3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶及其编码基因和应用的制作方法

本发明涉及分子生物学、基因工程技术领域。具体地，涉及一种在灰树花中表达的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶及其编码基因和应用。

背景技术：

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coareductase)，简称hmgr，在甲羟戊酸(mva)途径中催化3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a转化为甲羧戊酸，由于该过程不可逆，故该酶被视作mva途径中的第一个限速酶，是细胞质萜类化合物代谢中的重要调控位点。

药理研究表明，三萜类化合物是极具开发潜力的天然资源，萜类化合物广泛存在于高等动、植物及真核生物体内。它在医疗卫生、工农业生产、能源等领域均有重要作用。研究发现，三萜类化合物具有多种生物活性，包括调节免疫、抑制血管新生、抗肿瘤、抗炎症、抗氧化等。

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶作为早期酶类，它决定“碳流”的流向。schaller等将橡胶树hmgr基因转入烟草，并对该转基因烟草进行研究，结果发现其形态未发生变化，但hmgr的活性增加了4-8倍，且甾醇含量增加了6倍。

灰树花，又称舞茸，是食、药兼用蕈菌，其属于非褶菌目、多孔菌科、树花属，含有多种功能性成分，如多糖、萜类、氨基酸等，具有良好的抗癌、抗病毒功能，因此被誉为“真菌之王，抗癌奇葩”。现有技术中已从灰树花中克隆得到3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶基因，如中国专利申请（cn105132389，20151209）。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种灰树花3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶基因，该3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶不仅可显著提高灰树花中的三萜含量，且还能提高樟芝菌丝体中樟芝三萜的含量。

本发明提供了一种3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶，氨基酸序列如seqidno.1所示。

本发明还提供了一种编码所述的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶的基因，所述基因的碱基序列如seqidno.2所示。

本发明还提供了一种包含所述的基因的重组表达载体，含有seqidno.2所示碱基序列；

所述重组载体的原始载体为pet32a(+)或pbi121。

本发明还提供了一种包含所述重组载体的宿主细胞，宿主细胞为大肠杆菌细胞，农杆菌细胞、灰树花或樟芝菌丝体细胞。

本发明还提供了一种所述的重组宿主细胞在生产樟芝三萜或灰树花中三萜类化合物中的应用。

本发明通过提取一株高表达三萜的灰树花子实体总rna，逆转录后构建cdna文库，二代测序数据分析发现了一个3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶，通过rt-pcr技术克隆了灰树花的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶基因，得到了3579bp的完整基因序列；构建了真核表达载体pbi121-hmgr分别转化灰树花和樟芝菌丝体表达系统，对克隆的hmgr基因功能进行了验证。实验结果表明hmgr基因能够在灰树花及樟芝菌丝体中正常表达；且灰树花3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶基因(hmgr)可显著提高灰树花中的三萜类物质含量，此外，该基因还能够提高樟芝菌丝体中樟芝三萜的含量，且其提高樟芝菌丝体中樟芝三萜含量的能力优于现有技术中已分离获得的灰树花3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶基因。

附图说明

图1为灰树花阴性对照及采用本发明基因转基因的灰树花中三萜含量检测结果；

图2为未转基因樟芝菌丝体、转不同hmgr基因阳性克隆中樟芝三萜的含量检测结果；

图中1和2为未转基因对照中樟芝三萜的含量，3和4为转现有技术hmgr基因阳性克隆中樟芝三萜的含量（转入的是中国专利申请cn105132389专利中所涉及的灰树花hmgr基因），5和6为本发明转基因阳性克隆中樟芝三萜的含量（转入的是本申请所述hmgr基因）。

具体实施方式

实施例1灰树花hmgr基因的克隆

灰树花总rna的分离：

取高表达三萜的灰树花子实体60mg，在研钵中用液氮快速研磨成粉末，快速转移至已经加入1mltrizol的离心管中，用移液器吹打混匀；静置5min，4℃，13000g离心8min；再将上清液移入另一离心管中，加入200μl氯仿，混匀，放置10min，4℃，13000g离心15min；转移上层水相至另一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，放置10min；4℃，13000g离心8min，弃上清；再加入500μl的75％乙醇，混匀，8000g离心5min，弃上清；干燥rna沉淀，加入适量无rnase的水溶解，用甲醛变性胶电泳鉴定总rna质量，然后在分光光度计上测定rna含量。

