本发明涉及核磁共振技术领域，尤其是涉及一种由三芳基甲基自由基与氮氧自由基组成的双自由基化合物及其盐、其制备方法和应用。
背景技术
核磁共振技术是用于物质化学结构表征的重要手段，广泛应用于化学，材料学，生物化学等领域，尤其是固态核磁共振技术使得生物大分子如蛋白质分子的结构解析成为可能，但其应用受限于固有低灵敏度。针对这一缺陷，目前有两方面的努力，一方面是提高仪器的磁场强度，进而提高热平衡下核的极化率，但该方法的费用昂贵，技术要求高；另一方面是通过动态核极化(dnp)技术使核的极化效率提高，从而增强信号强度，提高灵敏度。极化剂的选用是动态核极化实验的关键，直接决定了dnp的信号增强倍数。现有极化试剂的dnp增强倍数远远低于理论值(1h，658倍；13c，2600倍)。
自从60年前dnp技术首次被提出，所有的实验都依赖于单自旋中心，例如用氮氧自由基tempo和金属原子作为极化来源。目前对于dnp技术而言，最有效的机制为ce(crosseffect)机制，而ce机制与电子间的偶极相互作用与自旋相互作用密切相关。2003年，kan-nianhu和robertg.griffin首次提出双氮氧自由基的概念，将两个tempo用peg链连接，使得偶极相互作用增强，相对于单氮氧自由基信号强度提高4倍。从此，双氮氧自由基开始作为dnp极化剂受到关注。然而，氮氧自由基仍存在稳定性不好，水溶性较差，单峰线宽仍较宽，弛豫时间不长和交换相互作用较弱的问题，并且双氮氧自由基在魔角旋转的条件下存在核的去极化效应，这使双氮氧自由基dnp效率减弱，高场dnp增强效果不佳，限制了动态核极化技术的发展，使固态核磁共振灵敏度的提高受限。
根据氮氧双自由基用作dnp极化剂的相关研究，证实电子弛豫时间、交换相互作用、水溶性等因素均会影响极化剂的dnp性质。对于双氮氧自由基而言，通过延长弛豫时间可有效提高dnp增强倍数，相关研究表明，对于氮氧双自由基而言，弛豫时间已达到最优化条件，已没有可提升的空间。研究证实交换相互作用与极化剂的高场dnp性质有密切联系，tn双自由基具有明显强于氮氧双自由基的交换相互作用，使得其在高场没有核的去极化效应(氮氧双自由基去极化效应明显)，这也是其高场dnp性质优于氮氧双自由基的重要因素，故适度增强交换相互作用也是tn双自由基极化剂设计的一个重要考虑因素。在低温下，极化剂存在自聚集现象，使得极化转移损失，转移效率降低，故提高水溶性，增强极化剂在溶液中的分散度，也是优化极化剂的一个有效方法。
技术实现要素：
本发明要解决的问题是提供一种三芳基甲基自由基与氮氧自由基组成的双自由基化合物及其盐、其制备方法和应用，该类化合物稳定性好，水溶性佳，其dnp增强倍数高，可有效增强固态核磁共振的灵敏度。
为解决上述技术问题，本发明的一个目的是提供一种由三芳基甲基自由基与氮氧自由基组成的双自由基化合物及其盐，其结构式由下述式1表示：
其中，
r1选自h或c1-c18饱和烷基中的一种，c1-c18饱和烷基表示含有1-18个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基等，优选的，r1为h或ch3；
r2选自h、c1-c6饱和烷基和天然氨基酸或非天然氨基酸的相应侧链取代基中的一种，c1-c6饱和烷基表示含有1-6个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基等，天然氨基酸或非天然氨基酸的相应侧链取代基指：氨基酸通式
r3选自h、c1-c18饱和烷基或(ch2ch2o)nh中的一种，1≤n≤20，c1-c18饱和烷基表示含有1-18个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基等，优选的，r3为h或(ch2ch2o)nh中的一种，1≤n≤20，更优选的，r3为h或(ch2ch2o)2h；
r4、r5相同或不同的选自烷基或r4与r5相连形成
