一种人颅骨间充质干细胞来源的神经元样细胞的悬浮培养方法与流程

本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种人颅骨间充质干细胞来源的神经元样细胞的悬浮培养方法。

背景技术：

颅脑外伤、脑血管意外和脊髓损伤是世界范围内的常见病和多发病，也是导致伤病后残疾的首要因素。尽管目前在颅脑外伤和脑血管意外的急救和早期康复方面取得了很大进展，但对于颅脑外伤和脑血管意外后期的神经功能缺失仍缺乏有效的治疗方法。细胞移植治疗为上述疾病治疗提供了新方向，但由于用于细胞移植治疗的神经细胞无法获取而外源性神经细胞又难于培养扩增，因此，寻找一种能在体外条件下为神经干细胞构建较完美的立体组织载体以维持细胞的分化增殖，同时又能够在移植缺损的组织中促进组织再生并发挥功能的培养方法已成为治疗的关键。结冷胶(gellangum)是一种由革兰阴性好氧杆菌(少动鞘氨醇单胞菌)产生的阴离子型线型胞外多糖，随着悬浮凝胶技术的发展，结冷胶因其卓越的胶凝性能和离子敏感特性，使它在医药领域受到了很大关注，尤其在药剂学和组织工程方面，主要是作为细胞移植的载体。常规条件下，神经干细胞的培养或移植往往由于重力作用的缘故使细胞无法分布形成立体组织结构，而利用经修饰处理的结冷胶配制的悬浮凝胶不仅能在体外条件下为神经干细胞的诱导分化和培养增殖构建一个合适的立体组织载体，同时也能为今后中枢神经系统的细胞移植治疗提供促进神经细胞连接再生并发挥功能的组织构架。本发明的这种人颅骨间充质干细胞来源的神经元样细胞的悬浮培养方法兼顾了神经干细胞的实验研究和临床应用，为今后实验室条件下神经干细胞的分化增殖和临床干细胞移植治疗提供了一种新的手段和方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述不足，提供一种人颅骨间充质干细胞来源的神经元样细胞的悬浮培养方法。

一种人颅骨间充质干细胞来源的神经元样细胞的悬浮培养方法，包括如下步骤：

步骤一、人体颅骨碎块或碎屑作为组织来源提取骨髓间充质干细胞，培养孵化后以10⁴～10⁶个/cm²的密度接种至诱导液，诱导液的组成：1×n2、1×b27、30～50ng/mlb-fgf，溶剂为dmem/f12基础培养液，在37℃/5％co2培养箱中分化诱导培养21天，获得神经元样细胞；

步骤二、选用成品结冷胶加热至90℃以上配制成1％～3％质量分数比的溶液备用，溶剂为pbs，根据细胞培养接种的密度和诱导分化的要求，在dmem培养基中添加配制的结冷胶溶液并加入浓度为10mmol/dm³的氯化钙，冷却至30-35℃即成悬浮凝胶；

步骤三、采用电子显微镜或激光共聚焦显微镜观察不同浓度结冷胶溶液配制的悬浮凝胶中网络结构的致密度和孔径的大小，筛选出适合神经元样细胞培养增殖和诱导分化的悬浮凝胶配比浓度和相应的载体构造；

步骤四、将选取的神经干细胞移入悬浮凝胶-dmem培养基中完成培养增殖。

作为优选：步骤二中悬浮凝胶终浓度组成：0.5％-1.5％质量分数比的结冷胶，10mmol/dm³氯化钙溶液，溶剂为dmem/f12基础培养液。

作为优选：步骤四中，以0.01％-0.1％质量分数比浓度的结冷胶配制悬浮凝胶dmem培养基。

作为优选：步骤三中，筛选的神经元样细胞突触伸长，胞体缩起呈类圆形，相邻细胞突触发生连接，超微形态结构检查证实神经元样细胞间形成中间连接，并有绒毛状和突触样结构。

本发明的有益效果是:本发明所述方法弥补了现有实验室条件的技术缺陷和因重力等客观因素的制约并结合神经干细胞的生物学行为和功能形态特征，利用经修饰处理的结冷胶配制悬浮凝胶-dmem培养基能有效地诱导分化人颅骨间充质干细胞，并为神经元样细胞的生长和功能重塑提供合适的立体组织载体，更重要的是，分化成熟的神经元样细胞不仅具备神经细胞的形态特征，同时还具有功能性的微绒毛和突触样结构的形成以及细胞间中间连接的建立。