根据已克隆得到的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶氨基酸保守序列，设计简并引物，利用同源性基因克隆原理进行cdna全长克隆：

取1μg总rna，以randomhexamers为引物，按照superscriptiiifirst-strandsynthesissystem说明操作，反转录生成第一链。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶基因cds序列设计引物如下：

上游引物hmgr-f：gaagatctatgcgtgcgatacttcgcccgc；

下游引物hmgr-r：cccacgtgtcacttcgtctccacagcatagc；

取灰树花总rna反转录生成的第一链cdna为模板做pcr扩增。

pcr反应体系如下（50μl体系）：

pcr扩增程序如下：

pcr扩增结束后，采用2%琼脂糖凝胶电泳跑胶、切胶并采用试剂盒回收。

实施例2灰树花3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶重组表达载体及重组宿主细胞的构建

原核表达载体的构建以及转化大肠杆菌：

根据灰树花hmgr的核苷酸序列，设计扩增出蛋白编码区的上、下游引物，并在上、下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这根据选用的pet32a(+)载体而定)，以便构建重组表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经pcr扩增后，将灰树花hmgr基因在保证阅读框正确的前提下克隆至pet32a(+)载体(novagen)。将连接产物转入dh5α大肠杆菌感受态细胞。在转化产物中加入800μllb液体培养基，37℃，180rpm摇床培养45min后，涂布于含iptg，amp的lb固体培养皿上，正置培养1h后37℃倒置培养过夜。

以上述扩增引物hmgr-f和hmgr-r对挑选的10-20个单克隆进行pcr鉴定，所述pcr条件：95℃，5min；95℃，30s；57℃，30s；72℃，1min，20个循环；72℃，10min。pcr扩增产物采用1%琼脂糖凝胶电泳跑胶鉴定，并选择电泳条带正确的克隆送上海生工测序，比对测序结果确定酶序列的正确性。

实施例3真菌表达载体pbi121-hmgr及农杆菌工程菌的构建

将测序正确的重组表达载体pet32a-hmgr和pbi121表达空载体分别进行酶切、回收，并采用t4连接酶将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶基因连接至双元表达载体pbi121中。对连接产物进行鉴定后再将其转入农杆菌感受态细胞中。

实施例4转基因灰树花、樟芝菌丝体中三萜类化合物含量的检测

农杆菌介导的菌丝体原生质体转化：

含有pbi121-hmgr的农杆菌工程菌在lb平板上划线培养，28℃培养24-36h；

挑单菌落于5mllb液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养至od600＝0.6左右；

室温下，4000rpm离心10min，弃上清，菌体重悬于5ml1/2ms培养基中。28℃，200rpm培养至od600＝0.6左右；

分别将灰树花和樟芝菌丝体原生质体与农杆菌混合；

28℃静置共培养36h后，3500rpm，离心10min收集菌体，洗涤后涂布于抗性培养基上，于28℃培养一周后，挑取转化子。

提取转基因菌丝体的总dna，以菌丝体基因组dna为模板进行pcr检测，确保hmgr基因已成功进入灰树花、樟芝菌丝体中。

采用加热回流法提取转基因灰树花、樟芝菌丝体中的三萜类化合物：分别取100mg转化子，加入95％乙醇溶液5ml，50℃恒温水浴锅中浸泡2h，过滤取上清，并分别测定提取液中的三萜含量。

转基因灰树花中三萜含量的测定结果表明：其明显高于野生型对照，表明该基因能够在灰树花中表达，且能够提高转基因灰树花中三萜类化合物含量(参见图1)。

测定转基因樟芝菌丝体中樟芝三萜含量，发现其不仅明显高于野生型对照，且其提高樟芝菌丝体中樟芝三萜含量的能力优于现有技术中已分离获得的灰树花3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶基因（参见图2）。

序列表

<110>广州四和生物科技有限公司

<120>3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶及其编码基因和应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1192

