一种表达H5亚型HA的复制缺陷型重组H9N2禽流感病毒的制作方法

本发明属于流感病毒疫苗技术研发领域，具体涉及一种表达h5亚型ha的复制缺陷型重组h9n2禽流感病毒；即一种可同时表达a型流感病毒h9n2和h5n1两种亚型的表面蛋白血凝素ha的重组流感病毒，及其制备方法和应用。

背景技术：

禽流感是由a型流感病毒(avianinfluenzavirus,aiv)引起的禽类呼吸系统疾病和全身败血症的一类传染病。h5n1亚型禽流感病毒是一种高致病性病毒，极具传染性，严重危害禽类、人类以及其他动物。h9n2亚型是一种低致病性禽流感病毒，其广泛存在于世界范围内，危害持久并难以控制，特别是混合感染导致较高的死亡率。同时h9n2亚型流感病毒还是h5n1、h7n9等亚型流感病毒的内部基因供体，可形成新的重组病毒，严重危害我国养禽业的发展和公共卫生健康。因此，对于h9n2和h5n1亚型流感病毒的研究与防治不容忽视。目前，疫苗免疫仍是防控禽流感最重要和最有效的措施，针对h5n1亚型和h9n2亚型禽流感病毒已经批准使用的只有灭活苗，也没有可同时保护h9n2和h5n1亚型禽流感病毒的弱毒活疫苗，并且传统的流感病毒弱毒活疫苗主要是低温适应株，存在毒力回复突变的危险。

技术实现要素：

本发明提供一种表达h5亚型ha的复制缺陷型重组h9n2禽流感病毒，及其制备方法和在疫苗制备中的应用。

本发明首先提供一种表达h5亚型ha的复制缺陷型重组h9n2禽流感病毒，其制备方法如下：

1)在h9n2病毒的神经氨酸酶na的5′端的包装信号区和3′端的包装信号区内插入h5n1亚型的血凝素ha基因的开放阅读框，形成用于合成a型流感病毒naps-ha-naps的dna片段；

所述的5′端的包装信号区为h9n2病毒的神经氨酸酶na的5′端203个碱基对；

所述的和3′端的包装信号区，为h9n2病毒的神经氨酸酶na的3′端的195个碱基对；

更进一步的，所述的用于合成a型流感病毒naps-ha-naps的dna片段，其核苷酸序列为seqidno:1；

2)将1)中构建的用于合成a型流感病毒naps-ha-naps的dna片段克隆到质粒上形成重组质粒；

所述的质粒，优选为质粒phw2000；

3)构建表达h9n2流感病毒神经氨酸酶na基因的mdck细胞系；

4)将2)中构建的重组质粒，与表达h9n2的pb2、pb1、pa、ha、np、m、ns各个基因片段的重组质粒共同转染到293t细胞和可稳定表达h9n2流感病毒神经氨酸酶na基因的mdck细胞系中，并收集转染后293t细胞和表达na的mdck细胞的上清培养液

5)在稳定表达h9n2亚型禽流感病毒神经氨酸酶na的mdck细胞系上扩增4)中拯救出的重组流感病毒。

本发明所制备的表达h5亚型ha的复制缺陷型重组h9n2禽流感病毒用于制备弱毒疫苗。

本发明拯救出了一种复制缺陷型a型流感病毒二价弱毒活疫苗株，基于在没有改变基因稳定性的前体下，构建的重组病毒可稳定的同时表达a型流感病毒h9n2和h5n1亚型的表面蛋白血凝素ha。该弱毒不仅具有良好的基因稳定性而且在实验动物体内不能复制，所以并不具备致病性，同时还可诱导机体产生很强的粘膜免疫应答和细胞免疫应答水平，保持强烈且持久的免疫原性。最关键的是，该疫苗侯选株可对a型流感病毒h9n2和h5n1亚型流感病毒均可产生免疫保护作用。因此对于a型流感的预防与控制具有巨大的社会意义。