r6为ch3、cd3、ch2ch2oh或同碳上的两个r6相连形成环状结构，优选的，r6为ch3、cd3或同碳上的两个r6相连为环状结构。
该化合物通过连接链将氮氧自由基与三芳基甲基自由基(trityl)相连，形成了同时具有氮氧自由基和三芳基甲基自由基的双自由基极化剂。氮氧自由基-三芳基甲基自由基型双自由基相比双氮氧自由基主要有以下几方面的优势：首先，对于高场dnp而言，ce(crosseffect)机制为最有效的机制，当电子自旋频率之差与核的拉曼频率相匹配时，ce机制可实现效率最大化，而氮氧自由基-三芳基甲基自由基型双自由基的频率匹配性优于双氮氧自由基，故其ce效率更高。其次，双氮氧自由基在魔角旋转的条件下存在核的去极化效应，这使其dnp效率减弱，但对于该氮氧自由基-三芳基甲基自由基型双自由基并没有去极化效应，这使其高场dnp增强效果优于双氮氧自由基。另外，实验结果提示，氮氧自由基-三芳基甲基自由基型双自由基与氮氧双自由基比较，其所具有的较强的交换相互作用明显区别于氮氧双自由基，并且之前有文献报道，对于高场dnp，偶极相互作用的影响非常小，起主导作用的是交换相互作用，因此，较强的交换相互作用也使该化合物具有相比于氮氧双自由基化合物更高的高场dnp增强倍数。但交换相互作用也不是越强越好，只有当交换相互作用恰到好处时，才能使dnp效率最大化。最后，三芳基甲基自由基具有良好的水溶性，且可修饰位点丰富，可用于不同用途的功能衍生化。
技术方案中，优选的，r1、r2和r3不同时为氢或r4、r5和r6不同时为甲基，优选的，r1、r2和r3不同时为氢。根据氮氧双自由基用作dnp极化剂的相关研究，证实电子弛豫时间、交换相互作用、水溶性等因素均会影响极化剂的dnp性质，结合双自由基的弛豫时间、交换相互作用以及水溶性，1)r1、r2和r3基团的修饰可适度提高交换相互作用；2)r4、r5、r6基团的修饰可提高双自由基的弛豫时间，其中r4与r5相连形成
技术方案中，优选的，天然氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸或谷氨酸，非天然氨基酸为肌氨酸或叔亮氨酸。
技术方案中，优选的，环状结构为取代或未取代的四元环、五元环或六元环，优选的，所述环状结构为环丁烷、环戊烷、环己烷、四氢呋喃、四氢吡喃、硫代环戊烷、环丁醇、环戊醇或环己醇，更优选的，所述环状结构为四氢吡喃或环己醇。
技术方案中，优选的，由下式2-10之一表示：
技术方案中，优选的，由下式3-7之一表示：
本发明的另一目的是提供一种制备上述的双自由基化合物及其盐的方法，包括：
第一步、使具有式a1结构的化合物与具有式a2结构的化合物发生酸胺缩合反应得到具有式a3结构的化合物；
第二步、使具有式a3结构的化合物与具有式a4结构的化合物发生酸胺缩合反应得到双自由基化合物及其盐
技术方案中，优选的，所述第一步中包括将化合物a1与a2溶于第一溶剂中，加入第一缩合剂和第一催化剂进行酸胺缩合反应，所述第一溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、苯、甲苯、n，n-二甲基甲酰胺、n，n-二甲基乙酰胺、二甲亚砜、四氢呋喃和乙醚中的一种或几种的混合，所述第一缩合剂为dcc(二环己基碳二亚胺)、edci(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、bop(苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐)、tbtu(o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸酯)、hbtu(苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐)、dic(n，n-二异丙基碳二亚胺)和hatu(2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯)中的一种或几种的组合，所述第一催化剂为hobt(1-羟基苯并三唑)、dmap(4-二甲氨基吡啶)和dipea(n,n-二异丙基乙胺)中的一种或几种的组合；
