一种从木姜叶柯中提取三叶苷的工艺的制作方法

本发明涉及单体分离技术领域，具体是涉及一种从木姜叶柯中提取三叶苷的工艺。

背景技术

甜味剂是指赋予食品或饲料以甜味，提高食品品质，满足人们对食品需求的食物添加剂。木姜叶柯(lithocarpuspachyphyllus(kurz)rehd.)又叫多穗石柯，多穗柯，别名甜茶、甜叶子树、胖稠、甜味茶、大叶稠子、苷茶、多穗柯，是壳斗科石柯属植物，是潜伏在大山深处的珍贵林药树种，兼具茶、糖、药三种功能。其嫩叶(或嫩叶制成品)经浸泡后有很高的甜味，因而被称为“甜茶”。多穗柯的化学成分主要为黄酮类和三萜类成分，其中嫩叶中三叶苷为多穗柯甜茶的主要甜味成分，其含量达到总黄酮的85％以上。三叶苷的因为具有很好的降血糖作用和新的甜味剂资源会不断拓展，但对于这样一个优良的天然甜味剂，应该如何大量制备分离，我们进行了相关研究，开发了一种简洁、方便和快速的提取分离方法。

《一种含三叶苷的活性分离物及其用途》(申请号cn101874824a)报道了一种高含量三叶苷活性分离物具有治疗糖尿病、糖尿病肾病和肝水肿等疾病。《包含苦味阻断剂的含苦味生物碱的消费品》(申请号cn102065707a)报道了三叶苷能降低和阻断由咖啡碱、茶碱和可可碱等苦味生物碱引起的苦味。随着科技的发展，三叶苷的用途会不断拓展，但对于这样一个优良的天然甜味剂，应该如何大量制备分离，本方法目前国内外未见报道。

技术实现要素：

针对以上技术问题，本发明提供了一种从木姜叶柯中提取三叶苷的工艺。

本发明的技术方案是：

一种从木姜叶柯中提取三叶苷的工艺，包括以下步骤：

s1：原料粉碎：选用4-11月产的木姜叶柯叶，通过粉碎机进行粗粉碎，得到木姜叶柯颗粒，将所得木姜叶柯颗粒经过10目筛过筛，得到木姜叶柯粗粉；

s2：加热分离：将步骤s1的到的木姜叶柯粗粉放入加热回流分离器中，再对加热回流分离器中的木姜叶柯粗粉添加纯净水，加热回流分离器中的木姜叶柯粗粉与纯净水的重量比例为1:6-20，加热温度为80-100℃，当加热回流分离器中的一次性加入木姜叶柯粗粉的量为1-2kg时，加热时间为10min，当加热回流分离器中一次性加入木姜叶柯粗粉的量超过2kg时，加热时间在10min的基础上按5min/1kg增加，加热后得到木姜叶柯混合液a，再对木姜叶柯混合液a进行过滤，过滤采用金属过滤网进行过滤，所选金属过滤网目数为2-8目，木姜叶柯混合液a经过过滤得到木姜叶柯滤液和木姜叶柯滤渣,再对木姜叶柯滤液进行收集；

s3：减压浓缩：将步骤s2中所得的木姜叶柯滤渣进行重复加热分流，重复次数为2-5次，加热分离条件与步骤s2中相同，并将重复分离的滤液与首次分离的滤液进行合并，再对合并后的滤液进行减压浓缩，减压浓缩时浓缩仓内压强为50-80kpa，加热温度55-70℃，冷凝面积0.8-1m²，加热面积为0.4-0.5m²，减压浓缩时间为20-25min,滤液经过减压浓缩后得到浓缩液1；

s4：萃取沉淀：对步骤s3中得到的浓缩液1加入正丁醇进行萃取，浓缩液1与正丁醇的重量比例为1:0.5-4，得到分层液再对分层液进行上下翻转20-25次，分层液经过翻转后分离正丁醇层，收集正丁醇液，再对收集的正丁醇液进行减压浓缩，减压浓缩条件与步骤s3中相同，经过减压浓缩后得到浓缩液2，将得到的浓缩液2静置24-36h，得到沉淀物a，对沉淀物a边搅拌边加入乙醇直至沉淀物a完全溶解，得到溶解液，再对溶解液加入纯净水，溶解液与纯净水的比例按1：3-30，得到混合液b,再将得到的混合液b静置24-36小时，将上清液抽取，得到沉淀液，再对沉淀液进行过滤得三叶苷粗品b；

s5：结晶：在乙醇溶液中加入三叶苷粗品b并进行边加热边溶解，待三叶苷饱和溶解后，对溶解液冷却得到结晶体a,在对纯净水中加入结晶体a并进行边加热边溶解，待结晶体饱和溶解后，再次对混合液进行冷却得到结晶体b,将得到的结晶体b重复以上结晶操作，得到结晶体c。

