本发明涉及了一种高亲和力且具有功能性的抗人pd1的单克隆抗体或抗体片段。本发明同时提供了该抗体的编码核酸分子、表达载体、宿主细胞、以及用于表达该抗体的方法。还提供了包括本发明抗体的抗体免疫偶联缀合物、双特异性分子、嵌和抗原受体、药物组合物以及诊断和治疗方法。
背景技术
程序性死亡受体1，又称pd-1或cd279,属于cd28超家族成员。pd-1主要表达在激活的b细胞，t细胞和骨髓细胞上(agataetal.,supra；okazakietal.(2002)curr.opin.immunol.14:391779-82；bennettetal.(2003)jimmunol170:711-8)。与cd28家族的其它成员不同，由于pd-1结构中不含非配对的半胱氨酸，提示pd1主要以单体形式存在。
pd-1是一种55kda的i型跨膜蛋白，胞外有免疫球蛋白可变区样结构，胞内区中含一个近膜端的免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptortyrosineinhibitorymotif，itim)和远膜端的免疫受体酪氨酸转换基序(immunoreceptortyrosinebasedswitchmotif，itsm)(thomas,m.l.(1995)jexpmed181:1953-6；vivier,eanddaeron,m(1997)immunoltoday18:286-91)。
尽管pd1结构上类似于ctla4,但由于缺乏myppy基序而不能结合b7-1和b7-2。pd-l1和pd-l2是被证实的pd-1的两个配体分子。
大量证据显示，pd1和其配体相互作用负调节于免疫反应。pd-l1在多数癌细胞表面高表达(dongetal.(2002)nat.med.8:787-9)。pd-1/pd-l1相互作用可导致肿瘤浸润性淋巴细胞减少、tcr介导的细胞增殖抑制和免疫逃逸(dongetal.(2003)j.mol.med.81:281-7；blanketal.(2005)cancerimmunol.immunother.54:307-314；konishietal.(2004)clin.cancerres.10:5094-100)。通过抑制pd-l1/pd-1相互作用可逆转免疫抑制，如果同时阻断pd-l2/pd-1可进一步增强逆转的效果(iwaietal.(2002)proc.nat'l.acad.sci.usa99:12293-7；brownetal.(2003)j.immunol.170:1257-66)。
pd-1缺失小鼠表现出多种自身免疫表型，包括自免疫心肌病、关节炎/肾炎并发的狼疮样综合症(nishimuraetal.(1999)immunity11:141-51；nishimuraetal.(2001)science291:319-22)。而且，pd-1在自身性脑脊髓炎、系统性红斑狼疮、移植物抗宿主病、i型糖尿病、类风湿性关键炎等疾病中发挥重要作用(salamaetal.(2003)jexpmed198:71-78；prokuninaandalarcon-riquelme(2004)hummolgenet13:r143；nielsenetal.(2004)lupus13:510)。在一个小鼠的b细胞肿瘤细胞中，pd-1的itsm基序对bcr介导的ca波动和下游分子的酪氨酸磷酸化起关键阻断件用(okazakietal.(2001)pnas98:13866-71)。
大量靶向pd-1分子的癌症免疫治疗药物已经开发成功。例如一个叫nivolumab的抗体(即bms公司的
尽管靶向pd-1的抗体药已被开发和获批，但针对pd-1靶点仍需要开发更高亲和力和其它药理特性的单抗还十分必要和具有重要医疗价值的。
技术实现要素：
为了克服上述缺陷，本发明的目的是提供一种抗人pd1单克隆抗体及用途，该抗体具有高亲和力和功能性，其优于现有的抗人pd1单克隆抗体。
为了达到上述目的，本发明提供一种抗人pd1单克隆抗体，其特征在于，该抗体包含：重链和轻链；
所述的重链和轻链均包括可变区，该可变区包括互补决定区；
所述重链的互补决定区cdr1、cdr2和cdr3分别用cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3表示；
所述轻链的互补决定区cdr1、cdr2和cdr3分别用cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3表示；
所述的cdr-h1的氨基酸序列为seqidno：3所示；
所述的cdr-h2的氨基酸序列为seqidno：4所示；
所述的cdr-h3的氨基酸序列为seqidno：5所示；
所述的cdr-l1的氨基酸序列为seqidno：6所示；
所述的cdr-l2的氨基酸序列为seqidno：7所示；