优选的，所述第一溶剂为n，n-二甲基乙酰胺，四氢呋喃和二氯甲烷中的一种或几种的混合；
优选的，所述第一缩合剂为edci、hatu和bop中的一种或几种的组合；
优选的，所述第一催化剂为hobt。
技术方案中，优选的，第二步中包括将化合物a3与a4溶于第二溶剂中，加入第二缩合剂和第二催化剂进行酸胺缩合反应，所述第二溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、苯、甲苯、n，n-二甲基甲酰胺、n，n-二甲基乙酰胺、二甲亚砜、四氢呋喃和乙醚中的一种或几种的混合，所述第二缩合剂为dcc、edci、bop、tbtu、hbtu、dic和hatu中的一种或多种的组合，所述第二催化剂为hobt、dmap和dipea中的一种或几种的组合；
优选的，所述第二溶剂为二氯甲烷、n，n-二甲基甲酰胺和乙酸乙酯中的一种或几种的混合；
优选的，所述第二缩合剂为hatu、hbtu和bop中的一种或几种的组合；
优选的，所述第二催化剂为hobt。
本发明的在一目的是提供上述双自由基化合物及其盐在动态核极化中的应用。
本发明具有的优点和积极效果是：该化合物通过连接链将氮氧自由基与三芳基甲基自由基相连，形成了同时具有氮氧自由基和三芳基甲基自由基的双自由基极化剂。该双自由基极化剂的优势是：氮氧自由基-三芳基甲基自由基型双自由基的频率匹配性优于双氮氧自由基，ce效率更高；该氮氧自由基-三芳基甲基自由基型双自由基在魔角旋转的条件下不存在去极化效应，使其高场dnp增强效果优于双氮氧自由基；氮氧自由基-三芳基甲基自由基型双自由基具有的较强的交换相互作用明显区别于氮氧双自由基，且由于高场dnp偶极相互作用的影响非常小，起主导作用的是交换相互作用，因此，较强的交换相互作用也使该化合物具有相比于氮氧双自由基化合物更高的高场dnp增强倍数；三芳基甲基自由基具有良好的水溶性，且可修饰位点丰富，可用于不同用途的功能衍生化；本发明中对r1、r2、r3、r4、r5、r6基团的修饰可适度提高交换相互作用、提高双自由基的弛豫时间和双自由基的水溶性，从而提高极化剂的dnp性质。
附图说明
图1是本发明实施例一中化合物1的高分辨质谱图。
图2是本发明实施例二中化合物2的高分辨质谱图。
图3是本发明实施例三中化合物3的高分辨质谱图。
图4是本发明实施例四中化合物4的高分辨质谱图。
图5是本发明实施例五中化合物5的高分辨质谱图。
图6是本发明实施例六中化合物6的高分辨质谱图。
图7是本发明实施例七中化合物7的高分辨质谱图。
图8是本发明实施例八中化合物8的高分辨质谱图。
图9是本发明实施例九中化合物9的高分辨质谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步介绍：
实施例一
本实施例所述的一种三芳基甲基自由基与氮氧自由基组成的双自由基化合物及其盐，结构式如下式：
化合物1的制备步骤如下式11：
一、化合物a4的制备：
二、化合物1的制备：
1.将化合物a1(1-1.5eq)和hobt(2-5eq)用重蒸的dcm溶解，搅拌，加入dipea(3-10eq)，bop(0.9-1.5eq)先用重蒸dcm溶解，再加入反应液，活化0.5-2h，然后将化合物a2(0.9-2eq)溶于重蒸dcm，加入反应液，室温反应0.5-18h。处理：用dcm、水萃取，依次用柠檬酸，饱和碳酸钠溶液，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，用正相硅胶柱分离，流动相为：乙酸乙酯：石油醚＝1:4–2:1，得产物a3，产率为65-95％。
2.采用三氟乙酸或甲酸切除化合物a3的boc基团，条件：a3在纯酸或酸的二氯甲烷溶液(酸的比率为1:5至2:1)中常温搅拌0.5-8h；然后真空去除溶剂和酸后，通过碱化、萃取操作得到切除boc的a3。
