本发明属于分子生物学级遗传育种技术领域，尤其涉及一种与小麦株高性状主效qtl紧密连锁的分子标记及其应用。
背景技术
小麦是我国第三大粮食作物。随着人口不断增加和耕地面积的减少，进一步提高我国小麦单产对于对保障国家粮食安全具有重要的现实意义。发现和利用产量相关的关键基因，对挖掘小麦产量遗传潜力，提高小麦单产起着重要作用。例如，“绿色革命”中半矮秆品种的培育使小麦等作物产量得到了大幅度提高。小麦矮秆基因rht1的克隆及功能研究说明，一个或少数基因就有可能导致一次产量育种的重大突破。最新研究表明，rht1基因在降低株高的同时，也导致粒重显著降低。因此，要打破现有高产品种的单产水平，需要利用新的矮秆基因，相关基因的定位和克隆也是小麦株高性状改良的重要基础。
矮杆基因的发现和利用最早始于19世纪日本的地方品种赤小麦(akagomugi)和达摩(darμma)。1916年，育种家strampelli利用赤小麦参加杂交在意大利育成矮杆小麦品种矮粒多(赵洪璋等，1991)。1935年，日本从达摩矮源的杂交后代中育成了著名的农林10号。之后，美国于20世纪40年代引进农林10号育成了高产品种gaines和nugains；20世纪70年代，英国j.a.report利用农林10号的衍生系育成了最早的高产品种marisfundin和hobbit。1962年，世界玉米小麦改良中心利用农林10号育成了丰产性强、适应性广、株高65cm-85cm、叶片直立的墨西哥小麦pitic62、penjamo62等第一批矮杆春小麦，在中美、中东、南亚、南美、北非等地广为种植。1964年利用智利小麦沃格尔系的衍生后代，1974年育成了半矮秆冬小麦品种fundin，随后又育成hobbit、norman、avelon等半矮秆高产品种，推广面积达4000万hm2以上。
国内外学者已经利用不同的遗传背景及不同环境条件对株高qtl进行了定位分析研究。ellis等(2005)定位了许多能降低株高但不影响早期生长的基因。keller等(1999)利用普通小麦forno和斯卑尔脱小麦oberkulmer的重组自交系群体，在三个环境中检测到分布于9条染色体上的11个qtls，单个qtl可解释表型变异的7.9％-31.4％，全部qtls可解释72.6％的表型变异。刘冬成等(2003)利用nd3338×f390的f2:3家系在4个环境条件下定位了7个与小麦株高相关的qtl，单个qtl可解释表型变异的5.2％-37.2％，所有的qtl可解释表型变异的64.8％-75.0％。wang等(2009)利用heshangmai×yu8679的ril群体检测到6个株高qtl，分别位于1d、2d、3d和4d染色体上，单个qtl可解释表型变异的5.83％-25.24％。
我国在小麦的育种中也利用了小麦的矮杆基因，但是矮杆基因来源比较单一。杨松杰等(2006)对中国主要麦区的239份品种的矮杆基因频率分析结果表明，中国小麦品种或品系携带的rht-b1b矮秆基因来自st2422/464和农林10号，rht-d1b矮秆基因来自农林10号、水源86、辉县红和蚰包麦。我国生产上利用的矮源研究较多的是rht-b1b、rht-d1b和rht8，不同麦区3个矮秆基因的分布频率大小不同(张晓科等，2007)。
分子标记的开发利用及分子标记技术的日趋成熟和完善，进一步为小麦数量性状基因的定位研究提供了有利工具。cadalen等(1998)利用courtot与中国春杂交产生的dh群体定位了9个与小麦株高相关的qtl，其中有2个rflp标记xfba1-4b、xfba211-4d分别与矮秆基因rht1、rht2连锁。石涛等(2008)通过bsa法，利用f2分离群体筛选到2a染色体上的2个ssr标记wmc522和wmc198与矮秆基因连锁。
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供检测待测小麦株高的引物对。
本发明提供的引物对，为用于扩增靶片段的引物对；
所述靶片段为含有由引物1和引物2扩增得到的片段的片段；
所述引物1为如下a1)或a2)：
a1)序列1所示的单链dna分子；
a2)将a1)限定的单链dna分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与a1)限定的单链dna分子具有相同功能的单链dna分子；
所述引物2为如下b1)或b2)：
b1)序列2所示的单链dna分子；
b2)将b1)限定的单链dna分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与b1)限定的单链dna分子具有相同功能的单链dna分子。
上述引物对由序列1所示的单链dna分子和序列2所示的单链dna组成。
含有上述引物对的pcr试剂也是本发明保护的范围。
上述pcr试剂中，所述每条引物在所述pcr试剂中的终浓度均为2-4μm。
含有上述引物对或上述的pcr试剂的试剂盒也是本发明保护的范围。
