鹌鹑成纤维细胞培养基及其制备方法与流程

本发明属于未分化的脊椎动物细胞或组织培养基技术领域，具体涉及一种鹌鹑成纤维细胞培养基及其制备方法。

背景技术

组织工程是将工程学原理和生命科学相结合，研究开发用于组织和器官修复、改善和功能维持的生物替代物（“组织工程皮肤发展现状”，杨维等，中国科学：生命科学，2015年第45卷第5期，第460-470页，公开日2015年12月31日），用于修复、维持或改善机体形态和功能的一门新兴的交叉学科（“组织工程皮肤构建的研究进展”，孙锦章等，国际外科学杂质，2006年第33卷第5期，第389-393页，公开日2006年12月31日），属于再生医学范畴。临床上对组织器官的大量需求，促进了组织工程研究及其产业的快速发展（“组织工程皮肤发展现状”，杨维等，中国科学：生命科学，2015年第45卷第5期，第460-470页，公开日2015年12月31日）。其中，组织功能皮肤是组织工程迄今为止最成功的产品之一，由原代培养的皮肤细胞和细胞外间质（英文简称ecm，主要为胶原蛋白）组成，是有活性的皮肤，是应对供体皮肤匮乏的有效策略，可避免受伤部位体液流失和感染，并可以促进细胞因子和生长因子的分泌，从而加速伤口愈合（“组织功能皮肤的现状和展望”，郝文丽等，背景生物医学工程，2016年第35卷第1期，第94-99页，公开日2016年02月29日）。

种子细胞作为组织工程的基本要素，其黏附、增殖能力、分化程度及免疫特性是生物活性皮肤构建过程中需重点考虑的问题。目前，用于构建组织工程皮肤替代物的种子细胞主要有表皮细胞、成纤维细胞和干细胞等。其中，成纤维细胞的生物学作用广泛,增殖快,黏附力强,同时因为成纤维细胞、特别是胎儿来源的成纤维细胞免疫原性低,不引起机体明显的排斥反应,因此，成纤维细胞是目前皮肤组织工程应用最为广泛的种子细胞（“组织工程皮肤种子细胞的研究进展”，孙强等，感染、炎症、修复，2008年第9卷第1期，第55-57页，）。成纤维现阶段，种子细胞的大规模体外培养是组织工程皮肤研发中需要解决的一大问题（cn103911339a，公开日2014年07月09日）。传统的用于鹌鹑成纤维细胞培养的细胞培养基要添加20％的胎牛血清，才能促进鹌鹑成纤维细胞更好地生长，而胎牛血清价格昂贵，获取困难，多依靠进口。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鹌鹑成纤维细胞培养基，该培养基成本低，能够明显促进鹌鹑成纤维细胞的增殖，同时，能够提高鹌鹑成纤维细胞在体外培养的适应能力，减少细胞脱落、死亡。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

鹌鹑成纤维细胞培养基，包括dmem培养基、鸡尿囊液提取液、胎牛血清和黄芪多糖注射液。

所述dmem的英文全称为dulbecco'smodifiedeaglemedium，中文译名为改良杜氏伊格尔培养基，是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在mem培养基的基础上研制的。与mem比较增加了各种成分用量。

发明人意外发现，将以上培养基用于鹌鹑成纤维细胞培养，能够明显促进鹌鹑成纤维细胞增殖。同时，能够提高鹌鹑成纤维细胞在体外培养的适应能力，减少细胞脱落、死亡。

进一步，所述鸡尿囊液提取液为孵化的鸡蛋中的尿囊液冻融后离心得到的上清液。

进一步，所述孵化的时间为5-12天。

进一步，离心的转速为500-1000转/分钟，时间为5-10分钟。

进一步，以体积百分比计，配比关系为：65%-75%dmem培养基、5%-15%胎牛血清、15%-25%鸡尿囊液提取液和1%-5%黄芪多糖注射液。

发明人意外发现，按照上述比例配比，培养基能够明显促进鹌鹑成纤维细胞增殖。

进一步，所述dmem培养基为高糖型dmem基础培养基的基础上添加1.5-2.5mmol/l的l-谷氨酰胺、1.5-2.5mmol/l的丙酮酸钠和10-15mmol/l的4-羟乙基哌嗪乙磺酸。