附图说明

图1：本发明实施的技术路线图；

图2：合成naps-ha-naps的dna序列凝胶电泳图。

图3：a830-ha病毒生长曲线图。

图4：不同浓度重组a830-ha病毒液攻毒后实验动物存活率图。

图5：免疫接种重组a830-ha病毒液后实验动物存活率图。

具体实施方式

本发明构建了可同时表达a型禽流感病毒h9n2和h5n1亚型表面糖蛋白血凝素ha的复制缺陷型重组禽流感病毒，并用其来制备弱毒活疫苗。

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍：

实施例1用于合成a型流感病毒naps-ha-naps的dna片段及质粒构建

使用含a型流感病毒h9n2七个片段的质粒phw-pb2、phw-pb1、phw-pa、phw-ha、phw-np、phw-m、phw-ns。上述七个质粒构成以a型流感病毒h9n2为骨架的反向遗传操作系统。

1、构建用于合成a型流感病毒naps-ha-naps的dna片段

合成a型流感病毒na-ha(orf)的dna序列：用a型流感病毒a/wildduck/hunan/021/2005(h5n1)亚型的血凝素ha的开放阅读框(openreadingframe,orf)去替换a型流感病毒a/chicken/shandong/830/2014(h9n2)中神经氨酸酶na的开放阅读框，同时保留na5’端的包装信号区(203个碱基对)和3’端的包装信号区(195个碱基对)，合成新的dna序列命名为naps-ha(orf)-naps(如图1)。

2、构建质粒phw-na-ha

首先合成dna序列naps-ha-naps(genscript公司)，该序列保留了a型流感病毒h9n2na片段3′端非编码区的203个核苷酸和5′端非编码区的195个核苷酸的包装信号。利用pcr技术进行目的片段na(203nt)-orf(ha)-na(195nt)的扩增(图2)。

上游引物序列：tattggtctcagggagcaaaagcaggagt

下游引物序列：atatggtctcgtattagtagaaacaaggagtttttt

分别用bsmb1和bsa1酶切质粒phw2000和pcr产物naps-ha-naps；利用t4dnaligase连接以上两个酶切片段，即构成质粒phw-na-ha。

新合成的目的片段na(203nt)-orf(ha)-na(195nt)的dna序列为seqidno:1：

实施例2拯救重组病毒

构建细胞系：构建可稳定表达a/chicken/shandong/830/2014(h9n2)流感病毒表面糖蛋白神经氨酸酶na的mdck细胞系。

具体步骤如下：

g418筛选稳定表达细胞系：

筛选前，确定g418筛选mdck细胞的最佳浓度为500μg/ml。

g418的配制：取1gg418溶于1ml1m的hepes溶液中，加超纯水至10ml，过滤，4℃保存备用。

(1)将a型流感病毒亚型h9n2表面糖蛋白神经氨酸酶na的rna片段体外反转录制成cdna，以cdna为模板扩增流感病毒的na基因片段，并克隆到载体质粒pd2egfp-n1上。即得质粒pd2egfp-na。

(2)将mdck细胞铺于6孔板，培养在含有10％胎牛血清的(fetalbovineserum，fbs)和1％双抗(penicillin-streptomycinsolution，ps)的mem培养液于37℃培养箱培养。(培养基和血清均购自biologicalindustries公司)。待细胞生长密度达到60-70％左右进行转染。

(3)细胞转染前将6孔细胞培养板中的培养液吸弃掉，用pbs洗两遍，更换为新鲜的opti-mem培养液，培养板放回培养箱。

(4)配制转染试剂：

solutiona：向一个无菌的1.5ml离心管中加入100μl的opti-mem培养液，再加入2μg质粒pd2egfp-na，轻轻混匀，室温静置5分钟。

solutionb：向一个无菌的1.5ml离心管中加入100μl的opti-mem培养液，再加入6-8μllipofectamine2000(invitrogen公司)转染试剂。然后将solutiona缓慢的加入到solutionb中，室温静置20分钟。

(5)取出6孔板，将(4)中的混合液加到孔内，晃匀。

(6)转染6h后，将6孔板中的培养液吸弃掉，更换为新鲜的含有10％胎牛血清的(fetalbovineserum，fbs)和1％双抗(penicillin-streptomycinsolution，ps)的mem培养液，继续培养24h。

(7)转染24h后，将6孔细胞培养板置于荧光显微镜下观察，若能观察到细胞内有明显绿色荧光的表达(因载体质粒pd2egfp-n1上有一段表达绿色荧光的基因序列egfp)，则说明质粒pd2egfp-na成功转染入mdck细胞内。

