本发明涉及多肽phe-pro-ser-ile-val-gly-arg-pro在制备抑制二肽基肽酶(dpp-ⅳ，dipeptidylpeptidaseⅳ)、脯氨酰内切酶(pep，prolylendopeptidase)及降血糖、抗阿尔茨海默症药物及保健品中的应用。
背景技术：
糖尿病是一种由于体内胰岛素绝对或相对不足而导致的葡萄糖、蛋白质、脂代谢紊乱的综合症。目前,糖尿病已经成为全球性流行病。根据世界卫生组织统计,糖尿病的发病率每年都以一定的幅度在递增。2016年我国糖尿病流行率为9.6％，且随着生活水平的提高，这一数字仍在急剧上升。
二肽基肽酶ⅳ(dpp-ⅳ，dipeptidylpeptidaseⅳ)是一种丝氨酸蛋白酶，该酶的底物包括n端第二位是脯氨酸或丙氨酸残基的多肽。它能从肽链n端水解两个氨基酸残基，能快速有效降解胰高血糖素样肽1(glp-1,glucagon-likepeptide-1),glp-1是胰岛素生成和分泌最有效的刺激剂之一,因此抑制dpp-ⅳ能增强内源性glp-1的作用,从而提高血液中胰岛素的水平,进而降低并维持糖尿病人的血糖水平(kondo,t.；sugimoto,i.；nekado,t.；ochi,k.；ohtani,t.；tajima,y.；yamamoto,s.；kawabata,k.；nakai,h.；toda,m.bioorgmedchem.2007,15(7):2715-2735)。并且，glp-1调节胰岛素分泌具有严格的血糖浓度依赖性，只有在高血糖条件下glp-1才会提高胰岛素的分泌水平，故dpp-ⅳ抑制剂不存在因服药而引发低血糖的风险(thornberryna1,gallwitzb.bestpractresclinendocrinolmetab.2009,23(4):479-86)
据世界卫生组织统计，截至2017年末，全世界约有五千万痴呆症患者，每年新增病例为1000万，其中阿尔茨海默症占痴呆症病例的60～70％。目前并没有能够治愈阿尔茨海默症或改变其病程发展的药物或其他治疗方案。
脯氨酰内切酶(prolylendopeptidase，pep)，也被称为脯氨酰寡肽酶，是一种高保留的丝氨酸蛋白酶。pep在含脯氨酸神经肽的新陈代谢中扮演重要角色，pep的活动与诱导神经退行性疾病(如阿尔兹海默症和帕金森症等)的产生有关。研究表明pep抑制剂可能会因阻断pep的新陈代谢而达到改善记忆力的目的。因此，pep抑制剂可以作为一种潜在的修复阿尔兹海默症患者记忆力的药物进行研究。
技术实现要素：
本发明的目的是提供多肽phe-pro-ser-ile-val-gly-arg-pro在抑制dpp-ⅳ、pep活性和降血糖、改善记忆力中的应用和快速筛选方法；多肽phe-pro-ser-ile-val-gly-arg-pro具有dpp-ⅳ抑制活性及降血糖活性，作为高血糖、ii型糖尿病以及改善记忆力、阿尔茨海默症的保健品和药物先导化合物具有良好的应用前景。
为实现上述目的，本发明以所述多肽phe-pro-ser-ile-val-gly-arg-pro为抑制dpp-ⅳ、pep活性和降血糖、改善记忆力的有效成份。
其具有序列表seqidno：1中氨基酸序列；多肽phe-pro-ser-ile-val-gly-arg-pro为dpp-ⅳ、pep抑制剂及降血糖、改善记忆力药物及保健品的活性成份，其中可添加药物学上可接受的载体或辅料。
具有抑制dpp-ⅳ、pep活性和降血糖、改善记忆力活性的多肽phe-pro-ser-ile-val-gly-arg-pro来源于梅花鹿。由于鹿的蛋白库不够完善，总蛋白数量较少，而牛和鹿的基因同源性超过90％(suizg,yuanhm,liangz,etal.talanta,2013,107,189-194.)，因此本实验选择牛科(bovine)作为蛋白数据库。多肽phe-pro-ser-ile-val-gly-arg-pro来源于牛科(bovine)蛋白库的actin,cytoplasmic2蛋白。含8个氨基酸残基，氨基酸序列为phe-pro-ser-ile-val-gly-arg-pro，为单链线性结构，白色粉末状，易溶于水，分子量为872da；对dpp-ⅳ、pep的半数抑制浓度(ic50)分别为169±2μm、845±96μm(n＝3，mean±sd)。
多肽phe-pro-ser-ile-val-gly-arg-pro具备dpp-ⅳ抑制剂所要求的特征：
dpp-ⅳ抑制肽由至少应含有一个pro残基，特别是当n端第二位为pro残基时dpp-ⅳ抑制活性尤为明显。多肽phe-pro-ser-ile-val-gly-arg-pro含有pro残基且其位于n端第二位，因此满足这一影响活性的条件。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明首次从鹿茸中获得并确定了活性化合物的结构，化合物具有较好的抑制dpp-ⅳ、pep的活性，因此作为治疗高血糖、改善记忆力以及ii型糖尿病、阿尔茨海默症药物的先导化合物具有良好的潜力和应用前景。
具体实施方式
