本发明属于药物领域，具体是指一种从棘穗软珊瑚dendronephthyagigantea中分离得到的具抗氧化作用的甾醇化合物，以及该化合物在制备用于预防和治疗脑缺血再灌注损伤的药物中的应用。
背景技术：
脑中风是危害人类健康的重要疾病，其中缺血性脑中风又占脑中风的80％-85％。溶栓是缺血性脑中风的主要治疗手段，但在恢复血流供应时由于氧化应激易导致缺血再灌注损伤。因此使用抗氧化剂清除活性氧能起到神经保护作用，是防治脑缺血再灌注损伤的重要策略。
软珊瑚又称海鸡头，海鸡冠，在分类学上属腔肠动物门(coelenterata)，珊瑚虫纲(anthozoa)，八放珊瑚亚纲(alcyonaria)，海鸡冠目(alcyonacea)，属于低等原始海洋生物，主要生活于热带海洋中。自20世纪60年代以来，国内外学者相继从软珊瑚中获得了一系列具有强烈生物活性的甾醇、二萜和倍半萜等化合物，其中从棘穗软珊瑚dendronephthya属中发现的甾醇化合物大约有40种。目前，从软珊瑚中获得的甾醇类化合物的主要生物活性包括肿瘤细胞毒、抗炎和抗菌等，未见有抗氧化和神经细胞保护作用的报道。
近期，我们从采自海南三亚海域的棘穗软珊瑚d.gigantea中分离得到1个结构新颖的甾醇化合物3β-羟基-19-乙酰氧基-麦角甾-5,24(28)-二烯-7-酮，并发现该发化合物具有抗氧化活性，能够有效抑制h2o2对神经元样pc12细胞产生的氧化损伤，即具有神经细胞保护作用，可用于预防或治疗脑缺血再灌注损伤。基于此，提出本项发明申请。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种具有抗氧化作用的甾醇化合物及其在制备药物中的应用。
作为本发明的第一个发明，本发明提供一种具有抗氧化作用的甾醇化合物，其技术方案是甾醇化合物，其特征在于：该化学名为3β-羟基-19-乙酰氧基-麦角甾-5，24(28)-二烯-7-酮，如式(i)所示：
进一步设置是该甾醇化合物提取自棘穗软珊瑚d.gigantea。
作为本发明的第二个方面，提供了一种如式(i)所述的甾醇化合物在制备神经保护药物中的应用。
作为本发明的第三个方面，提供了一种如式(i)所述的甾醇化合物在制备具有预防或治疗脑缺血再灌注损伤疾病功能药物的应用。
此外，本发明还提供一种具有预防或治疗脑缺血再灌注损伤疾病功能的药物组合物，含有治疗有效量的活性成分和药学上可接受的药用辅料；所述的活性成分包含所述的甾醇化合物或其可药用的盐类衍生物。
进一步设置是所述的活性成分还包括有药学上可接受且已上市的抗氧化药物，该抗氧化药物包括且不限于依达拉奉、维生素c和维生素e中的一种及其组合。
进一步设置是所述的药物组合物具有如下制剂形式：注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、软膏剂、控释或缓释剂和纳米制剂。
本发明中所述“药用辅料”指药学领域常规的药物载体，例如：粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；稀释剂如淀粉、预胶化淀粉、糊精、蔗糖、乳糖、甘露醇等，填充剂如淀粉、蔗糖等；湿润剂如甘油；崩解剂如羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮和干淀粉等；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如聚山梨酯、脂肪酸山梨坦和脂肪酸甘油酯等；着色剂如二氧化钛、日落黄、亚甲蓝、药用氧化铁红等；润滑剂如氢化植物油、滑石粉和聚乙二醇等。包衣材料如丙烯酸树脂、羟丙甲纤维素、聚维酮、纤维醋法酯等；另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。所述药物的制剂形式包括注片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、滴剂、滴丸剂及纳米制剂等。本发明可以组合物的形式通过经胃肠道给药，注射给药、呼吸道给药、皮肤给药、粘膜给药和腔道给药等方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。