(8)细胞转染24h后，若显微镜下观察有绿色荧光的表达，即可将培养液换成含有10％胎牛血清的(fetalbovineserum，fbs)和500μg/mlg418的mem培养液进行细胞的筛选，4-5天更换一次培养液，直至其他细胞全部死亡，只剩下阳性克隆的细胞即筛选成功。

(9)将筛选成功的细胞进行培养，验证是否可稳定传代，若能稳定传代，则证明稳定表达a/chicken/shandong/830/2014(h9n2)流感病毒表面糖蛋白神经氨酸酶na的mdck细胞系构建成功。

细胞系的培养：293t细胞培养在含有10％胎牛血清的(fetalbovineserum，fbs)和1％双抗(penicillin-streptomycinsolution，ps)的dmem(dulbecco′smodifiedeagle′smedium)培养液于37℃培养箱培养。改造的mdck细胞(稳定表达神经氨酸酶na)培养在含有10％胎牛血清的(fetalbovineserum，fbs)和1％双抗(penicillin-streptomycinsolution，ps)的mem培养液于37℃培养箱培养。(培养基和血清均购自biologicalindustries公司)。

细胞系转染：将293t细胞与改造的mdck细胞按1:1比例铺在6孔细胞培养板中，每孔7x10⁵个细胞，待细胞生长密度达到60％-70％进行转染。转染前将6孔细胞培养板中原有的dmem培养液吸弃掉，用磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersaline，pbs)洗两遍，更换为2ml新鲜的opti-mem培养液。利用转染试剂lipofectamine2000(invitrogen公司)向293t细胞与mdck细胞中转入八个质粒phw-pb2、phw-pb1、phw-pa、phw-ha、phw-np、phw-na-ha、phw-m、phw-ns。转染6小时后，弃掉6孔细胞培养板中培养液，更换为2ml新鲜的opti-mem培养液；转染24小时后，向培养液中加入1μg/ml甲苯磺酰基-l-氨基联苯氯甲基酮胰酶(tosylsufonylphenylalanylchloromerthylketone-trypsin,tpck-trypsin)，继续培养48小时后，收集细胞上清液。

实施例3测试重组病毒的生长曲线

稳定表达na的mdck细胞培养在含有10％胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)和1％双抗(penicillin-streptomycinsolution，ps)的mem培养液于37°c培养箱培养。(培养基和血清均购自biologicalindustries公司。)将改造的mdck细胞铺在6孔细胞培养板中，每孔3x10⁵个细胞，待细胞生长密度达到90％进行病毒的扩增。在病毒扩增前，将改造的mdck细胞用磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersaline，pbs)洗两遍，用moi＝0.001的重组病毒感染细胞，吸附1小时后更换为2ml含有0.2％牛血清白蛋白(bovineserumactin,bsa)和1μg/ml的tpck的mem培养液，然后于感染后12、24、48、72小时收集上清液存于-80℃保存。

实施例4利用空斑实验测病毒的滴度

实验分为如下两组：

第一组用野生型a/chicken/shandong/830/2014(h9n2)流感病毒，第二组用拯救出的重组病毒a830-ha，在可稳定表达a/chicken/shandong/830/2014(h9n2)流感病毒na的mdck细胞中进行空斑实验。

空斑实验：

(1)将稳定表达na的mdck细胞均匀平铺于两个6孔板中，每孔8x10⁵个细胞。配制无血清2xdmem培养液，用naoh溶液调试ph值为7-7.5，用滤器过滤备用。配制1.6％低熔点琼脂糖：称取0.18g琼脂糖溶于15ml超纯水中，微波炉40s至完全溶解后，放入42℃水浴锅中恒温保存。

(2)稀释病毒：取八个1.5ml离心管，标记为1-8号，分别向离心管中加入900μl的无血清dmem培养液；然后向1号管内加入100μl的病毒液，充分混匀，再从1号管中取100μl液体加入2号管中，混匀，依次倍比稀释到8号管。

(3)取出6孔板，吸弃培养液，用含钙、镁离子的pbs洗一遍。第1-6孔分别加入稀释浓度为10^-3-10^-8稀释度的病毒液，放入37℃温箱孵育1h。期间每隔15分钟，取出轻轻晃匀，使病毒液充分吸收。

(4)配制维持液：向13.5ml的无血清2ⅹdmed培养液中，加入1200μl5％bsa、300μl非必需氨基酸neaa和37.5μl浓度为1mg/mltpck-trypsin储存液于37℃恒温放置。

