四连接素模拟肽TNP及其应用的制作方法

本发明涉及生物医药技术领域，涉及一种四连接素模拟肽tnp及其应用，具体涉及一种四连接素模拟肽tnp及其在制备治疗血管内皮细胞释放hmgb1引起疾病的药物中的应用。

背景技术

脓毒症是感染触发的宿主反应所引起的多器官功能衰竭。全球每年有约三千万患者,病死率达20-70%。因此在2017年被世界卫生大会确定为人类健康的重大威胁。

急性肾损伤（acutekidneyinjury，aki）是指患者血清中的肌酐水平在48小时内增加到0.3毫克/100毫升或者在7天内增加50%。aki是住院患者，尤其是重症病房的常见病，病死率约18.9-46.5%。aki有感染性和非感染性的原发病因，其中肾缺血是最常见的非感染性病因，而脓毒症（感染引起的器官功能障碍）是最常见的感染性病因。

过度炎症反应是造成脓毒症和急性肾损伤的重要机制。细胞外高迁移率族蛋白b1（highmobilitygroupbox1，hmgb1）作为一个促炎症因子在脓毒症和aki等疾病的发病过程中起重要作用。hmgb1在生理状态下主要存在于细胞核内，但细胞在受到感染或炎症过程的生物因子刺激后可能主动向细胞外释放hmgb1。另外，受损伤或者坏死的细胞由于细胞结构的解体会被动释放hmgb1。所以，主动或者被动释放都将导致细胞外hmgb1水平的提高。

在体内绝大多数组织存在的血管内皮细胞在炎症过程中主动和/或被动释放hmgb1，并参与脓毒症、呼吸窘迫综合症、急性肾损伤、以及其它缺血性组织损伤、脉管炎、血管硬化和栓塞等疾病过程（rauvalahandrouhiainena.physiologicalandpathophysiologicaloutcomesoftheinteractionsofhmgb1withcellsurfacereceptors.biochim.biophys.acta.2010jan-feb;1799(1-2)164-170）。因此，抑制血管内皮细胞释放降低细胞外hmgb1的水平可以降低脓毒症小鼠模型的死亡率和减少这些疾病过程中的组织损伤。

四连接素（tetranectin，tn）在三十年前被报道是纤溶酶原结合蛋白，为三叠体结构，由三条完全相同的多肽链通过非共价键连接而成。tn存在于多种组织和细胞中，已报道其与多种疾病相关，如肿瘤、外周非肿瘤疾病、中枢神经系统疾病等，但是，至目前为止，tn的功能及作用机制扔不清楚，尤其是在脓毒症或急性肾损伤病理过程中的作用尚未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种四连接素模拟肽tnp，对其序列的氮端和/或碳端分别进行化学修饰，可减缓模拟肽在体内的降解，延长其半衰期，提高其生物效能。

本发明的另一目的是提供一种四连接素模拟肽tnp在制备治疗血管内皮细胞释放hmgb1引起疾病的药物中的应用。

本发明研究内容受到中国国家自然科学基金（批准号：81671959），中国国家自然科学基金委员会-河南省人民政府联合基金（批准号：u1704171）和河南大学人才特区特聘教授启动经费的支持。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种四连接素模拟肽，命名为tnp，其模拟区域是四连接素tn中从164起第164到191、共28个氨基酸（即qpdggktencavlsgaangkwfdkrcrd），四连接素模拟肽tnp的氨基酸序列的氮端和/或碳端进行了化学修饰，是为了减缓模拟肽在体内的降解，从而达到延长其半衰期和提高生物效能的目的。

进一步地，所述四连接素模拟肽tnp的氨基酸序列的氮端和或氮端进行的化学修饰包括包括乙酰化、生物素化、甲基化、烷基化、醛基化、醇基化、磷酸化、双硫化、乙胺化、琥珀酰化、螯合或酯化中的一种。

进一步地，所述四连接素模拟肽tnp的氨基酸序列的氮端进行的化学修饰为乙酰化，所述四连接素模拟肽tnp的氨基酸序列的碳端进行的化学修饰为生物素化（biotin，即维生素h）。碳端进行了生物素化，可以使用酶标的链霉亲和素检测。由于在碳端标记生物素需要有ε-氨基与生物素的羧基结合，本发明在模拟肽的碳端连接一个赖氨酸（氨基酸代号为k）。故氮端进行了乙酰化的四连接素模拟肽tnp的序列为ac-qpdggktencavlsgaangkwfdkrcrdk-biotin。