上述引物对或上述的pcr试剂或上述的试剂盒在检测待测小麦株高中的应用也是本发明保护的范围。
上述引物对或上述的pcr试剂或上述的试剂盒在预测或筛选或培育矮杆待测小麦中的应用也是本发明保护的范围；
或上述引物对或上述的pcr试剂或上述的试剂盒在预测或筛选或培育高杆待测小麦中的应用也是本发明保护的范围。
本发明另一个目的是提供一种检测待测小麦株高的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：用上述引物对或上述的pcr试剂或上述的试剂盒对待测小麦进行pcr扩增，检测pcr产物；pcr扩增产物大小为139-145bp(具体为141bp)的待测小麦的株高低于pcr扩增产物大小为130-134bp(具体为132bp)的待测小麦的株高。
本发明第3个目的是提供一种检测待测小麦株高的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：用上述引物对或上述的pcr试剂或上述的试剂盒对待测小麦进行pcr扩增，检测pcr产物；以豫麦8679和京411为对照进行相同扩增；
与所述豫麦8679的pcr扩增产物带型一致的待测小麦的株高低于与所述京411的pcr扩增产物带型一致的待测小麦。
本发明第4个目的是提供一种培育矮杆待测小麦的方法。
本发明提供的方法，为培育上述方法获得的pcr扩增产物大小为141bp的待测小麦或培育上述方法获得的与所述豫麦8679的pcr扩增产物带型一致的待测小麦；
本发明第5个目的是提供一种培育高杆待测小麦的方法。
本发明提供的方法，为培育上述方法获得的pcr扩增产物大小为132bp的待测小麦或培育上述方法获得的与所述京411的pcr扩增产物带型一致的待测小麦。
上述待测小麦为豫麦8679、京411、或豫麦8679和京411杂交后衍生的ril群体或所述剩余杂合系自交后代，具体为豫麦8679和京411的ril系yj-171中杂合体自交得到的的f2代群体。
本发明的引物对ssr-2433，是与株高主效基因位点rht8紧密连锁的标记，且是基于pcr技术的共显性ssr标记，因而可靠且使用方便。实验证明，利用引物对ssr-2433对小麦分离群体进行辅助选择。结果表明，基因型与高秆亲本京411一致的单株显著高于基因型与矮秆亲本一致的单株，这表明引物对ssr-2433用于小麦矮秆育种的分子标记辅助选择是切实有效的。本发明通过对小麦株高性状的qtl定位，定位到的qpht.cau-2d.2与小麦的rht8基因位置相同(参考文献，(gasperinietal.2012))，并获得了与其紧密连锁的分子标记ssr-2433，该小麦的主效基因位点qpht.cau-2d.2/rht8，可解释12.07％的表型变异，可用于图位克隆和分子标记辅助选择。在常规育种方法中，株高性状要等到成熟期才能鉴定，且易受环境影响，鉴定田间误差大，选择效率低下。通过苗期检测株高主效基因位点来预测小麦株高性状，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率，从而加快育种进程。本发明中株高主效基因位点位置明确，主效基因位点的检测方法方便快速，不受环境影响。通过检测与株高主效基因位点紧密连锁的分子标记，即可准确快速筛选矮秆材料。
附图说明
图1为利用ssr-2433对豫麦8679和京411，及其衍生的ril群体的基因组dna进行pcr得到的pcr产物的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图2为小麦2d染色体对应的连锁图谱；左侧是标记的遗传位置，右侧是标记名称及rht8(斜体)的置信区间示意图。
图3为小麦株高性状定位结果图；图中横坐标是连锁图谱，纵坐标为lod值，箭头所指位置是小麦株高主效位点qpht.cau-2d.2/rht8的位置。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、小麦株高定位群体和分离群体的构建及性状测定
本实施例中使用的群体为豫麦8679和京411衍生的ril群体和f2群体(由ril群体中的一个剩余杂合系yj-171衍生的f2群体。
ril群体和杂合系yj-171均记载在如下文献中：zhaihj,fengzy,lij,liuxy,xiaosh,nizf,sunqx(2016)qtlanalysisofspikemorphologicaltraitsandplantheightinwinterwheat(triticμmaestivμml.)usingahigh-densitysnpandssr-basedlinkagemap.frontiersinplantscience7.doi:10.3389/fpls.2016.01617。ril群体的株高表型数据也可从该文献获得，yj-171衍生的f2群体的表型是测量得到的。
yj-171衍生的f2群体为将ril系yj-171中的杂合体自交得到f2群体。
一、苗期叶片总dna的提取