进一步地，所述木姜叶柯叶优选为木姜叶柯嫩叶或木姜叶柯嫩叶制品，，木姜叶柯嫩叶或木姜叶柯嫩叶制品中三叶苷含量大于14％以上。

进一步地，步骤s2中所述的加热回流分离器包括：壳体、密封盖、转动件、水管、排气孔、限位块一、矩形网、电子设备、电源线、控制开关、光波加热管、回流泵、限位块二、平板网、电子龙头，所述壳体为方型壳，所述密封盖通过所述转动件连接在壳体顶部，所述水管连接在密封盖顶部的左侧，且与壳体内部相通，所述排气孔贯穿式设在密封盖的上端，且位于水管的左侧，所述限位块一固定在壳体上端两侧，所述矩形网搭载在所述两个限位块一上，且位于壳体内部，所述电子设备固定在壳体左侧外壁，所述电源线与电子设备电性连接，所述控制开关固定在壳体右侧外壁上，且与电子设备电性连接，所述光波加热管固定在壳体两侧内壁上，且分别与电子设备和控制开关电性连接，所述回流泵固定在壳体两侧内壁处，且位于光波加热管下方，回流泵分别与电子设备电性和控制开关电性连接，所述限位块二分别固定在壳体两侧内壁上，且位于回流泵下方，所述平板网搭载在所述两个限位块二上，所述电子龙头固定在壳体右侧外壁，且位于平板网下方，电子龙头与电子设备电性连接，采用光波加热加热效率高。

进一步地，所述电子设备包括计时器、控制器、变压器，所述计时器固定在电子设备的内部上方，所述控制器固定在电子设备内部的中部，所述变压器固定在电子设备的内部下方，计时器与控制器电性连接，控制器分别与回流泵、光波加热管、控制开关、变压器电性连接，所述变压器分别为控制器、计时器、光波加热管、回流泵、控制开关供电，所用控制器为市售产品，计时器用于对加热时间和加热次数的计算。

进一步地，所述壳体的底部设有温感器，所述温感器与控制器和变压器电性连接，温感器用于对加热温度监测。

进一步地，所述密封盖的上端右侧设有把手，把手便于对密封盖的闭合。

进一步地，所述平板网的中部连接有转动轴，并通过所述转动轴进行折叠，通过折叠式设计方便对平板网的清理。

进一步地，所述水管下端设有进水阀，所述进水阀分别与变压器和控制器电性连接，进水阀的设置实现自动加水。

本发明加热回流分离器的工作方法：

s1：向矩形网内加入木姜叶柯粗粉，通过控制开关设定加热温度、加热时间以及循环次数，控制器控制进水阀打开，向壳体内部加水；

s2：控制器控制光波加热管的发热强度，具体根据温控器检测的温度自动调节，回流泵带动矩形网下端的水流向上对冲，促进加热的同时防止矩形网堵塞，计时器记录加热时间；

s3：加热完成后控制器控制电子龙头打开，将滤液通过龙头排放至收集容器内，由计时器记录加热次数，重复以上步骤直至到达循环次数。

本发明的有益效果是：

(1)本发明分离方法简便、快捷，分离周期短。传统的柱色谱方法操作繁琐且分离周期长(一般需要20个月的时间)，柱层析有机溶剂使用量大且大多溶剂环境有害；采用本方法只需5～7天即可，大大缩短了分离时间，且溶液主要使用乙醇和水。高速逆流色谱仪分离制备时进样操作繁琐，且大多溶剂对环境有害，且产量受到影响，一般分离量为几百毫克-克级，但是利用本方法一般分离量为克级-公斤级，甚至工业生产量几十至几百公斤级。

(2)本发明分离出的三叶苷单体化合物具有多种药理活性，在保健食品和药品领域具有广阔的应用前景，本方法提供了实现天然甜味剂三叶苷产业化制备的物质基础。

(3)本发明的加热回流分离器，采用滤网过滤浸泡，方便更换浸泡原料，壳体内部设有的回流泵能使下层水流向上回流，避免加热不均匀，两层过滤网使过滤更彻底，能有效减少滤液中的浮渣，自动计时加水，无需人员看管，节省了人力成本。

