述用于结合DNA的纤维素滤纸条浸入到扩增反应液中，将核酸洗脱下来。洗脱液可以稀释后直接作为PCR扩增的模板，然后放入PCR仪，设定好扩增程序，来实现目的核酸的扩增。
(1)其中扩增体系为：
其中，所述引物pMal-check-F序列5’-3’：TGCGCCGACATCATAACG(如序列表SEQ NO：4)
引物pMal-check-R序列5’-3’：TGCGCAACTGTTGGGAAG(如序列表SEQ NO：5)
(2)其中扩增程序为：
94℃预变性10min；
94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min；30个循环；
最后再72℃延伸10min；于4℃放置2h
5、将扩增完成的产物进行电泳检测，扩增产物为MalE基因，其大小为：
1516bp(如序列表SEQ NO：6)；电泳检测结果如图4所示，条带大小与预期一致。且将所述产物用于测序得到的序列比对后，确定为MalE基因。图4中，1泳道的PCR模板为30s提取基因组原液，2泳道的模板为所述基因组原液稀释10倍，3泳道的模板为所述基因组原液稀释100倍，4泳道为所述基因组原液稀释1000倍，5泳道为空白对照，6泳道为ddH2O(作为阴性对照)，6泳道为水裂解基因组(本发明的裂解液中裂解菌液后，然后直接把裂解后的菌液加入扩增液中扩增，即省去了纤维素滤纸条的吸附以及后面的去杂质的过程)；1泳道(1号加样孔)都没有扩增出目的条带，是由于此处把吸附有基因组的纤维素条洗杂后直接放到扩增反应液里了(未经过洗脱液洗脱这一步骤)，残留的裂解液的成分对PCR反应有抑制作用；2、3、4泳道经过稀释后，残留的裂解液的成分对PCR反应的抑制作用减小，因而能扩增出条带，这里看到2泳道的条带最粗，因而推断稀释10倍是最合适的。7泳道为水裂解基因组(本发明的裂解液中裂解菌液后，然后直接把裂解后的菌液加入扩增液中扩增，即省去了纤维素滤纸条的吸附以及后面的去杂质的过程)，虽能扩增出目标带，但是杂质较多。
实施例4
1、搜集购买自湖北省疾控中心的C57BL/6J小鼠的粪便浸入到含有500微升所述裂解液试管中，裂解时将钢珠放入2-3个于所述装有裂解液的试管中，裂解后得到粗提液。
2、将用于结合DNA的纤维素滤纸条浸入到所述裂解后的试管中结合核酸。
3、将所述用于结合DNA的纤维素滤纸条浸入到装有清洗液的试管中，去除杂质。
4、为了得到PCR扩增的模板，将所述用于结合DNA的纤维素滤纸条浸入到扩增反应液中，将核酸洗脱下来。洗脱液可以直接作为PCR扩增的模板，然后放入PCR仪，设定好扩增程序，来实现目的核酸的扩增。
(1)其中扩增体系为：
其中，所述引物是16srRNA的通用引物：
27F：AGA GTT TGATCC TGG CTCAG(如序列表SEQ NO：7)；
1492R：GGT TAC CTT GTTACGACT T(如序列表SEQ NO：8)；
(2)其中扩增程序为：
94℃预变性10min；
94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min；30个循环；
最后再72℃延伸10min；于4℃放置2h
5、将扩增完成的产物进行电泳检测，扩增产物为细菌的16sRNA，其大小为：PCR产物约1518bp(如序列表SEQ NO：9)；电泳检测结果如图5所示，条带大小与预期一致。且将所述产物用于测序得到的序列比对后，确定为细菌的16sRNA。粪便的样品是扩增的细菌的16sRNA，因为每个细菌都会有这个基因，所以经过此方法会扩增出目的条带，这相当于一个普遍的可以提取的多种菌的混合物的基因组。图5中，1泳道的PCR模板为30s提取基因组原液，2泳道的模板为所述基因组原液稀释10倍，3泳道的模板为所述基因组原液稀释100倍，4泳道为ddH2O(作为阴性对照)，5泳道为水裂解基因组(本发明的裂解液中裂解菌液后，然后直接把裂解后的菌液加入扩增液中扩增，即省去了纤维素滤纸条的吸附以及后面的去杂质的过程)；6泳道则为直接将菌液加到扩增液中进行扩增的产物；1泳道(1号加样孔)都没有扩增出目的条带，是由于此处把吸附有基因组的纤维素条洗杂后直接放到扩增反应液里了(未经过洗脱液洗脱这一步骤)，残留的裂解液的成分对PCR反应有抑制作用；2、3泳道经过稀释后，残留的裂解液的成分对PCR反应的抑制作用减小，因而能扩增出条带，这里看到2泳道的条带最粗，因而推断稀释10倍是最合适的。5泳道为水裂解基因组(本发明的裂解液中裂解菌液后，然后直接把裂解后的菌液加入扩增液中扩增，即省去了纤维素滤纸条的吸附以及后面的去杂质的过程)，虽能扩增出目标带，但是杂质较多。6泳道直接将菌液加到扩增液中进行扩增，不能得到目标条带。
实验例试剂盒的相关性能测定
一、取实施例2-实施例4中提取的样品，以无菌去离子水为空白，用超微量分光光度计(Spectrophotometer：NanoDrop2000)测定波长为230nm、260nm和280nm的吸光度值，即A230、A260和A280，按照NanoDrop2000仪器使用说明书进行测定。利用纯dsDNA的A260/A280和A260/A230比值，评估提取DNA的纯度，以及测定DNA含量，本发明的试剂盒及其方法提取得到的DNA纯度和含量测定见表1。
表1
由表1可知，本发明实施例1提供的基因组DNA快速提取试剂盒可用于提取实施例2的样品(模板为大肠杆菌MG1655突变株KanR，卡那霉素抗性，即以基因组为模板)、实施例3中的样品(模板为DH5a，质粒pMal-c2x，即以质粒为模板)、实施例4中的样品(粪便，扩增的细菌的16sRNA)，均具有较好的浓度的纯度。
二、稳定性测定
取实施例2中的提取的产物：大肠杆菌MG1655突变株(KanR，卡那霉素抗性)，4℃冰箱保存24h后，再做PCR，结果显示基因组会有部分降解。如图6所示，(a)为0h扩增的电泳检测图；(b)提取24h时扩增的电泳检测图。其中(a)图为实施例2中的图3，其泳道1-7与图3一样；(b)图中1泳道的模板为所述基因组原液稀释10倍，2泳道的模板为所述基因组原液稀释100倍，3泳道为所述基因组原液稀释1000倍，4泳道为ddH2O(作为阴性对照)；图6可知基因组虽会有少部分降解，但稳定性仍较好。
三、本发明提供的基因组DNA快速提取试剂盒与传统试剂盒、磁珠吸附法的对比
表2
由表2可知，本发明提供的一种基因组DNA快速提取试剂盒，提取基因组DNA的速度快，提取纯化步骤少，操作简便，时间成本和材料成本更低、样品适用性更广，可适用于粪便中细菌的基因组，由于细菌感染的叶片等含有细菌的样品以及实验室纯培养的细菌。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中科技大学鄂州工业技术研究院