实施例1多肽phe-pro-ser-ile-val-gly-arg-pro的制备
采用lc-ms/ms与shotgun蛋白质组学技术相结合的方法。以梅花鹿茸为原料，经酶解蛋白，离心，纯化及lc-ms/ms分析，结合构效关系特征，筛选对dpp-ⅳ、pep具有抑制作用的肽段。
其具体方法如下：
将新鲜梅花鹿茸冷冻干燥后粉碎，加入去离子水使鹿茸浓度为33.3g/l，搅拌均匀后加入鹿茸质量0.5％(w/w)的胰蛋白酶，在40℃下酶解3小时；酶解结束将酶解液过80目筛，残渣同法提取一次。将两次酶解液升温至90℃保温15分钟，先后经8层纱布和200目筛过滤，所得滤液以10000g的速度离心10分钟，收集上清液；上清液经nanodroponec在205nm下测定肽浓度，加水稀释至肽浓度20mg/ml待用；将溶胀后的sephadexg-25medium填料填装成直径2cm、柱高30cm的凝胶柱。将酶解液加载于凝胶柱上，以去离子水为洗脱液、流速3.5ml/min进行洗脱，以床体积的1/20为一个流份，洗脱2个床体积，收集全部40个流份并经nanodroponec在205nm下测定肽浓度。根据肽浓度合并第16至第25个流份，冷冻干燥，得到鹿茸提取物。
将鹿茸提取物用ltqorbitrapvelos进行质谱分析：将鹿茸提取物用0.1％(v/v)甲酸水溶液复溶成0.4mg/ml的溶液，进行lc-ms/ms分析。将毛细管的一端拉成内径约为5μm的尖端，通过气压将c18aq填料压入柱内，填充柱长度约15cm。将毛细管的尖端与质谱相连。所用的流动相a为0.1％(v/v)甲酸水溶液，流动相b为0.1％甲酸的乙腈溶液，线性梯度洗脱过程为：0％b(0min)—2％b(2min)—25％b(87min)—35％b(97min)—90％b(99min)—90％b(109min)—2％b(110min)—2％b(120min)。流速60μl/min。
设置离子传输毛细管的温度200℃，电喷雾电压1.8kv，归一化碰撞能量35.0％。均使用数据依赖模式(data-dependentmode)对ms和ms/ms进行图谱采集。质谱扫描条件设定为：从每次m/z＝400～2000的全扫描中选择10个最高丰度离子峰进行ms/ms扫描，其中动态排除(dynamicexclusion)设置为：重复次数(repeatcount)为2，重复容忍时间(repeatduration)30s，动态排除时间(exclusionduration)90s。利用xcalibur软件(version2.2，thermo)进行系统控制和数据收集。
将采集的*.raw文件数据用thermoproteomediscovererdaemon(v1.4)转换成*.mgf格式，再用mascot(version2.3.0，matrixscience，london，uk)于牛科数据库(bovine，蛋白数目17890，下载自http://www.uniprot.org/),进行检索，检索参数如下：不设置酶切位点、最大漏切数和固定修饰；蛋氨酸残基、脯氨酸残基加15.9949da的可变修饰；母离子的质量容忍度(peptidetolerance)为20ppm，碎片离子的质量容忍度(fragmentionstolerance)为0.8da。导出肽段结果时设置score>25,调整显著性差异p使肽段假阳性率(fdr，falsediscoveryrate)控制在1％内。鉴定结果见附表。结合构效关系进行筛选，获得序列为phe-pro-ser-ile-val-gly-arg-pro的多肽。
实施例2多肽phe-pro-ser-ile-val-gly-arg-pro的dpp-ⅳ抑制活性检测
原理
对于n端为x-pro、x-ala的肽段，dpp-ⅳ可将该二肽选择性切除，glp-1具有x-ala结构，因此dpp-ⅳ可导致超过95％的glp-1发生降解。本方法采用gly-pro-p-nitroanilide代替glp-1作为dpp-ⅳ的模拟底物，dpp-ⅳ切下gly-pro后，生成的对硝基苯胺在405nm有特征吸收峰，由此可计算dpp-ⅳ的抑制活性。
实验方法：
实验所用多肽phe-pro-ser-ile-val-gly-arg-pro由南京杰肽生物科技有限公司合成，纯度>95％。将多肽phe-pro-ser-ile-val-gly-arg-pro溶解于100mm的tris-hcl缓冲液(ph＝8.0)，向96孔板加入25μl的phe-pro-ser-ile-val-gly-arg-pro溶液和25μl1.59mm的gly-pro-p-nitroanilide溶液(用相同缓冲液配置，下同)，混匀，于37℃温育10分钟，再加入50μl0.01u/ml的dpp-ⅳ溶液，混匀后于37℃温育60分钟，加入100μl1m的醋酸-醋酸钠缓冲液(ph4.0)使反应终止，用酶标仪测定405nm吸光度。control组用等体积的tris-hcl缓冲液代替phe-pro-ser-ile-val-gly-arg-pro溶液，blank组用等体积的tris-hcl缓冲液代替phe-pro-ser-ile-val-gly-arg-pro溶液和dpp-ⅳ溶液。