附图说明

图1是本发明加热回流分离器的结构示意图；

图2是本发明平板网的立体结构示意图；

图3是本发明实施例二中原料的三叶苷含量hplc色谱图；

图4是本发明实施例二中浓缩液2的三叶苷含量hplc色谱图；

图5是本发明实施例二中三叶苷粗品b的三叶苷含量hplc色谱图；

图6是本发明实施例二中结晶体c的三叶苷含量hplc色谱图；

图7是本发明实施例三中原料的三叶苷含量hplc色谱图；

图8是本发明实施例三中浓缩液2的三叶苷含量hplc色谱图；

图9是本发明实施例三中三叶苷粗品b的三叶苷含量hplc色谱图；

图10是本发明实施例三中结晶体c的三叶苷含量hplc色谱图。

其中，1-壳体、2-密封盖、3-转动件、4-水管、5-排气孔、6-限位块一、7-矩形网、8-电子设备、9-电源线、10-控制开关、11-光波加热管、12-回流泵、13-限位块二、14-平板网、15-电子龙头、16-温感器、17-把手、41-进水阀、141-转动轴、81-计时器、82-控制器、83-变压器。

具体实施方式

为便于对本发明技术方案的理解，下面结合图1-6做进一步的解释说明，实施例并不构成对本发明保护范围的限定。

实施例一：

一种从木姜叶柯中提取三叶苷的工艺，包括以下步骤：

s1：原料粉碎：选用4月产的木姜叶柯嫩叶，通过粉碎机进行粗粉碎，得到木姜叶柯颗粒，将所得木姜叶柯颗粒经过10目筛过筛，得到木姜叶柯粗粉；

s2：加热分离：将步骤s1的到的木姜叶柯粗粉放入加热回流分离器中，再对加热回流分离器中的木姜叶柯粗粉添加纯净水，加热回流分离器中的木姜叶柯粗粉与纯净水的重量比例为1:6，加热温度为80℃，当加热回流分离器中的一次性加入木姜叶柯粗粉的量为1kg时，加热时间为10min，当加热回流分离器中一次性加入木姜叶柯粗粉的量超过2kg时，加热时间在10min的基础上按5min/1kg增加，加热后得到木姜叶柯混合液a，再对木姜叶柯混合液a进行过滤，过滤采用金属过滤网进行过滤，所选金属过滤网目数为2目，木姜叶柯混合液a经过过滤得到木姜叶柯滤液和木姜叶柯滤渣,再对木姜叶柯滤液进行收集；

s3：减压浓缩：将步骤s2中所得的木姜叶柯滤渣进行重复加热分流，重复次数为2次，加热分离条件与步骤s2中相同，并将重复分离的滤液与首次分离的滤液进行合并，再对合并后的滤液进行减压浓缩，减压浓缩时浓缩仓内压强为50kpa，加热温度55℃，冷凝面积0.8m²，加热面积为0.4m²，减压浓缩时间为20min,滤液经过减压浓缩后得到浓缩液1；

s4：萃取沉淀：对步骤s3中得到的浓缩液1加入正丁醇进行萃取，浓缩液1与正丁醇的重量比例为1:0.5，得到分层液再对分层液进行上下翻转20次，分层液经过翻转后分离正丁醇层，收集正丁醇液，再对收集的正丁醇液进行减压浓缩，减压浓缩条件与步骤s3中相同，经过减压浓缩后得到浓缩液2，将得到的浓缩液2静置24h，得到沉淀物a，对沉淀物a边搅拌边加入乙醇直至沉淀物a完全溶解，得到溶解液，再对溶解液加入纯净水，溶解液与纯净水的比例按1：3，得到混合液b,再将得到的混合液b静置24小时，将上清液抽取，得到沉淀液，再对沉淀液进行过滤得三叶苷粗品b；

s5：结晶：在乙醇溶液中加入三叶苷粗品b并进行边加热边溶解，待三叶苷饱和溶解后，对溶解液冷却得到结晶体a,在对纯净水中加入结晶体a并进行边加热边溶解，待结晶体饱和溶解后，再次对混合液进行冷却得到结晶体b,将得到的结晶体b重复以上结晶操作，得到结晶体c。