<120> 一种快速提取基因组DNA的方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtaggctgg agctgcttc 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcctccttag ttcctattcc 20
<210> 3
<211> 1466
<212> DNA
<213> KanR基因(KanR)
<400> 3
tgtaggctgg agctgcttcg aagttcctat actttctaga gaataggaac ttcggaatag 60
gaacttcaag atcccctcac gctgccgcaa gcactcaggg cgcaagggct gctaaaggaa 120
gcggaacacg tagaaagcca gtccgcagaa acggtgctga ccccggatga atgtcagcta 180
ctgggctatc tggacaaggg aaaacgcaag cgcaaagaga aagcaggtag cttgcagtgg 240
gcttacatgg cgatagctag actgggcggt tttatggaca gcaagcgaac cggaattgcc 300
agctggggcg ccctctggta aggttgggaa gccctgcaaa gtaaactgga tggctttctt 360
gccgccaagg atctgatggc gcaggggatc aagatctgat caagagacag gatgaggatc 420
gtttcgcatg attgaacaag atggattgca cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag 480
gctattcggc tatgactggg cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg 540
gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa 600
tgaactgcag gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc 660
agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc 720
ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga 780
tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa 840
acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct 900
ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca aggcgcgcat 960
gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt 1020
ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta 1080
tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga 1140
ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg 1200
ccttcttgac gagttcttct gagcgggact ctggggttcg aaatgaccga ccaagcgacg 1260
cccaacctgc catcacgaga tttcgattcc accgccgcct tctatgaaag gttgggcttc 1320
ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg atcctccagc gcggggatct catgctggag 1380
ttcttcgccc accccagctt caaaagcgct ctgaagttcc tatactttct agagaatagg 1440
aacttcggaa taggaactaa ggagga 1466
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgcgccgaca tcataacg 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgcgcaactg ttgggaag 18
<210> 6
<211> 1516
<212> DNA
<213> MalE基因(MalE)
<400> 6
tgcgccgaca tcataacggt tctggcaaat attctgaaat gagctgttga caattaatca 60
tcggctcgta taatgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagccag 120
tccgtttagg tgttttcacg agcacttcac caacaaggac catagcatat gaaaatcgaa 180
gaaggtaaac tggtaatctg gattaacggc gataaaggct ataacggtct cgctgaagtc 240
ggtaagaaat tcgagaaaga taccggaatt aaagtcaccg ttgagcatcc ggataaactg 300
gaagagaaat tcccacaggt tgcggcaact ggcgatggcc ctgacattat cttctgggca 360
cacgaccgct ttggtggcta cgctcaatct ggcctgttgg ctgaaatcac cccggacaaa 420
gcgttccagg acaagctgta tccgtttacc tgggatgccg tacgttacaa cggcaagctg 480
attgcttacc cgatcgctgt tgaagcgtta tcgctgattt ataacaaaga tctgctgccg 540
aacccgccaa aaacctggga agagatcccg gcgctggata aagaactgaa agcgaaaggt 600