本发明的有益之处是：提供的从棘穗软珊瑚d.gigantea中提取的一种具有神经细胞保护作用的甾醇化合物，可应用于预防或治疗脑缺血再灌注损伤疾病。
具体效果见试验例和实验数据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。
图1化合物3β-羟基-19-乙酰氧基-麦角甾-5,24(28)-二烯-7-酮的1hnmr谱；
图2化合物3β-羟基-19-乙酰氧基-麦角甾-5,24(28)-二烯-7-酮的13cnmr谱；
图3化合物3β-羟基-19-乙酰氧基-麦角甾-5,24(28)-二烯-7-酮的hmqc谱；
图4化合物3β-羟基-19-乙酰氧基-麦角甾-5,24(28)-二烯-7-酮的hmbc谱；
图5化合物3β-羟基-19-乙酰氧基-麦角甾-5,24(28)-二烯-7-酮的hr-esi-ms谱；
图6化合物3β-羟基-19-乙酰氧基-麦角甾-5,24(28)-二烯-7-酮对h2o2诱导的神经元样pc12细胞氧化损伤的抑制作用的验证图；
图7化合物3β-羟基-19-乙酰氧基-麦角甾-5,24(28)-二烯-7-酮对h2o2诱导的神经元样pc12细胞中mda含量的影响效果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
本发明实施例中，实施例1化合物3β-羟基-19-乙酰氧基-麦角甾-5,24(28)-二烯-7-酮的制备
(1)取刺穗软珊瑚dendronephthyagigantea1.24kg(湿重)，切成小块，匀浆，用4l的95％乙醇浸泡提取3次，每次浸泡3天。合并浸出液并在40℃减压浓缩至干，得粗浸膏。将浸膏悬浮于蒸馏水中，用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，40℃减压浓缩至干，得乙酸乙酯萃取物21.5g。将乙酸乙酯萃取物用硅胶柱色谱分离，以石油醚/乙酸乙酯(v/v，20/1、10/1、5/1、3/1、2/1)梯度洗脱，tlc分析，合并相似组分，共得到7个组分(fr.1–7)。将组分fr.6(3.5g)采用硅胶柱色谱分离，以石油醚/丙酮(v/v，4/1)洗脱，tlc分析，合并相似组分，共得到4个组分(fr.6a–6d)。将组分fr.6c(1.79g)以葡聚糖凝胶sephadexlh-20柱色谱(二氯甲烷/甲醇，v/v，1/1)脱除色素，脱色素后的洗脱组分合并，40℃减压浓缩至干，进一步以ods柱色谱(甲醇/水，v/v，80/20，85/15，90/10)分离，tlc分析，合并相似组分，共得到6个组分(fr.6c1–6c6)。将组分fr.6c2(9.0mg)以半制备hplc纯化，得到化合物3β-羟基-19-乙酰氧基-麦角甾-5,24(28)-二烯-7-酮(2.2mg)。
(2)半制备hplc色谱分离条件
仪器：安捷伦1100液相色谱仪配g1314a紫外检测器。
色谱柱：ymcc18柱(250×15mm,5μm)。
流动相：甲醇/水(v/v，90/10)；流速：2.0ml/min；检测波长：210nm。
收集保留时间为56.4min的色谱峰，减压浓缩至干，得3β-羟基-19-乙酰氧基-麦角甾-5,24(28)-二烯-7-酮。
3β-羟基-19-乙酰氧基-麦角甾-5,24(28)-二烯-7-酮的核磁共振数据和质谱数据如下：
