一种用于脱除展青霉素的纳米材料的合成与应用的制作方法

本发明属于分析化学技术领域，尤其涉及一种用于脱除展青霉素的纳米材料的合成与应用。

背景技术：

展青霉素(patulin，pat)，是由青霉菌属(penicillium)、曲霉菌属(aspergillus)、丝衣霉菌属(byssochlamys)等丝状真菌产生的具有毒性的次级代谢产物。据研究调查发现，pat对于果蔬类食品的污染是全球范围性的，包括美国、日本、英国、加拿大、西班牙、法国等地方都曾检测出pat含量超标。pat主要侵染果实表面的损伤处，因而常存在于霉烂的瓜果蔬菜之中。由于苹果汁呈酸性，而pat在低ph环境下拥有一定的热稳定性，因此巴氏杀菌很难将它除去。其在80℃温度条件下加热20min后仍有45％残存，所以pat引入苹果汁及其他苹果制品中的概率很大

分子印迹技术(molecularimprintingtechnique，mit)是指在分子水平上刻印、复制目标分子的结构、大小、形状，制备出具有特异性识别能力的分子印迹聚合物(molecularimprintedpolymer，mip)。近些年，分子印迹技术广泛应用在众多领域，然而目前未曾有过适用于检测展青霉素的分子印迹材料。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种用于脱除展青霉素的纳米材料的合成与应用，以便得到能够识别并特异性结合展青霉素的纳米材料并将其应用于工业生产中，用于脱除苹果汁中的展青霉素。

本发明提出的一种用于脱除展青霉素的纳米材料的合成方法，采用2-吲哚酮为替代模板，丙烯酰胺为功能单体，以fe3o4@sio2@cs-go磁性纳米粒子为载体，通过表面印迹法制备磁性分子印迹纳米材料。

进一步的，磁性分子印迹纳米材料的制备方法包括：fe3o4磁性核心的制备；fe3o4@sio2纳米粒子的制备；fe3o4@sio2纳米粒子的氨基化及fe3o4@sio2@cs纳米粒子的合成；go载体与fe3o4@sio2@cs纳米粒子的结合；表面印迹法合成fe3o4@sio2@cs-go@mip。

进一步的，fe3o4磁性核心的制备方法为：将fecl3·6h2o溶解于乙二醇中，加入无水乙酸钠和柠檬酸三钠，连续搅拌0.5～2h，将此反应液在160～250℃温度下，反应2～5h，常温冷却后即可得到fe3o4母液。

进一步的，fecl3·6h2o的浓度为20～30g/l。

进一步的，无水乙酸钠和柠檬酸三钠的浓度分别为50～65g/l。

进一步的，在fe3o4母液中外加磁铁，将黑色fe3o4纳米颗粒与母液分离，再用超纯水和无水乙醇洗涤，最终分散在超纯水中。

进一步的，fe3o4@sio2纳米粒子的制备方法为：取fe3o4磁性液体加入无水乙醇，逐滴添加氨水(nh3·h2o)，反应30min，然后逐滴添加正硅酸四乙酯(teos)，反应2～5h，得到fe3o4@sio2核壳式纳米粒子分散液。

进一步的，氨水的加入量为8～15ml/l。

进一步的，正硅酸四乙酯的加入量为3.5～5ml/l。

进一步的，fe3o4@sio2纳米颗粒的氨基化：将3-氨丙基三甲氧基硅烷(aptms)逐滴添加到上述fe3o4@sio2分散液中，搅拌1～3h，得到氨基化的fe3o4@sio2纳米颗粒。

进一步的，fe3o4@sio2@cs纳米粒子的合成步骤中包括cs乙酸溶液的制备方法：将cs粉末置于2％的乙酸中，加热搅拌使其溶解，得到浓度为8～15g/l的cs乙酸溶液。

进一步的，fe3o4@sio2@cs-go纳米颗粒的制备方法：将氨基化的fe3o4@sio2分散液同cs乙酸溶液混合，在45～60℃温度下水浴恒温加热搅拌0.5～2h，然后再添加go分散液，继续搅拌0.5～2h，最后将温度升高到70～90℃，逐滴滴入质量分数为5％的戊二醛溶液，即得到的fe3o4@sio2@cs-go纳米颗粒。