aagagcgcgc tgatgttcaa cctgcaagaa ccgtacttca cctggccgct gattgctgct 660
gacgggggtt atgcgttcaa gtatgaaaac ggcaagtacg acattaaaga cgtgggcgtg 720
gataacgctg gcgcgaaagc gggtctgacc ttcctggttg acctgattaa aaacaaacac 780
atgaatgcag acaccgatta ctccatcgca gaagctgcct ttaataaagg cgaaacagcg 840
atgaccatca acggcccgtg ggcatggtcc aacatcgaca ccagcaaagt gaattatggt 900
gtaacggtac tgccgacctt caagggtcaa ccatccaaac cgttcgttgg cgtgctgagc 960
gcaggtatta acgccgccag tccgaacaaa gagctggcaa aagagttcct cgaaaactat 1020
ctgctgactg atgaaggtct ggaagcggtt aataaagaca aaccgctggg tgccgtagcg 1080
ctgaagtctt acgaggaaga gttggcgaaa gatccacgta ttgccgccac tatggaaaac 1140
gcccagaaag gtgaaatcat gccgaacatc ccgcagatgt ccgctttctg gtatgccgtg 1200
cgtactgcgg tgatcaacgc cgccagcggt cgtcagactg tcgatgaagc cctgaaagac 1260
gcgcagacta attcgagctc gaacaacaac aacaataaca ataacaacaa cctcgggatc 1320
gagggaagga tttcagaatt cggatcctct agagtcgacc tgcaggcaag cttggcactg 1380
gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt 1440
gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct 1500
tcccaacagt tgcgca 1516
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 9
<211> 1518
<212> DNA
<213> C57BL/6J小鼠(C57BL/6J)
<400> 9
ggacgaacgc tggcggcgtg cctaatacat gcaagtcgaa cgcttctttc ctcccgagtg 60
cttgcactca attggaaaga ggagtggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctaccc 120
atcagagggg gataacactt ggaaacaggt gctaataccg cataacagtt tatgccgcat 180
ggcataagag tgaaaggcgc tttcgggtgt cgctgatgga tggacccgcg gtgcattagc 240
tagttggtga ggtaacggct caccaaggcc acgatgcata gccgacctga gagggtgatc 300
ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt 360
cggcaatgga cgaaagtctg accgagcaac gccgcgtgag tgaagaaggt tttcggatcg 420
taaaactctg ttgttagaga agaacaagga cgttagtaac tgaacgtccc ctgacggtat 480
ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag 540
cgttgtccgg atttattggg cgtaaagcga gcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa 600
agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactggga gacttgagtg cagaagagga 660
gagtggaatt ccatgtgtag cggtgaaatg cgtagatata tggaggaaca ccagtggcga 720
aggcggctct ctggtctgta actgacgctg aggctcgaaa gcgtggggag caaacaggat 780
tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta agtgttggag ggtttccgcc 840
cttcagtgct gcagcaaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacgacc gcaaggttga 900
aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc 960
aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctttgacca ctctagagat agagctttcc 1020
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ctagcgagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc 1200
ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atgggaagta caacgagtcg ctagaccgcg 1260
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cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca cccgaagtcg gtgaggtaac 1440
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gccgtatcgg aaggtggg 1518