3.将a4(0.9-1.5eq)溶于dmf中并加入dipea(3-20eq)，将hbtu(0.9-2eq)溶于dmf中，滴加到反应液中，活化0.5-2h，将切除boc的a3溶于适量dmf中，慢慢滴加(5-60min)到反应液中，4-24h后反应完全。加入稀盐酸，用乙酸乙酯、水萃取，合并有机层，减压浓缩，naoh溶液中和成盐，通过反相硅胶柱层析进行分离。产率为15-50％左右。
本实施例中，化合物a1为
如图1为本实施例中化合物1的高分辨质谱数据。
三、化合物1的dnp增强效果实验
dnp实验是将双自由基极化剂溶解到dnpjuice(甘油/水/重水60％/30％/10％)中配成浓度为10mm的溶液，底物为13c-15n脯氨酸。dnp实验是在800mhzbrukerbiospin527ghz固体核磁波谱仪上进行的，验温度为100k。
化合物1的dnp增强倍数为57。
实施例二
本实施例所述的一种三芳基甲基自由基与氮氧自由基组成的双自由基化合物及其盐，结构式如下式：
一、化合物2的制备步骤与实施例一中的方法相同。
本实施例中，化合物a1为
如图2为本实施例中化合物2的高分辨质谱数据
二、化合物2的dnp增强效果实验
dnp增强性能测试的实验方法与化合物1测试实验方法相同。
化合物2的dnp增强倍数为76。与化合物1相比，dnp增强倍数有了33％的增幅，提升效果显著。
实施例三
本实施例所述的一种三芳基甲基自由基与氮氧自由基组成的双自由基化合物及其盐，结构式如下式：
化合物3的制备步骤如下式13：
一、化合物3的制备：
将二甘醇胺(0.5-2eq)，咪唑(2-5eq)，dmap(0.05-0.5eq)，叔丁基二甲基氯硅烷(0.5-2eq)置于反应瓶中，氩气保护，冰浴，加入无水dcm，零度搅拌半小时后移置室温搅拌2-18小时反应完全。反应后处理：用饱和食盐水洗，蒸干即得纯净产物6，为无色透明油状物，产率达75-95％。
将上步所得产物(0.9-2eq)和氮氧自由基(1eq)溶于无水thf中，氩气保护，室温搅拌2小时，然后分批加入三乙酰氧基硼氢化钠(1.5eq)，室温搅拌16小时，反应完全。减压浓缩，用dcm萃取，用饱和碳酸氢钠和饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，采用正相硅胶柱层析进行分离。流动相为0-5％甲醇/二氯甲烷。产率55-75％。
剩余步骤同上，另外，在脱boc时，tbs也会完全脱掉。
原始原料为市售可以购买到的。
如图3为本实施例中化合物3的高分辨质谱数据。
二、化合物3的dnp增强效果实验
dnp增强性能测试的实验方法与化合物1相同。
化合物3的dnp增强倍数为44，虽然增强倍数不及化合物1，但其在削弱了分子间的氢键相互作用的同时，依旧保持了可观的dnp增强倍数，故化合物3在某些特定环境中的性能显著优于化合物1，例如在某些脂溶性蛋白质或膜蛋白样品测试中，化合物3的水溶性和分散性优于化合物1，可体现更好的性能。
实施例四
本实施例所述的一种三芳基甲基自由基与氮氧自由基组成的双自由基化合物及其盐，结构式如下式：
一、化合物4的制备：
化合物4的制备方法与化合物3相同。
如图4为本实施例中化合物4的高分辨质谱数据。
二、化合物4的dnp增强效果实验
dnp增强性能测试的实验方法与化合物1相同。
化合物4的dnp增强倍数为20，虽然增强倍数不及化合物1，但其在削弱了分子间的氢键相互作用的同时，依旧保持了可观的dnp增强倍数，故化合物4在某些特定环境中的性能显著优于化合物1，例如在某些脂溶性蛋白质或膜蛋白样品测试中，化合物4的水溶性和分散性优于化合物1，可体现更好的性能。
实施例五
本实施例所述的一种三芳基甲基自由基与氮氧自由基组成的双自由基化合物及其盐，结构式如下式：
化合物5的制备步骤如下式14：
一、化合物5的制备：