进一步的，戊二醛的加入量为0.4～0.6ml/ml。

进一步的，fe3o4@sio2@cs-go@mip的合成中还包括模板分子、功能单体预组装液的配制：将2-吲哚酮与丙烯酰胺，加入到乙腈和甲苯的混合液中，磁力搅拌2h，得到模板分子、功能单体的预组装液备用。

进一步的，2-吲哚酮的浓度为2～3.5g/l。

进一步的，丙烯酰胺的浓度为8～12g/l。

进一步的，混合液中乙腈和甲苯的体积比为(2～5)：1。

进一步的，fe3o4@sio2@cs-go@mip的合成中还包括丙烯酸修饰fe3o4@sio2@cs-go的步骤：取fe3o4@sio2@cs-go无水乙醇分散液，超声分散的同时向体系内滴加丙烯酸，反应1.5～3h，最后用乙腈、甲苯混合溶液分散。

进一步的，丙烯酸的浓度为40～60ml/l。

进一步的，混合溶液中，乙腈、甲苯的体积比为(2～5)：1。

进一步的，fe3o4@sio2@cs-go@mip的合成：将修饰有乙烯基的fe3o4@sio2@cs-go分散液加入到预组装液中分散，再依次添加交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯(egdma)，引发剂偶氮二异丁腈(aibn)，将整个反应体系密封，氮吹脱气15min，最后在60℃温度下水浴加热24h，清洗后，经冷冻干燥得到灰黑色的磁性纳米颗粒。

进一步的，二甲基丙烯酸乙二醇酯的加入量为0.1～0.3mol/l。

进一步的，偶氮二异丁腈的加入量为0.3～0.5g/l。

进一步的，采用索氏抽提法对模板分子进行洗脱，洗脱液选用体积比为(8～10)：1的甲醇和乙酸的混合溶液。

本发明的另一个目的是提出上述纳米材料在脱除展青霉素中的应用。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明采用2-oxin为替代模板，am为功能单体，以合成的fe3o4@sio2@cs-go磁性纳米粒子为载体，通过表面印迹法制备了特异性针对于pat吸附的磁性mip。fe3o4的加入使得最终制备的分子印迹吸附材料具有磁性，有利于材料与基质间的分离，免去了过滤、离心等繁杂的操作步骤，方便材料的回收。但是fe3o4容易发生氧化反应且彼此间容易团聚，所以sio2作为保护层，包裹在fe3o4表面来增加磁性颗粒的稳定性与分散性。cs的加入不仅作为一种连接媒介将磁性纳米颗粒与go交联，而且提高了纳米粒子的生物相容性，且其表面的氨基(-nh2)、羟基(-oh)基团也可对pat起到一定的辅助吸附效果。go巨大的比表面积则增加了磁性mip对pat的吸附能力。将本发明制得的分子印迹纳米材料用于展青霉素的脱除，取得了良好的脱除效果。

附图说明

图1是实施例1中各纳米粒子的tem图：(a、f)fe3o4；(b、g)fe3o4@sio2；(c、h)fe3o4@sio2@cs；(d、i)fe3o4@sio2@cs-go；(e、j)fe3o4@sio2@cs-go@mip；(标尺：a、b、c：200nm；d、e、f、g、h：500nm；i、j：1μm)。

图2是实施例1中各纳米粒子的红外光谱图：(a)fe3o4、(b)fe3o4@sio2、(c)fe3o4@sio2@cs、(d)fe3o4@sio2@cs-go、(e)fe3o4@sio2@cs-go@mip。

图3(a)是实施例1中fe3o4和fe3o4@sio2@cs-go@mip的n2吸附-脱附等温线图；图3(b)是fe3o4@sio2@cs-go@mip的孔径分布如图。

图4是实施例2中fe3o4@sio2@cs-go@mip和fe3o4@sio2@cs-go@nip对pat的吸附动力学曲线。

图5是实施例2中fe3o4@sio2@cs-go@mip对pat的等温吸附曲线。

图6是实施例2中pat、5-hmf的色谱图。

图7是实施例2中pat、5-hmf的标准曲线图。

图8是实施例2中fe3o4@sio2@cs-go@mip与fe3o4@sio2@cs-go@nip对pat及5-hmf的吸附量图。

图9是实施例2中fe3o4@sio2@cs-go@mip对pat的吸附率与重复使用次数的关系图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