进一步，所述高糖基dmem基础培养基的葡萄糖浓度为1000-4500mg/l。

本发明的目的还在于保护所述鹌鹑成纤维细胞培养基的制备方法，包括以下步骤：

a.取鸡尿囊液提取液并于0-4℃温度下保存；

b.将dmem培养基、胎牛血清、步骤a所得鸡尿囊液提取液和黄芪多糖注射液混合均匀，即得。

该方法简单易行，易于实现工业化生产。

本发明的有益效果在于：

本发明的培养基能够明显促进鹌鹑成纤维细胞的生长、增殖。

本发明的培养基能够提高鹌鹑成纤维细胞在体外培养的适应能力，减少细胞脱落、死亡。

本发明的培养基能够提高细胞的繁殖生长能力和在培养瓶中保持其生物活性的能力，并能够在细胞生长繁殖过程中防止细胞的非遗传性变异，使其具有稳定性遗传繁殖能力，并且能够降低细胞代谢产物的毒副作用。

本发明的原料鸡尿囊液提取液和黄芪多糖注射液的成本低，获取容易。

采用本发明的培养基培养鹌鹑成纤维细胞，效率提高，与市售培养基相比，长满细胞90%的时间提前4-8小时。

采用本发明的培养基培养鹌鹑成纤维细胞，成活率高，与市售培养基相比，成活率提高30%-60%。

本发明减少了培养基中胎牛血清的比例，降低了成本。

本发明的培养基的制备方法简单易行，易于实现工业化生产。

附图说明

图1为实施例2中鹌鹑成纤维细胞生长与增殖情况图，其中，a为采用实施例1的培养基的鹌鹑成纤维细胞的生长与增殖情况图，b为采用市售培养基的鹌鹑成纤维细胞的生长与增殖情况图；

图2为实施例4中鹌鹑成纤维细胞生长与增殖情况图，其中，a为采用实施例3培养基的鹌鹑成纤维细胞的生长与增殖情况图，b为采用市售培养基的鹌鹑成纤维细胞的生长与增殖情况图；

图3为实施例6中鹌鹑成纤维细胞生长与增殖情况图，其中，a为采用实施例5培养基的鹌鹑成纤维细胞的生长与增殖情况图，b为采用市售培养基的鹌鹑成纤维细胞的生长与增殖情况图；

图4为实施例8中鹌鹑成纤维细胞生长与增殖情况图，其中，a为采用实施例7培养基的鹌鹑成纤维细胞的生长与增殖情况图，b为采用市售培养基的鹌鹑成纤维细胞的生长与增殖情况图；

图5为实施例10中鹌鹑成纤维细胞生长与增殖情况图，其中，a为采用实施例9培养基的鹌鹑成纤维细胞的生长与增殖情况图，b为采用市售培养基的鹌鹑成纤维细胞的生长与增殖情况图。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

以下高糖型基础培养基购自：生工生物工程（上海）股份有限公司，生产批号为20180125；

以下谷氨酰胺购自：生工生物工程（上海）股份有限公司，生产批号为20180325；

以下丙酮酸钠购自：生工生物工程（上海）股份有限公司，生产批号为20180322；

以下4-羟乙基哌嗪乙磺酸购自：生工生物工程（上海）股份有限公司，生产批号为20180520；

以下胎牛血清购自：生工生物工程（上海）股份有限公司，生产批号为20180518；

以下黄芪多糖注射液购自：江西博莱大药厂有限公司，生产批号为20180322。

实施例1

鹌鹑成纤维细胞培养基，以体积百分比计，其组成为：70%dmem培养基（高糖型dmem基础培养基的基础上添加2.5mmol/l的谷氨酰胺、2.5mmol/l的丙酮酸钠和15mmol/l的4-羟乙基哌嗪乙磺酸），8％胎牛血清、20%鸡尿囊液提取液和2%黄芪多糖注射液。

所述培养基的制备方法为：

a.取一个鸡蛋，孵化8天，无菌吸取尿囊液，反复冻融3次后(-20℃冻存后再在室温下解冻，反复3次），500转/分钟转速下离心10分钟并取上清液，得到鸡尿囊液提取液，并4℃温度下保存待用；

b.按照配比量取dmem培养基、胎牛血清和鸡尿囊液提取液及黄芪多糖注射液，并混合均匀，即得鹌鹑成纤维细胞培养基。

实施例2

将实施例1制得的鹌鹑成纤维细胞培养基和市售培养基（胎牛血清体积比为20%）分别用于鹌鹑成纤维细胞的培养，具体条件设置为：37℃、co2培养箱中培养；

然后，测试鹌鹑成纤维细胞的生长增殖情况，具体测试方法为：培养12小时后，将培养瓶从培养箱中取出，在显微镜计数并观察细胞生长情况；各组别除培养基不同外，其他参数设置完全相同。其结果如图1所示，其中，a为采用实施例1的培养基的鹌鹑成纤维细胞的生长与增殖情况图，b为采用市售培养基的鹌鹑成纤维细胞的生长与增殖情况图。