所述的cdr-l3的氨基酸序列为seqidno：8所示。
重链可变区氨基酸序列为seqidno：1所示；轻链可变区氨基酸序列为seqidno：2所示。
一种核苷酸分子，该核苷酸分子编码所述的抗人pd1单克隆抗体；
该核苷酸分子的序列选自seqidno：9和/或seqidno：10；
序列seqidno：9编码所述的抗体的重链可变区；
序列seqidno：10编码所述的抗体的轻链可变区。
一种表达载体，该表达载体含有所述的核苷酸分子。
一种宿主细胞，该宿主细胞含有所述的表达载体。
一种抗人pd1单克隆抗体的制备方法，该制备方法包含如下步骤：
步骤1：制备含有表达所述的抗人pd1单克隆抗体的核苷酸分子的表达载体；
步骤2：用步骤1的表达载体转染真核宿主细胞；
步骤3：培养步骤2转染的真核宿主细胞；
步骤4：分离纯化，获得所述的抗体。
本发明还涉及包括前述的抗人pd1单克隆抗体的抗体免疫偶联缀合物、双特异性分子、嵌和抗原受体或药物组合物。
本发明还涉及抗人pd1单克隆抗体在制备抗肿瘤药物、传染性疾病或其它由pd1介导的病理病症的药物中的应用。
所述的重链和轻链都还包括恒定区，该恒定区为人igg的恒定区，优选地为igg1的恒定区。
相对于现有技术，本发明具有以下优点：本发明的能特异识别人pd1的单克隆抗体，该抗体与人pd1结合的亲和力强于现有抗人pd1单克隆抗体，序列新颖。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
一、抗体的获得
实施例1通过融合杂交瘤技术获得特异性抗pd1的小鼠单克隆抗体
1.1动物免疫
根据文献中(eharlow,d.lane,antibody:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,1998)通用的方法免疫小鼠。免疫原为c端含有人igg1fc标签的重组人pd1(氨基酸范围leu25-gln167)蛋白(acrobiosystems,cat#pd1-h5257)。使用重组人pd1带his标签的蛋白(sinobiologicalinc.,cat#10377-h08h)作为测定血清效价和杂交瘤筛选的检测抗原。简要地，取出适量的福氏佐剂到1.5mlep管中，振荡器混匀。用pbs配制抗原蛋白溶液。按照需要量混匀佐剂和蛋白抗原溶液，通过注射器互推充分乳化抗原形成稳定油包水的溶液,而后进行动物注射。根据血清效价测定结果，首次免疫后通常需要进行2到3次加强免疫后才能达到良好的免疫效果。选择血清效价高的免疫小鼠行腹腔注射终免后进行细胞融合。
1.2杂交瘤融合和筛选
细胞融合前，培养小鼠骨髓瘤细胞(sp2/0-ag14,atcc#crl-1581)处于对数生长期。处死免疫小鼠无菌环境取脾，根据文献中方法使用peg化学融合脾b细胞和sp2/0骨髓瘤细胞(eharlow,d.lane,antibody:alaboratorymanual,(coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,1998)；kohlerg,andmilsteinc,"continuousculturesoffusedcellsecretingantibodyofpredefinedspecificity,"nature,256:495-497(1975))。融合后的细胞铺板96孔细胞培养板，通常7到10天后显微镜下可观察到存活的杂交瘤细胞生长出来。细胞铺板两周后，收集各孔培养上清，以elisa方法用人pd1-his蛋白抗原进行杂交瘤筛选。简述如下，用60ul2ug/ml的人pd1-his蛋白抗原的pbs溶液包被酶标板，4度(本发明中的“度”指摄氏度)过夜。而后pbst洗板4次后，加入200μl/孔的5％脱脂奶粉的pbst溶液置于37度封闭2小时。再次洗板，加入60μl/孔的杂交瘤上清,37度孵育40分钟，而后洗板4次。以100μl/孔加入1：5000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗(jacksonimmunoresearch,cat#115-036-071),37度孵育40分钟，而后洗板4次,拍干。添加100μl/孔的tmb显色底物(湖州英创生物，tmb-s-002),室温显色5到15分钟，而后用1m的硫酸溶液终止,测定450纳米处各孔的吸光值。挑出elisa结合阳性的杂交瘤孔细胞，转移到24孔板中，继续培养。并通过elisa方法进行第二轮复筛，筛选出特异识别pd1且能阻断pd1/pdl1结合的杂交瘤(结果见表1,其中c1b6是本发明得到的杂交瘤，该杂交瘤表达本发明所制得的抗人pd1单克隆抗体),通过有限稀释法亚克隆，获得目标单克隆细胞株。而后小量表达生产这些单克隆抗体，抗体进行下一步的功能测评分析。
