一种抵抗肿瘤免疫抑制环境的BTLA-/-T淋巴细胞的制备方法与应用与流程

本发明涉及生命科学与医学的交叉技术领域，特别涉及基因编辑的免疫细胞，具体是指一种抵抗肿瘤免疫抑制环境的btla^-/-t淋巴细胞的制备方法与应用。

背景技术：

t淋巴细胞在体外免疫系统能够识别肿瘤抗原并杀伤肿瘤细胞，t淋巴细胞本身应是人体内抗肿瘤的“斗士”，但因各种原因，导致免疫耐受和逃逸，在体内不能有效地杀伤肿瘤细胞。

一个成型的肿瘤是一个复杂的组织，它不仅由肿瘤细胞组成，还包括也基质细胞，炎症细胞，脉管系统和细胞外基质，所有这些总和定义为肿瘤微环境。免疫治疗的抗性机制包括如下：(1)抑制性微环境或缺乏抗原刺激/协同刺激的免疫细胞，尤其是t细胞，可能会促使肿瘤的生长和免疫逃逸；(2)生物屏障对肿瘤组织的包裹可导致免疫细胞迁移进肿瘤部位的数量不足；(3)有限的抗原特异性t细胞群短暂激活或耗竭未能抑制肿瘤生长。

b及t淋巴细胞弱化因子(btla)是免疫协同刺激分子中的一种免疫抑制性受体，其功能是通过传递抑制信号阻止淋巴细胞的活化。肿瘤细胞通过表达hvem(herpesvirusentrymediator)与t淋巴细胞表面的btla受体结合，传递负性信号，抑制t淋巴细胞的活化和增殖，导致t淋巴细胞丧失杀伤肿瘤细胞的能力，为肿瘤的免疫逃逸创造有利条件。

crispr(clustered,regularlyinterspaced,shortpalindromicrepeats)-cas9是一种来自细菌降解入侵的病毒dna或其他外源dna的免疫机制。cas9蛋白(含有两个核酸酶结构域，可以分别切割dna。crispr-cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种抵抗肿瘤免疫抑制环境的btla^-/-t淋巴细胞的制备方法与应用。

本发明的有益效果在于：

利用crispr-cas9技术进行基因编辑，选择性地敲除细胞基因中一种编码btla蛋白的基因，从而将t细胞潜在的对肿瘤细胞的攻击能力“激活”。在体外进行t细胞培养扩增后，再输回患者体内，用t细胞去攻击肿瘤细胞，达到预期的治疗目的。

附图说明

图1为btla-sgrna-cas9质粒设计图谱；

图2为btla-sgrna-cas9在hela细胞中的敲除作用的验证；其中，泳道1：btla^-/-293t细胞；泳道2：btla^-/+hela细胞；泳道3：btla^-/+hela细胞；泳道4：btla^-/+hela细胞；泳道5：btla^-/-hela细胞；泳道6：btla^+/+hela细胞；泳道7：dnamarker。

图3为流式检测野生型t淋巴细胞、btla^-/-t淋巴细胞的btla受体表达情况；

图4为野生型t淋巴细胞、btla^-/-t淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。

具体的实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的实验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1，btla-sgrna-cas9质粒的构建与验证；

1.合成2条oligo序列，退火形成双链dna；

1.1合成oligo序列：

btla-sgrna1：5’-gagagttcattttgctttcc-3’及其互补序列；

btla-sgrna2：5’-gtgacttggtgcaagctcaa-3’及其互补序列；

btla-sgrna3：5’-gacttaactcctcacacata-3’及其互补序列；

btla-sgrna4：5’-ggtcagtttacctaccccag-3’及其互补序列；

btla-sgrna5：5’-ggaaaaactgctcaagtaga-3’及其互补序列；

1.2将合成后的oligdna退火形成dna。

2.将双链dna连接到载体中；

将cas9载体进行线性化处理，使用t4dnaligase将oligdna和载体进行连接。

3.转化dh5α细胞，筛选阳性细胞，提取质粒，测序验证序列；

连接后的btla-sgrna-cas9转化dh5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素的琼脂板上进行筛选生长，对获得的单菌落进行测序(图1)。

4.质粒大提，脂质体转染hela细胞；

4.1将测序正确的菌液扩大培养，提取质粒。

4.2使用脂质体将btla-sgrna-cas9质粒转入hela细胞，隔天换液；

4.3在hela细胞内，质粒发挥作用，进行btla基因的切除；

5.提取细胞的dna，进行t7e1酶切，进行比对分析(图2)；

结果如图1和图2所示，构建了btla-sgrna-cas9质粒，并且该质粒能够将hela细胞中的btla基因敲除。

实施例2，btla^-/-t淋巴细胞的制备；

1.采集健康人的外周血，经检测无传染病污染后，等体积生理盐水稀释，利用ficoll淋巴细胞分离液将稀释的外周血进行单个核细胞的分离，分离后的单个核细胞进行磁珠分选，获得cd3⁺的t淋巴细胞；

2.使用脂质体将btla-sgrna-cas9质粒转入t淋巴细胞，隔天换液；

3.将细胞放入含有2000iu/ml的ifn-γ的x-vivo15培养基中，37℃，5％二氧化碳培养24h；

4.然后加入20μg/ml的cd3单抗、500iu/mlil-2、50ng/mlil-1α、100ng/mlil-4、2000iu/mlgm-csf、5μg/mlpuromycin；

5.培养3～5天后，添加500iu/mlil-2的新鲜培养基，细胞浓度保持在1～2x10⁶/ml；

6.每隔2～3天对细胞进行计数，并添加含500iu/mlil-2的新鲜培养基，继续培养10～15天；

7.收获细胞，进行btla-pe染色，测定btla^-/-t淋巴细胞的比率(图3)；

8.提取总dna，进行t7e1酶切。

结果如图3所示，btla-sgrna-cas9质粒能够敲除t细胞中的btla基因，可以获得btla^-/-t淋巴细胞制剂。

实施例3，btla^-/-t淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤活性的测定；

1.将btla^-/-t淋巴细胞与表达hvem的a549细胞进行共培养；

2.共培养24h后，收获a549细胞，使用annexinv-fitc和7-aad染色，流式测定a549的凋亡率(图4)。

结果如图4所示，相对于野生型t淋巴细胞，btla^-/-t淋巴细胞能够引起表达hvem的a549凋亡增加。

图1～4显示，使用cas9技术能够敲除t淋巴细胞的btla基因，btla^-/-t淋巴细胞能够抵抗hvem的抑制作用。