将2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮(0.5-2eq),4-羟基环己酮(3-6eq)和nh4cl(3-6eq)溶于dmso中，并在40-60℃加热搅拌5-12小时。加稀盐酸酸化，用石油醚萃取，用饱和碳酸钠溶液调ph＝9，减压浓缩得到粗产物，通过正相硅胶柱层析进行纯化，流动相为1-5％meoh/dcm，得到产物为白色固体，产率为10-30％。
向上步产物(0.5-2eq)和na2wo4·2h2o(0.3-1eq)的水溶液中在冰浴条件下加入30％h2o2(5-10eq),室温搅拌过夜。减压浓缩得到粗产物，通过硅胶柱层析进行纯化，流动相为1-3％meoh/ch2cl2，产物为红色油状物，产率为70-85％。
后续反应和化合物3相同。
原料为市售可购买到的。
如图5为本实施例中化合物5的高分辨质谱数据。
二、化合物5的dnp增强效果实验
化合物5的dnp增强倍数为72倍，相较化合物1有了26％的增幅，提升效果明显。
实施例六
本实施例所述的一种三芳基甲基自由基与氮氧自由基组成的双自由基化合物及其盐，结构式如下式：
化合物6的制备步骤如下式15：
一、化合物6的制备：
向2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮(0.5-2eq)的甲苯(5-15ml)溶液中加入多聚甲醛(1-2eq)，所得溶液在100-120℃下加热搅拌并回流0.5-2小时，然后滴加甲酸(0.5-2eq)，回流3-8小时后，将反应液冷却至室温。用乙酸乙酯萃取，依次用1nnaoh和饱和食盐水洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到粗产物，通过正相硅胶柱层析进行纯化，流动相为乙酸乙酯:石油醚＝1:3，得到产物，产率为40-60％。
将1,2,2,6,6-五甲基-4-哌啶酮(0.5-2eq),4-羟基环己酮(3-6eq)和nh4cl(3-6eq)溶于dmso中，并在50-70℃加热搅拌6-12小时。用稀盐酸酸化，用石油醚萃取，用饱和碳酸钠溶液调ph＝9，减压浓缩得到粗产物，用正相硅胶柱层析进行纯化，流动相为5％meoh/dcm，得到产物为白色固体，产率为12％。
向上步产物(0.5-2eq)和na2wo4·2h2o(0.3-1eq)的水溶液中在冰浴条件下加入30％h2o2(5-12eq),室温搅拌过夜。减压浓缩得到粗产物，通过硅胶柱层析进行纯化，流动相为1-3％meoh/ch2cl2，产物为红色油状物，产率为75-90％。
后续反应和化合物3相同。
原料均为市售可购买到的。
如图6为本实施例中化合物6的高分辨质谱数据。
二、化合物6的dnp增强效果实验
dnp增强性能测试的实验方法与化合物1相同。
化合物6的dnp增强倍数为95。
实施例七
本实施例所述的一种三芳基甲基自由基与氮氧自由基组成的双自由基化合物及其盐，结构式如下式：
一、化合物7的制备：
化合物7的制备方法与化合物1相同。
本实施例中，化合物a1为
如图7为本实施例中化合物7的高分辨质谱数据。
二、化合物7的dnp增强效果实验
dnp增强性能测试的实验方法与化合物1相同。
化合物4的dnp增强倍数为40。
实施例八
本实施例所述的一种三芳基甲基自由基与氮氧自由基组成的双自由基化合物及其盐，结构式如下式：
一、化合物8的制备：
化合物8的制备方法与化合物1相同。
本实施例中，化合物a1为
如图8为本实施例中化合物8的高分辨质谱数据。
二、化合物8的dnp增强效果实验
dnp增强性能测试的实验方法与化合物1相同。
化合物8的dnp增强倍数为30。
实施例九
本实施例所述的一种三芳基甲基自由基与氮氧自由基组成的双自由基化合物及其盐，结构式如下式：
一、化合物9的制备：
化合物9的制备方法与化合物1相同。
如图9为本实施例中化合物9的高分辨质谱数据。
二、化合物9的dnp增强效果实验
dnp增强性能测试的实验方法与化合物1相同。
化合物8的dnp增强倍数为43。
以上对本发明的几个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。