应理解，对四连接素模拟肽tnp氨基酸序列的氮端和/碳端进行的化学修饰，并不仅限于本发明列举的上述几种方式，目前本领域技术人员所熟知的氨基酸序列的化学修饰方法都应涵盖在本发明公开范围之内。

本发明还提供上述四连接素模拟肽tnp在制备治疗血管内皮细胞释放hmgb1引起疾病的药物中的应用。

进一步地，所述疾病包括脓毒症、脑缺血、肝缺血、急性肾损伤、血管粥样硬化、脉管炎、急性肺损伤和呼吸窘迫综合症。

进一步地，所述药物的剂型为口服剂型、贴附剂或注射剂。

进一步地，所述药物的给药方式为口服、吸入、皮下注射、贴附、静脉注射或腹腔注射中的一种。

进一步地，所述药物的施用对象为哺乳动物，优选为人类，药物应还包括治疗脓毒症或缺血性肾损伤药物的药学上可接受的药物载体。

应理解，血管内皮细胞释放hmgb1引起的疾病并不仅限于本发明列举的上述几种疾病，目前本领域技术人员所熟知的血管内皮细胞释放hmgb1引起的疾病都应涵盖在本发明公开范围之内。

本发明的有益效果为：

1.本发明提供的四连接素模拟肽tnp，其氮端进行了化学处理，如乙酰化处理，在其应用于治疗脓毒症等疾病的药物时，可有效地阻止tnp水解，延长其半衰期以提高药物的生物效能；其碳端进行了生物素化，便于进行药物动力学研究。

2.本发明通过蛋白免疫印迹法，进一步通过建立小鼠脓毒症模型及肾缺血模型，说明tnp可以有效抑制血管内皮细胞释放hmgb1，减少细胞外hmgb1的浓度，来降低脓毒症小鼠死亡率，可几乎完全阻断肾缺血再灌注小鼠血浆中尿素氮和肌酐的变化，减少缺血后肾小管坏死，达到治疗急性肾损伤及其他疾病的目的，为人类因血管内皮细胞释放hmgb1引起疾病的诊断与治疗提供了新的途径。

附图说明

图1是四连接素（tn）与脓毒症或急性肾损伤病理过程具有相关性。

图2是本发明四连接素模拟肽tnp对血管内皮细胞释放炎症因子hmgb1的影响。

图3是本发明四连接素模拟肽tnp的乙酰化对tnp水解的影响。

图4是本发明四连接素模拟肽tnp对脓毒症小鼠死亡率的影响。

图5是本发明四连接素模拟肽tnp对小鼠肾缺血再灌注血浆中尿素氮和肌酐水平的影响。

图6本发明四连接素模拟肽tnp对肾缺血后肾小管坏死的影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规或按照制造商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同、此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法和材料仅作示范之用。本发明所涉及的tnp由南京金斯瑞生物科技有限公司和上海淘普生物科技有限公司合成，质控和提供。

实施例1四连接素tn与脓毒症或急性肾损伤病理过程的相关性

实验分别选取正常人（10例）、肺炎患者（27例）、脓毒症患者（37例）、肾衰竭患者（17例），采用蛋白免疫印迹法（westernblotting,liwetal.(2018)connexin43hemichannelasanovelmediatorofsterileandinfectiousinflammatorydiseases.scientificreports8(1):166）检测血浆中tn的水平，分离出0.25μl血浆蛋白，血浆蛋白在质量浓度为12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和转移至醋酸纤维膜后使用抗tn抗体显示的tn蛋白条带结果如图1所示，图1中左侧条带图（即图1中a1、a2、b）中条带颜色的深浅反映蛋白量的不同，其灰度值代表tn蛋白的相对量（右侧条形图）。

图1可以表明，肺炎患者血浆中tn水平显著低于正常人（见图1中a1），而且脓毒症患者血浆中tn水平显著低于肺炎患者（见图1中a2），肾衰患者血浆中tn水平也低于正常人（见图1中b）。由此可见，tn与脓毒症或急性肾损伤病理过程具有一定相关性。

实施例2四连接素模拟肽tnp抑制血管内皮细胞释放炎症因子hmgb1

人脐带血管内皮细胞培养基的具体成分为dulbecco’smodifiedeagle’smedium,即dmem，其中含有20%的胎牛血清，100单位/毫升的青霉素和100微克/毫升的链霉素。细胞在使用不含血清和抗生素的dmem冲洗后分为对照组（cont，不添加任何成分），tnp组（含有20微克/毫升的tnp），lps组（含1微克/毫升的细菌内毒素lps）和tnp+lps组（含有20微克/毫升的tnp和1微克/毫升的lps。在20小时后，分别收集培养基并浓缩，然后使用免疫印迹法显示其中的hmgb1，如图2所示（样本数n=4，p＜0.01），图中hmgb1的水平以条带的灰度值为代表（见图2下）。