由图1可知，与市售培养基相比，实施例1的培养基用于鹌鹑成纤维细胞培养，鹌鹑成纤维细胞的生长与增殖得到了明显增强。传统培养基培养的鹌鹑成纤维细胞培养空泡、死亡率较高。由此证明，本发明的培养基能够显著促进鹌鹑成纤维细胞的生长、增殖。

实施例3

鹌鹑成纤维细胞培养基，以体积百分比计，其组成为：65%dmem培养基（高糖型dmem基础培养基的基础上添加1.0mmol/l的谷氨酰胺、1.0mmol/l的丙酮酸钠和10mmol/l的4-羟乙基哌嗪乙磺酸），13％胎牛血清、20%鸡尿囊液提取液和2%黄芪多糖注射液。

所述培养基的制备方法为：

a.取一个鸡蛋，孵化9天，无菌吸取尿囊液，反复冻融3次后(-20℃冻存后再在室温下解冻，反复3次），1000转/分钟转速下离心5分钟并取上清液，得到鸡尿囊液提取液，并4℃温度下保存待用；

b.按照配比量取dmem培养基、胎牛血清、鸡尿囊液提取液和黄芪多糖注射液，并混合均匀，即得鹌鹑成纤维细胞培养基。

实施例4

将实施例3制得的鹌鹑成纤维细胞培养基和市售培养基（胎牛血清体积比为20%）分别用于鹌鹑成纤维细胞的培养，具体条件设置为：37℃、co2培养箱中培养；

然后，测试鹌鹑成纤维细胞的生长增殖情况，具体测试方法为：培养12小时后，将培养瓶从培养箱中取出，在显微镜计数并观察细胞生长情况；各组别除培养基不同外，其他参数设置完全相同。其结果如图2所示，其中，a为采用实施例3的培养基的鹌鹑成纤维细胞的生长与增殖情况图，b为采用市售培养基的鹌鹑成纤维细胞的生长与增殖情况图。

由图2可知，与市售培养基相比，实施例3的培养基用于鹌鹑成纤维细胞培养，鹌鹑成纤维细胞的生长与增殖得到了明显增强。传统培养基培养的鹌鹑成纤维细胞培养空泡、死亡率较高。由此证明，本发明的培养基能够显著促进鹌鹑成纤维细胞的生长、增殖。

实施例5

鹌鹑成纤维细胞培养基，以体积百分比计，其组成为：60%dmem培养基（高糖型dmem基础培养基的基础上添加1.2mmol/l的谷氨酰胺、1.2mmol/l的丙酮酸钠和11mmol/l的4-羟乙基哌嗪乙磺酸），15％胎牛血清、22%鸡尿囊液提取液和3%黄芪多糖注射液。

所述培养基的制备方法为：

a.取一个鸡蛋，孵化13天，无菌吸取尿囊液，反复冻融3次后(-20℃冻存后再在室温下解冻，反复3次），800转/分钟转速下离心7分钟并取上清液，得到鸡尿囊液提取液，并0℃温度下保存待用；

b.按照配比量取dmem培养基、胎牛血清和鸡尿囊液提取液及黄芪多糖注射液，并混合均匀，即得鹌鹑成纤维细胞培养基。

实施例6

将实施例5制得的鹌鹑成纤维细胞培养基和市售培养基（胎牛血清体积比为20%）分别用于鹌鹑成纤维细胞的培养，具体条件设置为：37℃、co2培养箱中培养；

然后，测试鹌鹑成纤维细胞的生长增殖情况，具体测试方法为：培养12小时后，将培养瓶从培养箱中取出，在显微镜计数并观察细胞生长情况；各组别除培养基不同外，其他参数设置完全相同。其结果如图3所示，其中，a为采用实施例5的培养基的鹌鹑成纤维细胞的生长与增殖情况图，b为采用市售培养基的鹌鹑成纤维细胞的生长与增殖情况图。

由图3可知，与市售培养基相比，实施例5的培养基用于鹌鹑成纤维细胞培养，鹌鹑成纤维细胞的生长与增殖得到了明显增强。传统培养基培养的鹌鹑成纤维细胞培养空泡、死亡率较高。由此证明，本发明的培养基能够显著促进鹌鹑成纤维细胞的生长、增殖。

实施例7

鹌鹑成纤维细胞培养基，以体积百分比计，其组成为：75%dmem培养基（高糖型dmem基础培养基的基础上添加1.5mmol/l的谷氨酰胺、1.5mmol/l的丙酮酸钠和12mmol/l的4-羟乙基哌嗪乙磺酸），10％胎牛血清、10%鸡尿囊液提取液和5%黄芪多糖注射液。