表1pd1小鼠杂交瘤上清的elisa测评
二、体外分析方法：
实施例2用于测定pd1单克隆抗体功能活性的体外分析方法
2.1基于捕获elsia测定抗体的结合能力
用1xpbs配制羊抗小鼠iggfcr特异的二抗(jacksonimmunoresearch,#115-006-071)，使其终浓度为2μg/ml,以100μl/孔加液于96孔酶标板，4度包被过夜。次日，用含0.05％的吐温20的pbs溶液(即1xpbst)洗板4次后，加入200μl/孔的5％脱脂奶粉的pbst溶液置于37度封闭2小时。再次洗板，加入100μl/孔的稀释抗体溶液或杂交瘤上清后,37度孵育40分钟，而后洗板4次。以100μl/孔加入配制的60nm生物素标记人pd1-fc蛋白溶液(在2.5％脱脂奶粉的pbst中),37度孵育40分钟，而后洗板4次。以100μl/孔加入1：10000稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(jacksonimmunoresearch,#016-030-084),37度孵育40分钟，而后洗板4次,拍干。添加100μl/孔的elisa显色底物tmb,室温显色5到15分钟，而后用1m的硫酸溶液终止显色,测定450纳米处各孔的吸光值。
2.2竞争elisa
2.2.1配体受体结合阻断elisa
通过竞争elisa方法测评pd1抗体对pd1/pdl1结合的阻断能力。简述如下，用1xpbs配制人的pdl1-fc蛋白(biosioninc.,cat#bs-ta1601103-90)，使其终浓度为2μg/ml,以100μl/孔加液于96孔酶标板，4度包被过夜。次日，用含0.05％的吐温20的pbs溶液(即1xpbst)洗板4次后，加入200μl/孔的5％脱脂奶粉的pbst溶液置于37度封闭2小时。再次洗板4次。
把pd1抗体或参照抗体梯度稀释在含有生物素标记的人pd1fc蛋白溶液中，配好后室温预孵40分钟。而后把已孵育的抗体和pd1fcbiotin的溶液以100μl/孔加到包被好pdl1-fc的板上，37度孵育40分钟后，再次洗板4次。而后以100μl/孔加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素,37度孵育40分钟后洗板4次,拍干。添加100μl/孔的tmb溶液显色和50μl/孔的1m硫酸终止反应，测定450纳米处的吸收值。使用graphpadprism软件进行数据处理，得出抗体阻断pd1/pdl1结合的ic50浓度值。
2.2.2参照抗体阻断elisa
通过竞争elisa方法测评pd1抗体阻断参照抗体
把pd1抗体或参照抗体梯度稀释在含有生物素标记的人pd1-fc蛋白溶液(10nm)中，配好后室温预孵40分钟。而后把已孵育的抗体和pd1fcbiotin的溶液以100μl/孔加到包被好参照抗体
2.3基于细胞的抗体功能性分析
本发明进一步采用基于细胞的报告基因系统，来分析测评pd1单克隆抗体的阻断性功能活性。该实验体系由两种工程化的细胞系组成，一种是pd1效应细胞系(genscript，gs-j2/pd1),该细胞稳定表达人的pd1和由nfat反应元件驱动的荧光素酶报告基因；另一种为pdl1细胞系(genscript,gs-c2/pd-l1,为一种抗原递呈细胞)，pdl1细胞系稳定表达人的pdl1和工程化的细胞表面抗原肽/主要组织相容性复合体(mhc)。当这两种细胞共培养时，由于pdl1对pd1的结合负调控作用，导致mhc/tcr介导的对nfat报告基因的激活成阻断作用，荧光素酶基因不表达。当体系中引入pd1的配体结合阻断性抗体后，封闭了pd1蛋白，使得pdl1的结合负调控作用被阻止，荧光素酶表达逐渐恢复。实验简述如下：培养处于对数生长期的pdl1细胞系以5*105个/ml的密度接种于384孔板。次日，按照实验设计梯度稀释pd1抗体。吸去384孔板中pdl1细胞的培养上清后，顺序添加20ul/孔梯度稀释的pd1待测抗体或参照抗体和密度为6.25*105个/ml的pd1细胞(20ul/孔)。而后细胞板置于37度培养箱继续培养6小时后，取出细胞板，根据产家的操作说明测试每孔的荧光素酶活性(one-gloluciferaseassaysystem,promegainc.#e6120)。使用graphpadprism软件根据测定的荧光素酶活性对应抗体浓度作图，得出pd1抗体/荧光素酶信号响应曲线中抗体的ec50浓度值。
实施例3抗pd1小鼠单克隆抗体的结合活性
根据实施例2.1中描述的分析方法，测评pd1小鼠单克隆抗体的结合活性总结如下表2。其中以参照抗体
表2pd1抗体的结合活性
实施例4功能性实验(参照2.2和2.3的分析方法)，得到基于elisa和细胞水平的抗体功能性实验测评数据
