本发明涉及一种细菌质粒抽提的前处理试剂盒以及方法。
背景技术
质粒是能够在活细胞中自我复制的核酸分子。质粒介导的水平基因转移被认为是细菌多样性和适应的主要驱动力。随着研究的不断深入，质粒已被广泛应用于基因研究工具中。质粒dna的提取是分子生物学中的一项关键技术，是克隆、转染和基因治疗等分子技术中必不可少的环节。从细菌中研究发现新的质粒具有非常重要的作用。
革兰氏阳性菌由于细胞壁中含有肽聚糖，交联度高，难以裂解，导致革兰氏阳性菌的质粒提取非常困难，特别是许多植物乳杆菌菌株中的一个或几个个天然质粒，提取更是困难。现有文献中报道了玻璃珠结合短涡旋时间有助于克服裂解困难，但是操作复杂，成本高。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种细菌质粒抽提的前处理试剂盒以及方法。
本发明细菌质粒抽提的前处理试剂盒，它包括如下组分：
a组分：80-160mg/ml溶菌酶；
b组分：洗涤液；
所述a组分为100mg/ml溶菌酶。
所述洗涤液为4～6％葡萄糖溶液或者溶液i；所述溶液i是添加有10mmol/ledta、50mmol/l葡萄糖、100μg/mlrnasea的tris-hcl溶液，其中tris-hcl溶液的浓度为25mmol/l。
所述葡萄糖溶液的浓度为5％。
本发明还提供了一种细菌质粒抽提试剂盒，它包如下组分：
(一)前述的前处理试剂盒；
(二)质粒提取试剂盒。
所述组分(二)为碱裂解法提取质粒的试剂盒。
所述碱裂解法提取质粒的试剂盒包括如下成分：
溶液i：添加有10mmol/ledta、50mmol/l葡萄糖、100μg/mlrnasea的tris-hcl溶液，其中，tris-hcl溶液的浓度为25mmol/l；
溶液ii：添加有1％(w/v)sds的浓度为250mmol/l的naoh溶液；
溶液iii：醋酸钾和醋酸的混合溶液，醋酸钾的浓度3mol/l，醋酸的浓度为5mol/l；
溶液iv：每1l含有10mmoltris-hcl以及0.80l乙醇，其余为水(ph7.5)；
溶液v：10mmol/l的tris-hcl溶液。
本发明还提供了一种细菌质粒抽提的前处理方法，它是采用权利要求1～4任意一项所述的前处理试剂盒处理，步骤如下：用a组分处理细菌菌体，然后用b组分洗涤，即可。
本发明还提供了一种细菌质粒抽提方法，它是采用前述的试剂盒抽提，步骤如下：按照前述方法进行前处理，再使用质粒提取试剂盒提取。
本发明提供了一种细菌质粒抽提的前处理试剂盒和方法，该试剂盒和方法可以有效提高细菌质粒的提取效率，特别是对植物乳杆菌的提取效果非常优良，可以克服现有方法无法有效提取革兰氏阳性菌质粒的问题，具有广阔的市场应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：用7种方案提取植物乳杆菌pc518质粒dna的琼脂糖凝胶电泳图。
图2：7种方案提取植物乳杆菌pc518质粒dna的浓度测定结果。
图3：通过我们的改良方法和革兰氏阳性细菌质粒分离试剂盒(solarbio，北京，中国)获得的质粒dna的比较图。a、质粒dna的浓度、b、琼脂糖凝胶电泳的质粒dna。泳道1和2：植物乳杆菌pc518的质粒dna；泳道3和4：植物乳杆菌9l15的质粒dna；泳道5和6：食窦魏斯氏菌m2的质粒dna；泳道7和8：植物乳杆菌js193的质粒dna；泳道9和10：植物乳杆菌410的质粒dna。质粒dna由solarbio革兰氏阳性菌质粒分离试剂盒(奇数道)或我们的改良方法(偶数道)获得。
具体实施方式
实施例1、本发明细菌质粒抽提的前处理试剂盒以及方法
1、试剂盒组成
a组分：100mg/ml溶菌酶
b组分：5％(指5g/100ml)葡萄糖溶液
2、使用方法
取细菌，加入100mg/ml溶菌酶，再在37℃下孵育10分钟，溶菌酶处理后，将悬浮液在11000×g，室温下离心1分钟；再洗涤两次，步骤如下：将沉淀在500μl的5％葡萄糖溶液中轻轻悬浮，11000×g离心1分钟，将上清液弃去。
实施例2、本发明细菌质粒抽提的前处理试剂盒以及方法
1、试剂盒组成
a组分：120mg/ml溶菌酶
b组分：4％葡萄糖溶液
2、使用方法
取细菌，加入150mg/ml溶菌酶，再在37℃下孵育10分钟，溶菌酶处理后，将悬浮液在11000×g，室温下离心1分钟；再洗涤两次，步骤如下：将沉淀在500μl的5％葡萄糖溶液中轻轻悬浮，11000×g离心1分钟，将上清液弃去。
实施例3、本发明细菌质粒抽提的前处理试剂盒以及方法
1、试剂盒组成
a组分：160mg/ml溶菌酶
b组分：5％葡萄糖溶液
2、使用方法