氧化石墨烯(go)分散液购自先丰纳米材料有限公司。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

一、fe3o4纳米粒子的制备

称取0.81gfecl3·6h2o置于35ml的乙二醇(eg)中，磁力搅拌至fecl3·6h2o固体颗粒完全溶解，再加入2g无水乙酸钠和0.75g柠檬酸三钠，连续搅拌1h，获得棕黄色反应液。将此反应液转移并密封在50ml聚四氟乙烯反应釜中，200℃温度下，反应4h，常温冷却后即可得到fe3o4母液。然后外加磁铁，将黑色fe3o4纳米颗粒与母液分离，再用超纯水和无水乙醇先后各清洗三遍，最终分散在超纯水中备用。

二、fe3o4@sio2的制备

取上述fe3o4磁性液体10ml(fe3o4的浓度为20mg/ml)，加入100ml无水乙醇，用机械搅拌器将纳米粒子分散均匀，逐滴添加1mlnh3·h2o，反应30min，然后在保持剧烈搅拌的同时，逐滴添加0.5mlteos，反应4h，得到fe3o4@sio2核壳式纳米粒子分散液。

三、fe3o4@sio2@cs-go的制备

1.fe3o4@sio2氨基化

将20μl的3-氨丙基三甲氧基硅烷(aptms)逐滴添加到上述fe3o4@sio2分散液中，搅拌2h，得到-nh2化的fe3o4@sio2纳米颗粒，外加磁铁收集，并在超纯水和无水乙醇清洗后，分散在超纯水里。

2.cs乙酸溶液的制备

称取1g壳聚糖(cs)粉末，置于100ml2％的乙酸中，加热搅拌使其溶解，得到cs乙酸溶液。

3.fe3o4@sio2@cs-go的合成

将20ml-nh2化的fe3o4@sio2分散液(fe3o4@sio2的浓度为16mg/ml)同20mlcs乙酸溶液混合，在50℃温度下水浴恒温加热搅拌1h，然后再添加1.7ml氧化石墨烯(go)分散液，继续搅拌1h，最后将温度升高到80℃，逐滴滴入20ml质量分数为5％的戊二醛溶液。所得到的fe3o4@sio2@cs-go纳米颗粒经超纯水和无水乙醇清洗后分散在无水乙醇中。

四、fe3o4@sio2@cs-go@mip的制备

1.模板分子、功能单体预组装液的配制

称取0.133g的2-吲哚酮(2-oxin)与0.517g的丙烯酰胺(am)，加入到50ml乙腈和甲苯的混合液中(4:1)，磁力搅拌2h，得到模板分子、功能单体的预组装液备用。

2.丙烯酸修饰fe3o4@sio2@cs-go磁性载体

为了使mip在载体基质上稳定合成，对载体表面进行修饰已成为表面印迹法的关键步骤。取20mlfe3o4@sio2@cs-go无水乙醇分散液(fe3o4@sio2@cs-go的浓度为16mg/ml)，超声分散的同时向体系内滴加1ml丙烯酸(aa)，反应2h，最后用10ml乙腈、甲苯(4:1)溶液分散。

3.fe3o4@sio2@cs-go@mip的聚合

将10ml修饰有乙烯基的fe3o4@sio2@cs-go分散液(fe3o4@sio2@cs-go的浓度为10mg/ml)加入上述预组装液中超声分散，再依次添加10mmol交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯(egdma)，25mg引发剂偶氮二异丁腈(aibn)。将整个反应体系密封，氮吹脱气15min，最后在60℃温度下水浴加热24h，清洗后，经冷冻干燥得到灰黑色的磁性mip。

4.fe3o4@sio2@cs-go@mip模板分子的洗脱

采用索氏抽提法对模板分子进行洗脱。洗脱液选用甲醇和乙酸的混合溶液(9:1)。将冷冻干燥后的磁性mip置于索氏提取装置中，配制200ml洗脱液加入圆底烧瓶内，在80℃的温度下进行索氏抽提，每隔12h更换一次洗脱液，连续洗脱48h，直到萃取液中检测不到2-oxin的存在。