如图1所示,步骤s2中加热回流分离器包括：壳体1、密封盖2、转动件3、水管4、排气孔5、限位块一6、矩形网7、电子设备8、电源线9、控制开关10、光波加热管11、回流泵12、限位块二13、平板网14、电子龙头15，壳体1为方型壳，密封盖2通过转动件3连接在壳体1顶部，水管4连接在密封盖2顶部的左侧，且与壳体1内部相通，水管4下端设有进水阀41，进水阀41分别与变压器83和控制器82电性连接，进水阀的设置实现自动加水，排气孔5贯穿式设在密封盖2的上端，且位于水管4的左侧，密封盖2的上端右侧设有把手17，把手便于对密封盖的闭合，限位块一6固定在壳体1上端两侧，矩形网7搭载在两个限位块一6上，且位于壳体1内部，电子设备8固定在壳体1左侧外壁，电源线9与电子设备8电性连接，控制开关10固定在壳体1右侧外壁上，且与电子设备8电性连接，光波加热管11固定在壳体1两侧内壁上，且分别与电子设备8和控制开关10电性连接，回流泵12固定在壳体1两侧内壁处，且位于光波加热管11下方，回流泵12分别与电子设备8电性和控制开关10电性连接，限位块二13分别固定在壳体1两侧内壁上，且位于回流泵12下方，平板网14搭载在所述两个限位块二13上，如图2所示，平板网14的中部连接有转动轴141，并通过转动轴141进行折叠，通过折叠式设计方便对平板网的清理，电子龙头15固定在壳体1右侧外壁，且位于平板网14下方，电子龙头15与电子设备8电性连接，壳体1的底部设有温感器16，温感器16与控制器82和变压器83电性连接，温感器用于对加热温度监测，采用光波加热加热效率高，电子设备8包括计时器81、控制器82、变压器83，计时器81固定在电子设备8的内部上方，控制器82固定在电子设备8内部的中部，变压器83固定在电子设备8的内部下方，计时器81与控制器82电性连接，控制器82分别与回流泵12、光波加热管11、控制开关10、变压器83电性连接，变压器83分别为控制器82、计时器81、光波加热管11、回流泵12、控制开关10供电，所用控制器为市售产品，计时器用于对加热时间和加热次数的计算。

本实施例中加热回流分离器的工作方法：

s1：对矩形网7内加入木姜叶柯粗粉，通过控制开关10设定加热温度、加热时间以及循环次数，控制器82控制进水阀41打开，对壳体1内部加水；

s2：控制器82控制光波加热管11的发热强度，具体根据温控器16检测的温度自动调节，回流泵12带动矩形网7下端的水流向上对冲，促进加热的同时防止矩形网7堵塞，计时器81记录加热时间；

s3：加热完成后控制器82控制电子龙头15打开，将滤液通过龙头排放至收集容器内，由计时器81记录加热次数，重复以上步骤直至到达循环次数。

实施例二:

一种从木姜叶柯中提取三叶苷的工艺，包括以下步骤：

s1：原料粉碎：选用6月产的木姜叶柯嫩叶，通过粉碎机进行粗粉碎，得到木姜叶柯颗粒，将所得木姜叶柯颗粒经过10目筛过筛，得到木姜叶柯粗粉；

s2：加热分离：将步骤s1的到的木姜叶柯粗粉放入加热回流分离器中，所用加热回流分离器与实施例一中所用的加热回流分离器相同，再对加热回流分离器中的木姜叶柯粗粉添加纯净水，加热回流分离器中的木姜叶柯粗粉与纯净水的重量比例为1:11，加热温度为90℃，当加热回流分离器中的一次性加入木姜叶柯粗粉的量为1.5kg时，加热时间为10min，当加热回流分离器中一次性加入木姜叶柯粗粉的量超过2kg时，加热时间在10min的基础上按5min/1kg增加，加热后得到木姜叶柯混合液a，再对木姜叶柯混合液a进行过滤，过滤采用金属过滤网进行过滤，所选金属过滤网目数为5目，木姜叶柯混合液a经过过滤得到木姜叶柯滤液和木姜叶柯滤渣,再对木姜叶柯滤液进行收集；

s3：减压浓缩：将步骤s2中所得的木姜叶柯滤渣进行重复加热分流，重复次数为3次，加热分离条件与步骤s2中相同，并将重复分离的滤液与首次分离的滤液进行合并，再对合并后的滤液进行减压浓缩，减压浓缩时浓缩仓内压强为65kpa，加热温度60℃，冷凝面积0.9m²，加热面积为0.45m²，减压浓缩时间为23min,滤液经过减压浓缩后得到浓缩液1；