取细菌，加入200mg/ml溶菌酶，再在37℃下孵育10分钟，溶菌酶处理后，将悬浮液在11000×g，室温下离心1分钟；再洗涤两次，步骤如下：将沉淀在500μl的5％葡萄糖溶液中轻轻悬浮，11000×g离心1分钟，将上清液弃去。
实施例4、本发明细菌质粒抽提的前处理试剂盒以及方法
1、试剂盒组成
a组分：80mg/ml溶菌酶
b组分：25mmol/ltris-hcl(ph8.0)，10mmol/ledta，50mmol/l葡萄糖，100μg/mlrnasea
2、使用方法
取细菌，加入100mg/ml溶菌酶，再在37℃下孵育10分钟，溶菌酶处理后，将悬浮液在11000×g，室温下离心1分钟；再洗涤两次，步骤如下：将沉淀在500μl的溶液i中轻轻悬浮，11000×g离心1分钟，将上清液弃去。
实施例5、本发明细菌质粒抽提试剂盒以及方法
1、试剂盒组成
(1)前处理试剂盒
实施例1～4记载的任意一种试剂盒；
(2)裂解试剂盒
溶液i：25mmol/ltris-hcl(ph8.0)，10mmol/ledta，50mmol/l葡萄糖，100μg/mlrnasea
溶液ii：250mmol/lnaoh，1％(w/v)sds(十二烷基硫酸钠)；
溶液iii：3mol/l醋酸钾，5mol/l醋酸；
溶液iv：ph7.510mmol/ltris-hcl，80％乙醇；
溶液v：10mmol/ltris-hclph7.5。
2、使用方法
(1)前处理
采用实施例1～4记载的任意一种试剂盒，按照实施例1～4记载的对应的方法进行处理；
(2)裂解
①向250μl溶液i重新悬浮的菌体中加入250μl溶液ii(成分：250mmol/lnaoh，1％(w/v)sds(十二烷基硫酸钠))，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
②向离心管中加入350μl溶液iii(成分：3mol/l醋酸钾，5mol/l醋酸)，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。13,400×g离心10min。
③将上清液转移到吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。13,400×g离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
④向吸附柱中加入500μl溶液iv(成分：ph7.510mmol/ltris-hcl，80％乙醇)，13,400×g离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
⑤向吸附柱中加入50μl溶液v(组分：10mmol/ltris-hclph7.5)，13,400×g离心1min，得到质粒溶液。
以下通过试验例的方式来说明本发明的有益效果。
试验例1、本发明细菌质粒抽提方法
1实验菌株
从中国泡菜中分离出的植物乳杆菌pc518、410、9l15和js193菌株。食窦魏斯氏菌(weissellacibaria)m2菌株是从大熊猫肠道中分离出来的。在静态厌氧条件下，菌株在mrs培养基中37℃培养20小时。
植物乳杆菌pc518、410、9l15和js193菌株、食窦魏斯氏菌(weissellacibaria)m2菌株，均为临床分离菌株，经过鉴定确定为植物乳杆菌和食窦魏斯氏菌(weissellacibaria)。
2条件筛选
2.1筛选方法
2.1.1溶菌酶处理与去除
本研究共有7个方案。在无菌的eppordf管中收获8毫升培养液(植物乳杆菌pc518)，11000×g离心1分钟，沉淀用于质粒提取。溶菌酶处理与去除方案如表1所示。
表1.7个植物乳杆菌pc518菌体的溶菌酶处理与去除方案
a：在溶液i中加入终浓度为100mg/ml的溶菌酶；b：在溶液i中加入终浓度为10mg/ml的溶菌酶；c：在无菌水中配制；d:250μl溶液i成分。
在250μl溶液i(溶液i：25mmol/ltris-hcl(ph8.0)，10mmol/ledta，50mmol/l葡萄糖，100μg/mlrnasea)中加入100mg/ml或10mg/ml溶菌酶，再在37℃或50℃下孵育10分钟或30分钟，溶菌酶处理后，将悬浮液在11000×g，室温下离心1分钟。最后，为了完全除去溶菌酶，洗涤两次：将沉淀在500μl的5％葡萄糖溶液或溶液i中轻轻悬浮，11000×g离心1分钟，将上清液弃去。
2.1.2质粒提取
①向250μl溶液i重新悬浮的菌体中加入250μl溶液ii(成分：250mmol/lnaoh，1％(w/v)sds(十二烷基硫酸钠))，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