(5)1h后取出6孔板，吸弃孔中剩余的病毒液，用加钙、镁离子的pbs洗一遍。混合1.6％低熔点琼脂糖和维持液，混匀后，向6孔板的每个孔中加入4ml。待凝固后，放入37℃恒温培养。

(6)3天后取出6孔板，将孔内的凝胶弃掉。每个孔加入500μl的考马斯亮蓝染料(coomassiebrilliantblue)，室温静置5分钟，用水缓慢冲洗掉染料，观察统计每个孔的空斑数，并制作病毒的生长曲线图，如图3实验组a830-ha重组病毒的生长曲线跟对照组a830病毒在细胞的生长曲线趋势一样，说明重组病毒a830-ha在稳定表达na的mdck细胞系中具有良好的复制增殖能力。

实施例5动物实验

1.安全性试验：以攻毒后spf鸡存活率为指标研究重组病毒a830-ha在spf鸡体内的安全性。

将健康的4-5周龄的spf鸡随机分成4组，每组8只。用3种不同滴度包括10⁵、10⁶、10⁷pfu的a830-ha重组流感病毒经鼻腔接种攻毒后，每天观察统计每组中spf鸡的存活率。如图4所示利用不同滴度的a830-ha重组流感病毒经鼻腔攻毒后，并不会影响spf鸡的存活率，说明在没有外源性na存在时，重组病毒a830-ha对机体不具有感染性。

2.免疫保护实验：该复制缺陷型二价弱毒活疫苗对a型流感病毒h9n2和h5n1中和实验的研究。

将健康的4-5周龄的spf鸡随机分成4组，每组8只。第一组为阴性对照组，用pbs免疫接种；第二组阳性对照，用10pfu/只的a830病毒液鼻腔接种免疫，第三组和第四组分别用10pfu/只和100pfu/只a830-ha重组病毒液接种免疫。免疫后第29天时，以上四组(表1)均用10ⅹld50野生a830病毒液攻毒，统计存活率(如图5所示使用10pfu/只和100pfu/只a830-ha重组病毒接种免疫的实验组，与阳性对照组一致，其体重跟存活率并无变化，说明a830-ha重组病毒对机体具有良好的免疫效果)。

表1：小鼠免疫攻毒列表

采集以上四组中实验spf鸡的血液，分离血清；进行血凝抑制实验和病毒中和试验。

血凝抑制实验测抗野生a830病毒血清抗体效价：

(1)将待检血清放置冰上融化备用。取v型96孔微量反应板，做好标记。

(2)用微量移液器向第1-10孔各加入25μl生理盐水，第11孔加50μl生理盐水。

(3)用微量移液器吸取25μl被检血清，放入第1孔，吸头浸于液体中缓慢吹吸几次，使被检血清与稀释液混合均匀，再吸取25μl液体小心地移至第2孔，如此连续稀释至第10孔，最后第10孔吸取25μl液体弃掉，被检血清稀释倍数依次为1：2-1：1024。第11孔为红细胞对照，第12孔为抗原对照。

(4)第1-10孔每孔再各加入25μl含有4个单位的病毒液。第11孔为红细胞对照孔，不加病毒液；第12孔为抗原对照，加病毒液。

(5)置振荡器上振荡1-2min后，放37℃静止20min。

(6)每孔再加入25μl0.8％红细胞悬浮液，放微量振荡器上振荡1-2min混匀，置37℃，15min后判定结果。

(7)结果判定：凝集现象表现为红细胞平铺在v型管底壁；未凝集的红细胞在v型血凝孔中呈现为明显的红色圆点。将反应板倾斜45度角后判定结果，当红细胞呈现泪滴状流淌且没有凝集颗粒时为100％抑制。

(8)结果结算：按reed-muench两氏或karber法进行计算。

表2：血凝抑制实验测抗野生a830病毒血清抗体效价

由表2中血凝效价数据可知，2、3、4组中血凝效价都很高，说明针对a/chicken/shandong/830/2014(h9n2)血清抗体的浓度很高，间接表明重组病毒a830-ha对于h9n2亚型流感病毒感染具有良好的免疫保护作用。