<212>prt

<213>灰树花(grifolafrondosa)

<400>1

metargalaileleuargproleuserthrcysthralapheserpro

151015

ilegluthrilevalthrvalphevalcysalathrleualatyrphe

202530

thrglyilelyshisserserphephealaprothrtyrprothrala

354045

leuargproalahisalaargleuthrasnalaglutrpvalglyval

505560

serglnglnasptrpvalaspalatrplyshisproarggluaspval

65707580

lysleuleugluleuglnglnilevalpheserleuaspalathrglu

859095

alavalthrproglyserasnleuaspvalalaglyleuserglyile

100105110

thrarghisleuthrthrglnvalproserleuserglylysalatyr

115120125

serserilecyshistyrproserserasnilethrseralasercys

130135140

phethralaphethrglualaalaserserserthrleuthrleuser

145150155160

phethrthrglythrargaspasptrpleualametleulysserglu

165170175

lysserilethrleuaspglyvallystyrglnleuaspleuglylys

180185190

proglugluserileglyglumetlysserserlystrpvalalatyr

195200205

alaleuargalaleuvalleuargphetrpgluleuthrlyslysala

210215220

aspserleuaspileilevalvalleuthrglytyrileleumethis

225230235240

valthrpheleuargleupheleuserserargalaleuglyserasn

245250255

phetrpleuserthrglyilepheserseralaileileserpheleu

260265270

phethrleuproleucysargtyrleuasnileproleuaspproile

275280285

alaleuthrglualaleuleuvalcysthrvalglypheasplyspro

290295300

leuargleualaargalavalmetalahisproglnthrleuargpro

305310315320

glngluasnglyargmetlysproalaglyaspvalileleugluala

325330335

leuaspargvalglyasnvalileleuargasptyralaleugluile

340345350

alavalleuleuvalglyasnserlysvalglyglyleulysgluphe

355360365

cysalavalalaalavalalaleualametaspcysvalmetthrphe

370375380

thrleutyrthrservalleuthrvalmetvalgluvalargargile

385390395400

lyslysvalargglumetserargserargserasnserileserala

405410415

valthralaasnglythralavalargseralaleuserargproser

420425430

alalysvalglnthrproserproalaalaprolyslysleuargasp

435440445

argileserseralaileleuglyvallysglyserpheleuargasp

450455460

gluglnglyglyserlysvalglnalaileglugluasnprometala

465470475480

argleulysleuleuleuilealaserpheleuthrleuhisileleu

485490495

asnphecysthrthrleuthrproalathrthrleualaarghisasn

500505510

arghisthrleuargthralaaspglyvalproproproproargval

515520525

aspilethrserproalailealaservalleualaserleualaala

530535540

serglulysmetvalserthrserileglualalysgluprogluleu

545550555560

leuvallysvalproproleuvaltyrileargvalthrprothrval

565570575

leuprovalserargvalalaasnglyserthrglythrglygluala

580585590

ileaspasnphemetsersertrpserleuleuvalglyaspproval

595600605

leuserlystrpilevalvalleuleualavalservalalaleuasn

610615620

glytyrleuleulysglyilealaalaglyserglyleualaalaval

625630635640

argalavalargserglnglyvalargpheargserargalaargval

645650655

glylysaspgluthrgluglucysthralaalaproproalaproleu

660665670

thrilevalproserthralaproileleuvalalaprovalalaile

675680685

prothrarggluargalaprovalglnleuserserprovalaspleu

690695700

asplysvalaspphelysleuglnglulysleuproileargalapro

705710715720

ileproilehisproleuthrprogluprogluvalalavalalaarg

725730735

tyrthrglyprovalargthrleugluglucysilegluilepheglu

740745750

asnglyproargprovalservalalaleualathrleuasnaspglu

755760765

gluvalvalmetleualaglnasnglylysilealaalatyralaleu

770775780

glulysleuleuglyaspleugluargalavalargileargargala

785790795800

leuileserargalaserargthrlysthrleugluasnserleuval

805810815

prometgluasntyrasptyrserargvalvalglyalacyscysglu

820825830

asnvalileglytyrmetproleuproleuglyvalalaglyproleu

835840845

lysvalaspglyglnmettyrproileprometcyslysalaleuasn

850855860

alaglyglyglyvalthrthrvalleuthrtyraspalametthrarg

865870875880

glyproalaileasppheproserilevalargalaalaglualalys

885890895

alatrpilegluserthrgluglytyralailevallysglualaphe

900905910

gluserthrserargphealalysleuglnasnilelyscysalamet

915920925

alaglyargthrleuphevalargphealathrargthrglyaspala

930935940

metglymetasnmetileserlysalathrglulysalaleuaspval

945950955960

leuserlysglupheproglumetvalvalleualaleuserglyasn

965970975

tyrcysthrasplyslysproalaalaileasntrpilegluglyarg

980985990

glylysserilevalalaglualavalileproglylysilevallys

99510001005

servalleulysthrthrvalglualaleucysasnleuasnthrlys

101010151020

lysasnleuvalglyseralametalaglyservalglyglypheasn

1025103010351040

alahisasnilealametpheleualathrglyglnaspproalagln

104510501055

asnvalgluserserasncysmetthrleumetgluprothrasnasn

106010651070

glygluaspleuleumetthrvalsermetprocysilegluvalgly

107510801085

thrvalglyglyglythrileleualaproglnglnalavalleuglu

109010951100

leuleuglyvalglnglyalahisserthrasnproglyglnasnala

1105111011151120

glnglnleualaargileilealaseralavalmetalaglygluleu

112511301135

serleuileseralaleualaalaglyhisleuvalargalahisleu

114011451150

alahisasnargserglnleuasnthrproleuproglyprothrglu

115511601165

proalaglyglyalaphetrpalaglyalalysserseralapropro

117011751180

alaglytyralavalgluthrlys

11851190

<210>2

<211>3578

<212>dna

<213>灰树花(grifolafrondosa)