如下表3，汇总了抗pd1小鼠单克隆抗体的功能性测评结果。
表3抗pd1小鼠单克隆抗体的功能性测评结果
表3中抗体对人pd1/pdl1的竞争elisa实验表明，本发明的c1b6抗体可特异阻断pd1结合其配体pdl1，其阻断能力接近于参照抗体；同时抗体对参照抗体/人pd1的竞争elisa实验表明，c1b6抗体可阻断参照抗体结合人pd1抗原,表明c1b6结合的抗原表位近似但不同于参照抗体；另外基于细胞的报告基因分析，显示c1b6的功能学活性接近于参照抗体。
实施例5dna克隆和测序，抗pd1小鼠单克隆抗体的可变区蛋白测序
使用trizol试剂(invitrogen,catalog#15596-018)从培养的小鼠单克隆细胞株中提取总rna。过程简述如下，离心收集5x106的细胞到1.5ml离心管中，吸干上清。添加1ml的trizol试剂并反复吹打数次后室温放置5分钟用于裂解细胞。紧接着，每管加入0.2ml的氯仿溶液，剧烈震荡15秒后室温放置3分钟。而后，离心管4度12000g离心10分钟，取出离心管，吸取上层水相溶液到新的1.5ml离心管中，再加入0.4ml的异丙醇用于从水相中沉淀rna。手动混匀ep管并放置室温10min后，4度12000g离心10分钟，弃上清。加入1ml75％的乙醇，再次4度7500rpm离心5min，弃上清。管底rna沉淀于室温干燥10分钟后，加入30到50ul的无菌depc处理水溶解rna样品。
紧接着，选用taraka的逆转录cdna试剂盒(catalog#6110a)把总rna变为cdna。实验体系配制如下，5μl的总rna+0.5μloligo(dt)+8.5μlrnase-free水(共14ul)先置于65度5min预变性，而后放冰上2分钟。进一步加入4μl的5x缓冲液+1μl的dntp混合物+0.5μl的rnase抑制剂+1μl逆转录酶(总共20.5ul体系)，配好后混匀，使用pcr仪运行40度50分钟，70度10min，完成cdna合成。
cdna进一步在3’端加polyg，反应体系配制如下：5μl的cdna样品+33.5μl的ddh2o+5μl的10xtdt缓冲液+5μl的cocl2+1μl的dgtp+0.5μl的末端脱氧核苷酸转移酶(总体积50ul),配好后混匀，使用pcr仪运行37度30分钟，70度10min，完成polyg加尾。
进一步，以加尾的cdna为模板进行抗体可变区的基因扩增。对于扩增抗体重链可变区序列，配制pcr反应体系：10xtaq酶缓冲液5μl+通用polyc引物(正向引物)0.5μl+小鼠igg1反向引物0.5μl+dntp1μl+taq聚合酶1μl+cdna1μl+ddh2o41μl。对于扩增抗体轻链可变区序列，配制pcr反应体系：10xtaq酶缓冲液5μl+通用polyc引物(正向引物)0.5μl+小鼠iggkappa链反向引物0.5μl+dntp1μl+taq聚合酶1ul+cdna1μl+ddh2o41μl。抗体重链和轻链可变区pcr扩增的温度循环如下(其中步骤2到4，重复25个循环)：
1-预变性95℃.5min.
2-变性95℃.20sec.
3-退火56℃.20sec.
4-延伸72℃.30sec.
5-保存25℃.60min。
pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，切出对应大小的dna区段条带(vh的约600bp，vkappa轻链约500bp)，用qiagen的凝胶dna回收试剂盒(catalog#28704)进行dna的抽提。简述如下：凝胶称重，加3倍凝胶体积的qg缓冲液，而后50度孵育10分钟直到凝胶完全溶解。加入1倍胶体积的异丙醇混匀后，样品移至qia纯化柱，离心13000rpm1分钟。加入750ul的pe缓冲液到柱中，而后13000rpm离心1分钟。并再次13000rpm离心1分钟去除柱中液体残留。加入30ul的水洗脱柱离心1分钟，获得制备的dna样品，纯化的pcr产物经测序获得抗体的可变区序列如表4所示，pd1小鼠单克隆抗体的氨基酸全长序列如表5所示，pd1小鼠单克隆抗体的编码dna序列如表6所示。
表4pd1小鼠单克隆抗体的可变区氨基酸序列和cdr区
表5pd1小鼠单克隆抗体的氨基酸全长序列
表6pd1小鼠单克隆抗体的编码dna序列
综上所述，本发明的能特异识别人pd1的单克隆抗体，该抗体与人pd1结合的亲和力强，序列新颖。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
序列表
<110>博奥信生物技术(南京)有限公司
<120>一种抗人pd1单克隆抗体及用途
<130>xhx2018072403
<141>2018-07-24
<160>14
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