由图2可知，没有加入tnp或lps的细胞培养基（即cont）只含有很低水平的hmgb1；只加入tnp的培养基中（即tnp）几乎检测不到hmgb1；经过lps刺激的培养基（即lps）含有大量的hmgb1；同时加入tnp和lps的培养基（即tnp+lps）中hmgb1的水平显著低于lps组。这些结果说明tnp可以有效抑制血管内皮细胞释放hmgb1，减少细胞外hmgb1的浓度。

实施例3四连接素模拟肽tnp的乙酰化可有效防止tnp水解

该实验用出生后8周的balb/c雄性小鼠（体重约25克）8只。在小鼠腹腔注射tnp（按8mg/kg体重）后，分别在15min、30min、1h、2h，将小鼠处死，取血，离心分离提取血浆，并用电泳法分离。然后通过辣根过氧化物酶耦合的链霉亲和素（streptavidin-hrp）与tnp中生物素（biotin）的结合检测血浆中的tnp，结果如图3所示。

由图3可知，在注射tnp15分钟后，小鼠血浆内的tnp水平最高，说明腹腔注射后，tnp能很快被吸收进入循环系统，然后随时间推移逐渐降低，但在注射2小时后仍可检测到。由于没有检测到更小分子量的生物素信号，提示四连接素模拟肽tnp的乙酰化有效地防止了tnp的水解，而且tnp的清除可能主要依靠泌尿系统。

实施例4四连接素模拟肽tnp可显著降低脓毒症小鼠的死亡率

脓毒症模型是通过常用的阑尾结扎后穿孔造成急性腹膜炎的方法在balb/c小鼠上制作。手术结束时间为脓毒症计时起始点。动物在不同时间的存活率等于该时间点的存活数与手术结束时的小鼠数量的比值。

实验小鼠为60只年龄为8周的雄性balb/c小鼠，分注射生理盐水的对照组（saline），tnp(8mg/kg体重)低剂量组和tnp（16mg/kg体重）高剂量组。盐水或不同剂量的tnp在手术2小时和20小时后两次通过腹腔注射给药（箭头提示注射时间）。小鼠在术后的存活率（图4）显示，在脓毒症发生后，腹腔注射tnp剂量依赖性地降低脓毒症小鼠的死亡率（*p<0.05）。

实施例5四连接素模拟肽tnp减少小鼠肾缺血再灌注血浆中尿素氮和肌酐水平

肾缺血模型是急性肾损伤的常用模型。小鼠肾缺血再灌注（renalischemia-reperfusion，rir）可以造成与人类肾缺血类似的组织损伤。该模型涉及通过结扎肾门血管造成缺血，然后解除结扎恢复肾血液供应。该实验使用年龄为8周的balb/c雄性小鼠21只，分成3组。经历相同手术步骤但没有肾血管结扎的手术对照组（sham，5只），在rir后2小时和20小时分别在腹腔注射等体积的生理盐水的rir组（8只）和在rir后同时间注射等体积tnp(8mg/kg体重)的rir+tnp组（8只）。在手术24小时后，小鼠被处死，取血，离心提取血浆，检测其中的尿素氮（bun）和肌酐（creatinine）水平，结果如图5所示。

由图5可知，肾缺血发生后，rir组中小鼠血浆的尿素氮和肌酐的水平显著提高，但rir+tnp组中小鼠血浆的尿素氮和肌酐的水平与对照组小鼠sham基本一样，说明腹腔注射tnp几乎完全阻断肾缺血再灌注小鼠血浆中尿素氮和肌酐的变化。

实施例6四连接素模拟肽tnp能够显著减少肾缺血后肾小管坏死

肾缺血模型和实验分组同实施例6。sham是手术对照。在术后24小时，小鼠被处死，通过左心室福尔马林灌注固定后，摘除肾脏，石蜡切片，h&e染色，拍照。使用双盲法确定坏死和非坏死肾小管的总数，并计算坏死肾小管（necrotic）占总肾小管数量（totaltubes）的比例，结果如图6所示。由图6可知，腹腔注射tnp的（即rir+tnp）小鼠坏死肾小管数量比单纯肾缺血再灌注组（即rir）减少约50%，说明tnp能够显著减少缺血后肾小管坏死。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明实施范围，故凡依本发明专利范围所述技术方案所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。