<400>2

tgcgtgcgatacttcgcccgctctctacgtgcaccgcgttctcgcccatcgagacaatcg60

tcaccgtcttcgtctgcgcgactctcgcctacttcactggcatcaaacactcatccttct120

ttgctccaacctatccgacggcccttcgccccgctcacgctcgcctcaccaatgctgaat180

gggtaggagtgagccagcaggattgggttgatgcgtggaaacacccccgggaagatgtca240

agttgctggagctgcaacagattgtgttctctctggatgctaccgaagcggttacaccgg300

gttcaaatcttgacgttgcgggcctttctggaatcactcgccatctcactacacaagtgc360

cgtcactctcgggcaaagcgtactcttccatctgccactacccatcttcaaacattacat420

ctgcatcatgcttcactgccttcaccgaagctgcttcatcatctacgcttaccctctcgt480

ttactactgggacgagagacgactggctggccatgcttaaaagcgagaagtcgatcactc540

tggatggagtaaagtaccagcttgatttggggaaacctgaggagagcatcggtgagatga600

agagtagcaaatgggttgcgtatgcgctccgcgcgctggttctgcgtttctgggaactca660

cgaagaaagcagactcgctcgatattatagtcgtgctcacgggctatatcctcatgcatg720

tcaccttcctgcgcttgttcctctcgtcgcgtgccctgggctcaaacttctggctctcga780

cgggtattttctcttctgctatcatctcgttcttgtttacccttccactctgccgctacc840

tcaacattccacttgatcctatcgcgcttaccgaggcccttttggtatgcactgtcggct900

tcgacaagccccttcgtctcgcgcgtgctgtcatggcgcacccacaaactctgaggcctc960

aagaaaatggccgcatgaagcccgccggcgatgttattctcgaggcgctcgaccgtgtcg1020

ggaacgttattctaagggactacgcgttggaaattgccgtgctgctcgtcggcaacagca1080

aagtcggaggtctcaaggagttctgcgccgttgccgccgttgcacttgccatggattgcg1140

tcatgacgtttaccctttacacgtcggtgttgactgtcatggtcgaggttcgccgcatca1200

aaaaggttcgtgagatgtctcgctctcgctcaaattcgatctcggctgtcactgccaatg1260

gcaccgccgtgcgctcagcgctgtcacgtccttcggctaaggtgcagacaccctcccctg1320

ctgcaccgaagaagttgagggaccggatctcaagcgctattctcggcgttaagggatcgt1380

tcttgagagatgagcagggcgggagcaaggtccaggcgatcgaagagaatccgatggcta1440

ggcttaagctactattgatcgcttcgttcctgacgttgcatattttgaacttctgcacaa1500

ccctcacacccgcgacgacactcgccagacacaatagacacaccctccgtactgctgatg1560

gcgtacctccccctcctcgtgttgacattactagtcccgccatcgcgagtgtgctcgcga1620

gtctcgctgcttccgagaagatggtttccacaagcatcgaggcaaaagagcccgagttac1680

ttgtcaaagtcccgcctctggtctatatccgcgtaacacctacagtcctacctgtctccc1740

gtgtagcaaacggtagcacgggtactggcgaagcgatcgataacttcatgtcaagctgga1800