图1是合成过程中fe3o4、fe3o4@sio2、fe3o4@sio2@cs、fe3o4@sio2@cs-go、fe3o4@sio2@cs-go@mip这5种纳米粒子的tem表征结果。如图1(a)、(f)所示，fe3o4成黑色圆球结构，粒径大致为269nm。外包有sio2后，其形貌如图1(b)、(g)所示，从图中可以很明显观察到sio2壳层的存在，且粒径增大，约为351nm。图1(c)、(h)是fe3o4@sio2@cs的tem表征图，从图中可以看出外包cs后，壳层加厚，粒径进一步增大，约为397nm，cs包覆层边缘不如sio2包覆层规整。且由于cs具有粘性，如图1(h)所示，fe3o4@sio2@cs纳米粒子相互黏连，排列紧密。也正是凭借cs具有的丰富活性基团和粘性，使得fe3o4@sio2@cs更易与go结合。fe3o4@sio2@cs-go形貌如图1(d)、(i)所示，从图中可以观察到fe3o4@sio2@cs纳米颗粒存在于go片层结构中，由此可证明两者结合成功。图1(e)、(j)为fe3o4@sio2@cs-go@mip的tem图，从图中边缘处可以发现磁性mip中形成的特异性孔穴结构。

图2是合成过程中(a)fe3o4、(b)fe3o4@sio2、(c)fe3o4@sio2@cs、(d)fe3o4@sio2@cs-go、(e)fe3o4@sio2@cs-go@mip的红外光谱图。观察图2(a)～(e)，所有样品在597cm^-1波数下都存在一个强烈的吸收峰，此峰为fe-o基团特征吸收峰，表明fe3o4始终存在于整个反应过程中，使纳米颗粒保持磁性。与图2(a)相比，图2(b)～(e)在1091cm^-1处增加了sio2的特征吸收峰，其代表的是si-o-si伸缩振动，证明sio2壳层包被成功。图2(c)～(e)中，cs-nh2基团的特征吸收峰在1556cm^-1、1625cm^-1处，为nh3+弯曲振动峰，表明cs层的顺利包覆。将图2(d)与图2(c)相比较，发现图2(d)在1734cm^-1处有c＝o伸缩振动峰，这是来自于go中的-cooh基团，证实了fe3o4@sio2@cs纳米粒子与go载体的成功结合。在fe3o4@sio2@cs-go@mip的红外光谱图中(如图2(e)所示)，交联剂egdma的c-o对称、非对称伸缩振动峰显示在1249cm^-1、1302cm^-1处，ch2和ch3中的c-h伸缩振动峰体现在2850cm^-1、2906cm^-1处；另外，位于3000cm^-1～3600cm^-1间的n-h和o-h伸缩振动峰，峰形变宽、变钝，表明fe3o4@sio2@cs-go@mip聚合时形成了分子间氢键，这也应证了磁性mip的成功合成。

fe3o4和fe3o4@sio2@cs-go@mip的n2吸附-脱附等温线如图3(a)所示，fe3o4@sio2@cs-go@mip的孔径分布如图3(b)所示。相比较于fe3o4，fe3o4@sio2@cs-go@mip拥有更大的比表面积和更大的孔容积(如表1所示)。且根据bjh模型分析计算得出fe3o4@sio2@cs-go@mip的介孔孔径大多分布在11.5nm左右，这有利于磁性mip对目标分子pat的吸附。

表1比表面积和总孔容积

对比例1

非磁性分子印迹聚合物fe3o4@sio2@cs-go@nip的制备方法与磁性分子印迹聚合物fe3o4@sio2@cs-go@mip的制备方法相一致，只是不加入模板分子2-oxin。

实施例2

一、展青霉素的检测方法

采用hplc对pat的含量进行测定。将25mgpat标品用4ml乙腈溶解，得到浓度为6250mg/l的pat母液，配制pat加标苹果汁(pat浓度为100mg/l)以及一组10mg/l、50mg/l、100mg/l、150mg/l、200mg/l、250mg/l标准工作溶液。

样品前处理方法：外加磁铁，使磁性mip与苹果汁溶液分离。将苹果汁澄清液倒入50ml具塞试管中，加入10ml乙酸乙酯，涡旋震荡1min后静置分层，取上层有机相于另一个试管中，重复上述提取操作三次，合并有机相，然后加入5ml2％无水碳酸钠溶液对提取液净化，并称取1g无水硫酸钠使提取液脱水，过滤。将滤液于40℃温度下水浴，用n2缓和吹干，乙腈复溶。