分别配制浓度0.5、0.25、0.1、0.05mm的多肽phe-pro-ser-ile-val-gly-arg-pro溶液，按上述方法进行dpp-ⅳ抑制活性检测。dpp-ⅳ抑制率计算公式：
其中i％表示抑制率，a多肽表示phe-pro-ser-ile-val-gly-arg-pro吸光度值，acontrol表示阴性对照组吸光度值，ablank表示空白组吸光度值。结果如表一所示：
表一不同浓度的phe-pro-ser-ile-val-gly-arg-pro对dpp-iv的抑制率
由表一可知，多肽phe-pro-ser-ile-val-gly-arg-pro对dpp-iv的半数抑制浓度(ic50)为169±2μm(mean±sd，n＝3)
实施例3多肽phe-pro-ser-ile-val-gly-arg-pro的pep抑制活性检测
1.原理
pep能够特异性地在脯氨酸的羧基末端水解小分子量多肽。因此本方法采用z-gly-pro-4-nitroanilide作为pep的底物，z-gly-pro-4-nitroanilide被pep切下z-gly-pro后，生成黄色的对硝基苯胺在405nm有特征吸收峰，根据加入样品和底物前后的405nm下的吸光度变化，可以计算样品对于pep的抑制活性。
2.方法
(1)多肽phe-pro-ser-ile-val-gly-arg-pro溶液：实验所用多肽phe-pro-ser-ile-val-gly-arg-pro由南京杰肽生物科技有限公司合成，纯度>95％。将phe-pro-ser-ile-val-gly-arg-pro溶解于10mm的pbs缓冲液(10mmpbs，137mmnacl和2.7mmkcl，ph7.0)。
(2)底物溶液：z-gly-pro-4-nitroanilide(z-gly-pro-pna)溶液，将z-gly-pro-4-nitroanilide用40％(v/v)的二氧六环配制成10mm的溶液。
(3)pep溶液：将pep用保护液(45mmtris-hcl，ph8.0，124mmnacl，2.4mmkcl，10％(v/v)甘油，225mm咪唑和3mmdtt)稀释成1u/ml的溶液分装储存于-80℃冰箱，临用前用pbs稀释8倍(v/v)，作为pep溶液。
实验在96孔板中进行。首先将140μlpbs缓冲液，20μl多肽phe-pro-ser-ile-val-gly-arg-pro溶液和20μlpep酶溶液依次加入孔中，37℃孵育5min后，再加入20μl底物溶液，混匀后于37℃温育30分钟，用酶标仪测定405nm吸光度。control组用等体积的pbs缓冲液代替phe-pro-ser-ile-val-gly-arg-pro溶液，blank组用等体积的pbs缓冲液代替phe-pro-ser-ile-val-gly-arg-pro溶液和pep溶液。每孔做三个平行，计算phe-pro-ser-ile-val-gly-arg-pro抑制率。抑制率计算公式：
其中i％表示抑制率，a多肽表示phe-pro-ser-ile-val-gly-arg-pro吸光度值，acontrol表示阴性对照组吸光度值，ablank表示空白组吸光度值。
分别用不同的浓度，按上述方法对多肽phe-pro-ser-ile-val-gly-arg-pro进行pep抑制活性检测。结果如表二所示：
表二不同浓度多肽phe-pro-ser-ile-val-gly-arg-pro的pep抑制率
根据表二可知phe-pro-ser-ile-val-gly-arg-pro对pep的半数抑制浓度(ic50)为845±96μm(mean±sd，n＝3)
多肽phe-pro-ser-ile-val-gly-arg-pro具有dpp-ⅳ、pep抑制活性及降血糖、改善记忆活性，作为高血糖、ii型糖尿病的保健品和药物先导化合物具有良好的应用前景。
附表：鹿茸提取物经lc-ms/ms鉴定的肽段
以tgtpglpgppgpmgppgdr为例：肽段的修饰种类为oxidation(m)；3pro(o)(p)，表明该肽段有1处甲硫氨酸氧化修饰和3处脯氨酸羟基修饰。肽段的修饰位置为0.0002002000001002000.0，表示该肽段的3处脯氨酸羟基修饰位于第4、7、16位残基，甲硫氨酸氧化修饰位于第13位残基。
附表一的序列所涉及的氨基酸均为氨基酸的简写，各氨基酸缩写、简写及名称见附表二。
附表二氨基酸名称、缩写与简写
序列表
<110>中国科学院大连化学物理研究所
<120>一种多肽及其应用和抑制剂或药物或保健品
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>8
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
pheproserilevalglyargpro
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