gtctgcttgttggtgaccccgtgctctccaagtggatcgtagtccttcttgccgtgagcg1860

ttgcactgaacggctacctcctcaagggcatcgccgcgggctctggactcgctgccgttc1920

gtgctgtccgcagccagggcgtgcgcttccgctcgcgcgcaagggttggtaaggatgaaa1980

cggaagagtgcaccgctgcccctcccgcgcctctaaccatcgtcccatctactgcaccta2040

ttctggttgctcctgtggccatccctacgcgtgaacgtgccccggttcagctgagctctc2100

ctgtcgacttggataaggtagacttcaagttgcaggagaaactccccattcgtgccccca2160

tacccatccacccgttgactcctgagccggaagttgctgtagctaggtacactggccccg2220

tacgcaccctcgaggagtgcatagaaatcttcgagaatggtccgcgtccggtatccgttg2280

cgcttgcgacattgaacgacgaggaggttgtaatgctggcgcagaacgggaagattgcag2340

cttatgcgctcgagaagcttcttggcgacttggagcgggctgtccgcatccgtcgcgctt2400

taatctcccgtgcttcaaggactaagacccttgagaattcccttgtccccatggagaact2460

acgattactctcgcgttgtgggtgcgtgctgcgagaatgtgattggatacatgcctcttc2520

ccttgggtgttgccggtcctctgaaggtcgatggccagatgtatcccatcccgatgtgta2580

aggcgctgaatgctggtgggggcgtcaccaccgttttgacatatgacgccatgacccgcg2640

gccctgctatcgatttcccttcgatcgttcgcgctgccgaagccaaggcttggatagagt2700

ccacagaggggtatgcgatcgtgaaggaggcgttcgagtcgacatcacgcttcgcgaaac2760

tgcagaacatcaagtgcgcgatggctggccgaacgcttttcgtgcgattcgcgacgcgca2820

caggcgacgcgatgggcatgaatatgatctcgaaggctaccgagaaggcactagatgtgc2880

tgagcaaggaattccccgagatggtcgtgcttgcgttgtcgggtaactactgcacggaca2940

agaagcctgctgcgatcaactggatcgagggtcgtggcaagagtatcgtggctgaggccg3000

tgatccctggcaagattgtgaagagcgttttgaagacgactgtcgaggcgctctgcaacc3060

ttaacacgaagaagaaccttgtgggaagcgctatggctgggtctgttggcgggttcaacg3120

cacataatattgcgatgttcttggcgaccggccaggatcccgcgcagaatgtggaaagtt3180

caaattgcatgacgcttatggagccgaccaacaacggcgaggacctgcttatgacggttt3240

ctatgccttgtatcgaggttggaacagtcggaggcggcactatcctagcaccccaacaag3300

ctgttcttgagcttctcggcgtgcagggtgcgcattccacaaaccccggtcagaacgccc3360

aacagcttgctcgcatcatcgcatctgccgtgatggcgggcgagctctcactcatcagtg3420

cgctggcggcaggccaccttgtccgcgcgcacctcgcacacaaccgttcgcaactcaata3480

cccccctacctggacctactgagcccgccggcggtgccttctgggccggtgcgaagagtt3540

ctgcgccacctgctggctatgctgtggagacgaagtga3578