液相色谱条件：色谱柱采用c18反相柱(agilent)，流动相为含0.1％醋酸的20％乙腈水溶液，检测器为紫外检测器，检测波长为275nm，柱温为30℃，进样量是5μl，pat的保留时间为6.427min，采用外标峰面积法定量。

二、动力学吸附实验

准确称取7组fe3o4@sio2@cs-go@mip和fe3o4@sio2@cs-go@nip吸附材料各100mg，分别置于25ml具塞锥形瓶中，加入10mlpat浓度为100mg/l的pat苹果汁溶液，在室温25℃温度下，水浴恒温震荡吸附。在不同的时间点(4h、8h、12h、16h、20h、24h、28h)选择对应样品，经前处理后，用hplc测其上清液中pat含量。

如图4所示，随着吸附时间的延长，fe3o4@sio2@cs-go@mip和fe3o4@sio2@cs-go@nip两者对pat的吸附量都在逐渐的增加，直到吸附24h后，吸附量才没有明显的变化。相比之下，聚合过程中加入模板分子的磁性mip比没有加入模板分子的磁性nip呈现出更好的吸附效果。在室温25℃温度下，fe3o4@sio2@cs-go@mip的饱和吸附量为fe3o4@sio2@cs-go@nip饱和吸附量的3.5倍。这取决于fe3o4@sio2@cs-go@mip中所形成的特异性吸附位点。

三、等温吸附实验

准确称取3组(每组8份)fe3o4@sio2@cs-go@mip吸附材料100mg，分别置于25ml具塞锥形瓶中，加入10ml不同浓度的pat加标果汁(30mg/l、50mg/l、70mg/l、90mg/l、100mg/l、110mg/l、120mg/l、130mg/l)，在不同温度下(25℃、35℃、45℃)水浴恒温震荡吸附24h。选择对应样品，经前处理后，用hplc测其上清液中pat含量。

图5为fe3o4@sio2@cs-go@mip在25℃、35℃、45℃温度下对pat的等温吸附曲线。如图5可知，磁性mip的平衡吸附量随着pat初始浓度以及温度的提高而增加，表明此吸附过程为吸热反应。

四、选择吸附性实验

配制pat与5-羟甲基糠醛(5-hmf)的标准溶液(浓度梯度都为10mg/l、50mg/l、100mg/l、150mg/l、200mg/l、250mg/l)，利用得到的色谱图信息绘制pat与5-hmf的标准曲线，如图6、7所示。准确称取fe3o4@sio2@cs-go@mip及fe3o4@sio2@cs-go@nip吸附材料各100mg，分别置于25ml具塞锥形瓶中，加入10ml含有pat、5-hmf的苹果汁混合溶液(浓度各为100mg/l)，在室温25℃温度下，水浴恒温震荡吸附24h。选择对应样品，经前处理后，用hplc测其上清液中pat含量。

如图8所示，fe3o4@sio2@cs-go@mip由于表面存在针对于pat的特异性结合位点，其对pat的吸附量明显高于对5-hmf的吸附量，而fe3o4@sio2@cs-go@nip由于表面没有形成针对于pat的特异性吸附孔穴，因此对pat的吸附量较低，与对5-hmf的吸附量相近。

五、重复利用实验

准确称取100mgfe3o4@sio2@cs-go@mip吸附材料，置于25ml具塞锥形瓶中，加入10mlpat浓度为100mg/l的pat苹果汁溶液，在室温25℃温度下，水浴恒温震荡吸附24h。外加磁铁对材料进行回收，经洗脱处理后再置于新的pat加标果汁溶液中。重复以上吸附、洗脱过程5次，取各样品上层清液，经前处理后，用hplc测得pat含量。

如图9所示，fe3o4@sio2@cs-go@mip磁性分子印迹吸附材料在重复使用两次后仍可以保持良好的吸附特性，重复使用5次后，磁性分子印迹材料对pat的吸附率稍有下降，吸附率与初次使用相比，下降了23.93％。这可能是由于洗脱过程的不完全，造成模板分子的残留，影响了吸附效果，也可能是因为多次的吸附震荡和洗脱抽提对磁性mip空间结构造成了一定的影响，特异性结合位点受到区域性损坏。不过相比于非分子印迹聚合物fe3o4@sio2@cs-go@nip，fe3o4@sio2@cs-go@mip还是展现出了对pat优良的吸附特性。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。