所述培养基的制备方法为：

a.取一个鸡蛋，孵化14天，无菌吸取尿囊液，反复冻融3次后(-20℃冻存后再在室温下解冻，反复3次），600转/分钟转速下离心9分钟并取上清液，得到鸡尿囊液提取液，并4℃温度下保存待用；

b.按照配比量取dmem培养基、胎牛血清、鸡尿囊液提取液和黄芪多糖注射液，并混合均匀，即得鹌鹑成纤维细胞培养基。

实施例8

将实施例7制得的鹌鹑成纤维细胞培养基和市售培养基（胎牛血清体积比为20%）分别用于鹌鹑成纤维细胞的培养，具体条件设置为：37℃、co2培养箱中培养；

然后，测试鹌鹑成纤维细胞的生长增殖情况，具体测试方法为：培养12小时后，将培养瓶从培养箱中取出，在显微镜计数并观察细胞生长情况；各组别除培养基不同外，其他参数设置完全相同。其结果如图4所示，其中，a为采用实施例7的培养基的鹌鹑成纤维细胞的生长与增殖情况图，b为采用市售培养基的鹌鹑成纤维细胞的生长与增殖情况图。

由图4可知，与市售培养基相比，实施例7的培养基用于鹌鹑成纤维细胞培养，鹌鹑成纤维细胞的生长与增殖得到了明显增强。传统培养基培养的鹌鹑成纤维细胞培养空泡、死亡率较高。由此证明，本发明的培养基能够显著促进鹌鹑成纤维细胞的生长、增殖。

实施例9

鹌鹑成纤维细胞培养基，以体积百分比计，其组成为：75%dmem培养基（高糖型dmem基础培养基的基础上添加2.5mmol/l的谷氨酰胺、2.5mmol/l的丙酮酸钠和15mmol/l的4-羟乙基哌嗪乙磺酸），7％胎牛血清、15%鸡尿囊液提取液和3%黄芪多糖注射液。

所述培养基的制备方法为：

a.取一个鸡蛋，孵化15天，无菌吸取尿囊液，反复冻融3次后(-20℃冻存后再在室温下解冻，反复3次），500转/分钟转速下离心10分钟并取上清液，得到鸡尿囊液提取液，并4℃温度下保存待用；

b.按照配比量取dmem培养基、胎牛血清和鸡尿囊液提取液及黄芪多糖注射液，并混合均匀，即得鹌鹑成纤维细胞培养基。

实施例10

将实施例9制得的鹌鹑成纤维细胞培养基和市售培养基（胎牛血清体积比为20%）分别用于鹌鹑成纤维细胞的培养，具体条件设置为：37℃、co2培养箱中培养；

然后，测试鹌鹑成纤维细胞的生长增殖情况，具体测试方法为：培养12小时后，将培养瓶从培养箱中取出，在显微镜计数并观察细胞生长情况；各组别除培养基不同外，其他参数设置完全相同。其结果如图5所示，其中，a为采用实施例9的培养基的鹌鹑成纤维细胞的生长与增殖情况图，b为采用市售培养基的鹌鹑成纤维细胞的生长与增殖情况图。

由图5可知，与市售培养基相比，实施例9的培养基用于鹌鹑成纤维细胞培养，鹌鹑成纤维细胞的生长与增殖得到了明显增强。传统培养基培养的鹌鹑成纤维细胞培养空泡、死亡率较高。由此证明，本发明的培养基能够显著促进鹌鹑成纤维细胞的生长、增殖。

同时，检测实施例2、实施例4、实施例6、实施例8、实施例10中细胞空泡死亡率及长满90%所需时间，结果如表1所示；

其中，细胞死亡率的检测方法为：采用美兰染色法对培养瓶中的培养了6小时的细胞进行染色，如果是活细胞由于细胞膜的选择透过性，将不会被染色，而死细胞的细胞膜失去了选择透过性，会被染色；死细胞与所有细胞的比值即为细胞死亡率。

长满90%所需时间的检测方法为：不同培养基在25cm²的培养瓶中接种相同数量的细胞后细胞长满90%面积所需时间。

表1性能测试效果

备注：对于实施例2而言，本发明培养基具体指实施例1制得的培养基；对于实施例4而言，本发明培养基具体指实施例3制得的培养基；对于实施例6而言，本发明培养基具体指实施例5制得的培养基；对于实施例8而言，本发明培养基具体指实施例7制得的培养基；对于实施例10而言，本发明培养基具体指实施例9制得的培养基。

由表1可知，与市售培养基相比，采用本发明的培养基培养鹌鹑成纤维细胞，长满细胞90%的时间提前4-8小时，且成活率提高30%-60%。由此证明，采用本发明的培养基培养鹌鹑成纤维细胞，不仅效率提高，且效果更好。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。