(1)取新鲜叶片长度1cm，放入1.2ml的离心管，加入直径4mm的钢珠，液氮速冻后磨碎。
(2)加入300μl的ctab，65度恒温水浴60min，期间混匀2-3次。
(3)加入300μl的氯仿：异戊醇(24:1，v/v)，轻轻颠倒使其混匀，10000rpm离心10min，吸取100μl的上清液转入新的pcr板。
(4)加入100μl异丙醇，至于-20℃冷冻30min让dna析出；10000rpm离心5min让dna沉淀，倒掉上清液，用75％的乙醇清洗沉淀2次，沉淀置于通风橱吹干；
(5)加入100μlddh2o溶解dna，用紫外分光光度计测定dna的浓度，于-20℃冰箱中保存备用。
二、引物的开发和合成
发明人已经通过生物公司合成了公共和新开发的ssr引物。
利用两个亲本豫麦8679和京411的dna作为筛选引物的模板，利用溶解后的引物对亲本dna进行pcr扩增，pcr反应体系(10μl体系)如下表1：
表1
pcr反应程序(10μl体系)如下表2：
表2
将pcr产物聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
挑选出在亲本中存在多态性引物对ril群体的191系的dna进行pcr扩增，然后对pcr产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读(图1)。ssr标记为共显性标记，即差异条带表现为位置上(既扩增产物大小)的变异，分离群体的带型依情况分别读作a和b，分别表示来源于豫麦8679和京411。通过对染色后获得的分子标记带型进行判读，获得分子标记基因型数据。利用joinmap4.0软件对ril群体的分子标记基因型数据进行连锁分析以构建分子标记遗传连锁图谱(图2)。基于该遗传图谱、ril群体的基因型数据以及株高表型数据利用qtlcart2.5软件进行株高qtl检测，在2d染色体ssr标记ssr-2433(表3)附近检测到了一个重复性很好的主效qtl位点(图3)，其lod值和贡献率都较大(表4)。
表32d连锁群株高主效qtl连锁标记ssr-2433的引物序列
结果可以看出，筛选出ssr标记ssr-2433为目标分子标记，其由序列1所示的单链dna分子和序列2所示的单链dna分子组成。
实施例2、分子标记ssr-2433在矮秆育种中的应用
1、田间种植豫麦8679和京411的f2群体。
2、苗期挂牌取样，并提取叶片总dna，利用分子标记ssr-2433对其进行pcr扩增，pcr扩增体系按照表1所示，pcr扩增反应按照表2所示。
聚丙烯酰胺凝胶电泳检测pcr产物的带型，根据不同的带型，将f2单株分为a带型、b带型和h带型三类。
a带型为与亲本豫麦8679一致的带型，条带大小141bp；
b带型为与亲本京411一致的带型，条带大小132bp；
h带型为两条条带同时存在。
3、在成熟期考察f2单株的株高，在收获前测量地面到穗子顶端(不包括麦芒)的距离，如表5所示。
从表5可以看出，分子标记ssr-2433的基因型为a带型单株的株高均值显著低于b带型单株的株高均值。
因此，可以用分子标记ssr-2433辅助检测待测小麦的株高，具体如下：
用分子标记ssr-2433扩增待测小麦，检测pcr产物，
pcr扩增产物大小为141bp的待测小麦的株高低于pcr扩增产物大小为132bp的待测小麦的株高。
或，以豫麦8679和京411为对照进行相同扩增；与所述豫麦8679的pcr扩增产物带型(带型a)一致的待测小麦的株高低于与所述京411的pcr扩增产物带型(带型b)一致的待测小麦。
将表5的a带型和b带型的株高数据取平均值，结果如表6所示，可以看出，a带型待测小麦群体的平均株高低于b带型待测小麦群体的平均株高。
因此，可以用分子标记ssr-2433辅助检测待测小麦群体的株高，具体如下：用分子标记ssr-2433扩增待测小麦群体，检测pcr产物的带型，
pcr扩增产物大小为141bp的待测小麦群体的株高低于pcr扩增产物大小为132bp的待测小麦群体的株高。
或，以豫麦8679和京411为对照进行相同扩增；与所述豫麦8679的pcr扩增产物带型(带型a)一致的待测小麦群体的株高低于与所述京411的pcr扩增产物带型(带型b)一致的待测小麦群体。
上述低株高的小麦可以用于培育矮杆小麦。
表5利用ssr标记ssr-2433辅助选择的f2群体单株的基因型和株高数据
表6
序列表
<110>中国农业大学
<120>一种与小麦株高性状主效qtl紧密连锁的分子标记及其应用
<160>2
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>22
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
gcaattcctagagatcaaattc22
<210>2
<211>21
<212>dna
<213>人工序列
<400>2
gtgtagcattccatctcattc21