②向离心管中加入350μl溶液iii(成分：3mol/l醋酸钾，5mol/l醋酸)，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。13,400×g离心10min。
③将上清液转移到吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。13,400×g离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
④向吸附柱中加入500μl溶液iv(成分：ph7.510mmol/ltris-hcl，80％乙醇)，13,400×g离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
⑤向吸附柱中加入50μl溶液v(组分：10mmol/ltris-hclph7.5)，13,400×g离心1min，得到质粒溶液。
2.1.3质粒测定
质粒dna通过水平电泳系统(bio-rad美国)琼脂糖凝胶电泳进行评价。条带的数目和亮度代表所提取的质粒dna的质量和产量。此外，质粒dna由nanodrop2000分光光度计(thermoscientific,，美国)在260和280nm处定量。优质dna的a260/a280比例为1.8-2.0。
2.2筛选结果
琼脂糖凝胶电泳结果表明，用p1、p2和p3方案提取的质粒dna的质量和产量均高于p4、p5、p6和p7方案。很明显，p1、p2和p3方案的泳道上有8-9个可识别的条带，p4、p5和p6方案的泳道上只有3-5个弱带，并且p7方案的泳道上的带是弥散的。此外，在p1、p2和p3方案的泳道中，p2方案的泳道的条带是最亮的，p1方案的泳道的条带是最弱的(图1)。
7种方案提取的质粒dna的a260/a280比值均在1.8～2.0之间。p1、p2和p3方案的质粒dna的浓度均高于p4、p5和p6方案所提取的质粒。除p7方案所提取的质粒外，p2方案提取的质粒浓度最高，p5方案提取的质粒dna浓度最低(图2)。分光光度计的测定结果与琼脂糖凝胶电泳结果基本一致。
当溶菌酶处理浓度较高并且溶菌酶在碱裂解步骤前被除去时，质粒dna的产量和质量显著增加，例如使用了100mg/ml溶菌酶并且增加了溶菌酶去除步骤的p1、p2和p3方案；如果像p5方案一样仅仅提高溶菌酶处理浓度，就不会取得良好效果。
在37℃溶菌酶处理下，p1、p2、p3、p4、p5和p6的质粒dna的质量均优于50℃p7方案所提取的质粒dna(图1)。推测温度升高会导致细胞的生存危机，并产生自我消耗现象。p1和p2方案的唯一区别是溶菌酶处理的持续时间，结果表明溶菌酶处理的延长不利于质粒的提取。溶菌酶消化时间在37℃超过20分钟，会导致质粒的丢失(cataloluk，2003)。长溶菌酶处理允许内源性核酸酶变为活性(ledeboeretal.,1976)。
含有5％葡萄糖的洗涤溶液可以调节膜透性，并通过渗透压平衡控制细胞内内容物的释放。使用含有5％葡萄糖的洗涤溶液的p2方案比使用不含5％葡萄糖的洗涤溶液的p3方案获得更好的结果。
因此，本发明在使用100mg/ml溶菌酶处理后，通过5％葡萄糖或者溶液i洗涤去除溶菌酶后，再进行碱裂解处理提取质粒，提取得到的质粒dna浓度高，可以实现有效提取的目的，本发明优选的溶菌酶处理方式为p2的方式：在250μl溶液i中加入100mg/ml，再在37℃下孵育10分钟，溶菌酶处理后，将悬浮液在11000×g，室温下离心1分钟，为了完全除去溶菌酶，洗涤两次：将沉淀在500μl的5％葡萄糖溶液中轻轻悬浮，11000×g离心1分钟，将上清液弃去。
3商用试剂盒比较
3.1方法
分别用革兰氏阳性菌质粒分离试剂盒(solarbio，北京，中国)和本发明优选方法(按照2.1.1节中p2的方式处理后，再按照2.1.2节处理)提取植物乳杆菌pc518、410、9l15和js193菌株以及食窦魏斯氏菌m2菌株的质粒dna。用琼脂糖凝胶电泳和分光光度计测定质粒dna。
3.2结果
与革兰氏阳性菌质粒分离试剂盒(solarbio，北京，中国)相比，我们改进的方法具有更高的质粒提取效率。当我们使用改良方法时，凝胶上的条带更多更明亮，图3b)，质粒浓度更高(图3a)。与商用试剂盒相比，试验菌株的质粒浓度分别提高了10.6、9.5、1.5、6和5.6倍。
实验结果说明，本发明可以有效提高细菌质粒的提取效率，其中，对植物乳杆菌的提取效果较佳。
综上，本发明通过特定的前处理方式显著提高了质粒提取效率，应用前景优良。