s4：萃取沉淀：对步骤s3中得到的浓缩液1加入正丁醇进行萃取，浓缩液1与正丁醇的重量比例为1:2，得到分层液再对分层液进行上下翻转23次，分层液经过翻转后分离正丁醇层，收集正丁醇液，再对收集的正丁醇液进行减压浓缩，减压浓缩条件与步骤s3中相同，经过减压浓缩后得到浓缩液2，将得到的浓缩液2静置30h，得到沉淀物a，对沉淀物a边搅拌边加入乙醇直至沉淀物a完全溶解，得到溶解液，再对溶解液加入纯净水，溶解液与纯净水的比例按1：15，得到混合液b,再将得到的混合液b静置30小时，将上清液抽取，得到沉淀液，再对沉淀液进行过滤得三叶苷粗品b；

s5：结晶：在乙醇溶液中加入三叶苷粗品b并进行边加热边溶解，待三叶苷饱和溶解后，对溶解液冷却得到结晶体a,在对纯净水中加入结晶体a并进行边加热边溶解，待结晶体饱和溶解后，再次对混合液进行冷却得到结晶体b,将得到的结晶体b重复以上结晶操作，得到结晶体c。

如图3所示，本实施例中原料的三叶苷含量抽检结果为15.15％。

如图4所示，本实施例中浓缩液2的三叶苷含量抽检结果为85.32％。

如图5所示，本实施例中三叶苷粗品b的三叶苷含量抽检结果为93.19％。

如图6所示，本实施例中结晶体c的三叶苷含量抽检结果为99.517％。

实施例三：

一种从木姜叶柯中提取三叶苷的工艺，包括以下步骤：

s1：原料粉碎：选用11月产的木姜叶柯嫩叶制品，通过粉碎机进行粗粉碎，得到木姜叶柯颗粒，将所得木姜叶柯颗粒经过10目筛过筛，得到木姜叶柯粗粉；

s2：加热分离：将步骤s1的到的木姜叶柯粗粉放入加热回流分离器中，所用加热回流分离器与实施例一中所用的加热回流分离器相同，再对加热回流分离器中的木姜叶柯粗粉添加纯净水，加热回流分离器中的木姜叶柯粗粉与纯净水的重量比例为1:20，加热温度为100℃，当加热回流分离器中的一次性加入木姜叶柯粗粉的量为2kg时，加热时间为10min，当加热回流分离器中一次性加入木姜叶柯粗粉的量超过2kg时，加热时间在10min的基础上按5min/1kg增加，加热后得到木姜叶柯混合液a，再对木姜叶柯混合液a进行过滤，过滤采用金属过滤网进行过滤，所选金属过滤网目数为8目，木姜叶柯混合液a经过过滤得到木姜叶柯滤液和木姜叶柯滤渣,再对木姜叶柯滤液进行收集；

s3：减压浓缩：将步骤s2中所得的木姜叶柯滤渣进行重复加热分流，重复次数为5次，加热分离条件与步骤s2中相同，并将重复分离的滤液与首次分离的滤液进行合并，再对合并后的滤液进行减压浓缩，减压浓缩时浓缩仓内压强为80kpa，加热温度70℃，冷凝面积1m²，加热面积为0.5m²，减压浓缩时间为25min,滤液经过减压浓缩后得到浓缩液1；

s4：萃取沉淀：对步骤s3中得到的浓缩液1加入正丁醇进行萃取，浓缩液1与正丁醇的重量比例为1:4，得到分层液再对分层液进行上下翻转25次，分层液经过翻转后分离正丁醇层，收集正丁醇液，再对收集的正丁醇液进行减压浓缩，减压浓缩条件与步骤s3中相同，经过减压浓缩后得到浓缩液2，将得到的浓缩液2静置36h，得到沉淀物a，对沉淀物a边搅拌边加入乙醇直至沉淀物a完全溶解，得到溶解液，再对溶解液加入纯净水，溶解液与纯净水的比例按1：30，得到混合液b,再将得到的混合液b静置36小时，将上清液抽取，得到沉淀液，再对沉淀液进行过滤得三叶苷粗品b；

s5：结晶：在乙醇溶液中加入三叶苷粗品b并进行边加热边溶解，待三叶苷饱和溶解后，对溶解液冷却得到结晶体a,在对纯净水中加入结晶体a并进行边加热边溶解，待结晶体饱和溶解后，再次对混合液进行冷却得到结晶体b,将得到的结晶体b重复以上结晶操作，得到结晶体c。

如图7所示，本实施例中原料的三叶苷含量抽检结果为14.74％。

如图8所示，本实施例中浓缩液2的三叶苷含量抽检结果为84.67％。

如图9所示，本实施例中三叶苷粗品b的三叶苷含量抽检结果为92.23％。

如图10所示，本实施例中结晶体c的三叶苷含量抽检结果为99.865％。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。