1hnmr(cdcl3,600mhz):δ2.11(1h,m,h-1a),1.26(1h,m,h-1b),2.02(1h,m,h-2a),1.55(1h,m,h-2b),3.70(1h,m,h-3),2.57(1h,m,h-4a),2.47(1h,t,j＝12.6hz,h-4b),5.88(1h,s,h-6),2.60(1h,t,j＝11.4hz,h-8),1.54(1h,m,h-9),1.65(2h,m,h-11),2.08(1h,m,h-12a),1.14(1h,m,h-12b),1.29(1h,m,h-14),2.36(1h,m,h-15a),1.31(1h,m,h-15b),1.92(1h,m,h-16a),1.27(1h,m,h-16b),1.12(1h,m,h-17),0.70(3h,s,h-18),4.68(1h,d,j＝12.0hz,h-19a),4.12(1h,d,j＝12.0hz,h-19b),1.42(1h,m,h-20),0.95(3h,d,j＝6.6hz,h-21),1.56(1h,m,h-22a),1.17(1h,m,h-22b),2.09(1h,m,h-23a),1.88(1h,m,h-23b),2.22(1h,h,j＝6.6hz,h-25),1.02(3h,d,j＝6.6hz,h-26),1.03(3h,d,j＝6.6hz,h-27),4.72(1h,s,h-28a),4.66(1h,s,h-28b),2.03(3h,s,oac)；13cnmr(cdcl3,150mhz):δ33.6(c-1),31.0(c-2),70.5(c-3),42.1(c-4),159.3(c-5),129.2(c-6),202.0(c-7),46.7(c-8),50.0(c-9),41.3(c-10),21.7(c-11),39.1(c-12),43.5(c-13),51.2(c-14),26.2(c-15),28.5(c-16),54.6(c-17),12.1(c-18),64.6(c-19),35.7(c-20),18.9(c-21),34.7(c-22),31.4(c-23),156.8(c-24),33.8(c-25),21.9(c-26),22.0(c-27),106.1(c-28),20.9(oac),170.4(oac)；hr-esi-ms:m/z493.3308[m+na]+(c30h46o4na)。结构解析表明该化合物为3β-羟基-19-乙酰氧基-麦角甾-5,24(28)-二烯-7-酮。
实施例2化合物对h2o2诱导的神经元样细胞pc12氧化损伤的抑制作用测定
取对数生长期的pc12细胞以5000个细胞/孔接种于96孔培养板，每孔100μl培养基，在37℃含5％co2的培养箱中过夜。每孔加入化合物(10μm)或tbhq(阳性对照，10μm)预培养24h，再给予一定浓度的h2o2(350、400和500μm)刺激24h，最后加入mtt溶液(5mg/ml)20μl放入培养箱中继续培养。4h后吸走各个孔中的液体，加入dmso(120μl/孔)，振荡混匀10min，用酶联免疫检测仪于490nm波长处测定其吸光度(a值)，dmso组为空白对照b。计算细胞生存率(实验组a值/对照组b值×100％)，本实验重复三次。实验结果如图6所示，化合物3β-羟基-19-乙酰氧基-麦角甾-5,24(28)-二烯-7-酮在10μm浓度条件下，对350、400和500μmh2o2诱导的pc12细胞氧化损伤均具有保护作用，能够显著提高细胞存活率，且细胞保护作用优于阳性对照tbhq组，可用于脑缺血再灌注损伤的预防或治疗。
实施例3化合物对h2o2诱导的神经元样细胞pc12中mda生成的抑制作用测定
将pc12细胞以每孔4×106个/ml密度接种于6孔板中，培养24h后，设置4组分别为：空白对照组(dmso)、阳性对照组(tbhq，10μm)、模型组(h2o2组，750μm)、给药组(2.5和10μm)。给药组中化合物提前孵育24h，然后给予750μmh2o2刺激16h，再用ripa裂解液裂解细胞，离心(1600×g,10min)收集上清液，根据mda检测试剂盒说明书检测mda含量。
实验结果如图7所示，化合物3β-羟基-19-乙酰氧基-麦角甾-5,24(28)-二烯-7-酮能够显著降低h2o2诱导的pc12细胞损伤模型中mda的含量，且呈剂量依赖性，表现出明显的抗脂质氧化活性，10μm浓度下的抗氧化活性水平与阳性对照tbhq相当。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。