病毒微量中和实验：

(1)将mdck细胞铺于96孔细胞培养板中。

(2)待检血清于56℃30分钟灭火。

(3)倍比稀释待检血清，向每管不同稀释倍数的血清中加入100pfu的重组a830-ha病毒液。

(4)培养箱中取出培养mdck细胞的96孔细胞培养板，弃掉培养液，用pbs洗两遍。

(5)将(3)中所述配制好的不同稀释倍数的血清与病毒混合液对应的加入到96孔细胞培养板中，做好标记，置于37℃培养箱中培养72小时。

(6)检测中和滴度。

表3：病毒微量中和实验

由表3中的中和滴度数据可知，3、4组中和滴度很高，说明针对a/wildduck/hunan/021/2005(h5n1)的血清抗体的浓度很高，表明重组病毒a830-ha对于h5n1亚型流感病毒感染具有良好的免疫保护作用。

序列表

<110>青岛农业大学

<120>一种表达h5亚型ha的复制缺陷型重组h9n2禽流感病毒

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2102

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

agcaaaagcaggagtgaaaatgaatccaaatcagaagataatagtaattggctctgtttc60

tctaaccattgcgataatatgcttcctcatgcagattgccatcttaacaacgactatgac120

aatacatttcaagcaaaatgaatgcagcaacccatcaaataatcaagtgatgccatgtga180

accgatcctaatagagaggaacaatggagaaaatagtgcttcttcttgcaatagtcagcc240

ttgttaaaagtgatcagatttgcattggttaccatgcaaacaactcgacagagcaggttg300

acacgataatggaaaagaacgttactgttacacatgcccaagacatactggaaaaggcac360

acaacgggaagctctgcaatctagatggagtgaagcctctgattttaagagattgtagtg420

tagctggatggctcctcggaaacccaatgtgtgacgaattcatcaatgtgccggaatggt480

cttacatagtggagaaggccaacccagccaatgacctctgttacccagggaatttcaacg540

actatgaagaactgaaacacctattgagcagaataaaccattttgagaaaattcagatca600

tccccaaaagttcttggtccgatcatgaagcctcatcaggggtgagctcagcatgtccat660

accagggaacgccctcctttttcagaaatgtggtatggctcatcaaaaagaacaatacat720

acccaacaataaagagaagctacaataataccaaccaggaagatcttttgatactgtggg780

ggattcatcattctaatgatgcggcagagcagacaaagctctatcaaaacccaaccacct840

atatttccgttgggacatcaacactaaaccagagattggtaccaaaaatagctactagat900

ccaaagtaaacggacaaagtggaaggatggatttcttctggacaattttaaaaccgaatg960

atgcaatcaacttcgagagtaatggaaatttcattgctccagaatatgcatacaaaattg1020

tcaagaaaggggactcagcaattatgaaaagtgaagtggaatatggtaactgcaacacca1080

agtgtcaaactccaataggggcgataaactctagtatgccattccacaacatacaccctc1140

tcaccatcggggaatgccccaaatatgtgaaatcaaacaaattagtccttgcgactgggc1200

tcagaaatagtcctctaagagaaagaagaagaaaaagaggactatttggagctatagcag1260

gttttatagagggaggatggcagggaatggtagatggttggtatgggtaccaccatagca1320

atgagcaggggagtgggtacgctgcagacaaagaatccactcaaaaggcaatagatggag1380

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gggaatttaataacttagaaaggagaatagagaatttaaacaagaaaatggaagacggat1500

tcctagatgtctggacttataatgctgaacttctggttctcatggaaaatgagagaactc1560

tagacttccatgactcaaatgtcaagaacctttacgacaaggtccgactacagcttaggg1620

ataatgcaaaggagctgggtaatggttgtttcgagttctatcacaaatgtgataatgaat1680

gtatggaaagtgtaagaaacggaacgtatgactacccgcagtattcagaagaagcaaaat1740

taaaaagagaggaaataagtggagtaaaattggaatcaataggaacttaccaaatactgt1800

caatttattcaacagtggcgagttctctagcactggcaatcatggtggctggtctatctt1860

tatggatgtgctccaatgggtcgttacaatgcagaatttgcatttaacaacaggtgtttt1920

tatgtggagctgataggagggaggccacaggagcccagagtgtggtggacttcaaatagc1980

atcattgtattctgtgggacctcaggtacatatgggacaggctcatggcctgatggagcg2040

aatatcaacttcatgcctatataagcctccgcaattttagaaaaaaactccttgtttcta2100

ct2102