附图说明

图1为人颅骨间充质干细胞来源的神经元样细胞的形态显微图，图示神经元样细胞突触伸长，胞体缩起，相邻细胞突触发生连接。放大100倍。

图2为人颅骨间充质干细胞来源的神经元样细胞的形态显微图，图示神经元样细胞在悬浮凝胶-dmem培养基中呈串连状增殖生长。放大100倍。

图3为人颅骨间充质干细胞来源的神经元样细胞的neun和nse双标记免疫荧光检测图，结果显示阳性。放大100倍。

图4为激光共聚焦显微镜下左边0.06％，右边0.04％质量分数比浓度结冷胶溶液配制的悬浮凝胶中网络状结构显示图；

图5为悬浮凝胶-dmem培养基中培养增殖的人颅骨间充质干细胞来源的神经元样细胞在电子显微镜下的超微形态结构图，图示胞体表面的微绒毛和突触样结构。

图6为悬浮凝胶-dmem培养基中培养增殖的人颅骨间充质干细胞来源的神经元样细胞在电子显微镜下的超微形态结构图，图示神经元样细胞间的中间连接。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步描述。下述实施例的说明只是用于帮助理解本发明。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

实施例1：人颅骨间充质干细胞的分离

将10cm³颅骨骨片用医用电动钻锯切碎后，转移至50ml离心管中，加入25ml生理盐水，混匀后，置于低温摇床中，于8℃，转速为100～200转/分钟条件下，摇15分钟，200目筛网过滤，滤液1000rpm离心6min，去除上清后，沉淀用细胞培养液悬浮，取少量悬液通过全自动血液分析仪进行计数后，以2×10⁵/cm²密度接种至25cm²塑料细胞培养瓶中，置于37度，含5％co2培养箱中培养，48h后倾倒除去未贴壁细胞，换新鲜培养液，而后每2天换液，待细胞长至90％汇合时，消化传代，至p3代，得到形态单一的纤维样人颅骨间充质干细胞。

实施例2：人颅骨间充质干细胞体外分化诱导为神经元样细胞

取实施例1方法获得的p3代人颅骨间充质干细胞接种至诱导液，37℃，5％co2培养箱中诱导培养21天，其中每2天换液，收集诱导细胞进行鉴定，获得成熟的神经元样细胞。

诱导液终浓度组成：1×n2、1×b27、50ng/mlb-fgf，溶剂为dmem/f12基础培养液(购自corning公司)。n2、b27购自gibco公司，b-fgf购自peprotech公司。

实施例3：人颅骨间充质干细胞来源的神经元样细胞的培养增殖

取实施例1方法获得的神经元样细胞接种至以不同浓度结冷胶配制的悬浮凝胶-dmem培养基，置于37℃/5％co2培养箱中常规培养增殖，收集细胞进行观察和检测。

悬浮凝胶的配制：成品结冷胶(gelrite^@)加热后配制成溶液，加入氯化钙溶液冷却后与dmem/f12基础培养液混合置于培养容器。成品结冷胶(gelrite^@)可由市购获得。

实施例4：人颅骨间充质干细胞来源的神经元样细胞的鉴定

(1)形态学观察：分别利用光学显微镜对未经过诱导的人颅骨间充质干细胞和经诱导液诱导至第21天的细胞观察细胞形态，并拍照记录，结果见图1所示，放大100倍。

(2)神经细胞标志蛋白免疫荧光检测：诱导液诱导后的细胞经4％多聚甲醛室温(25℃)固定15min后，用pbs(ph值为7.4)漂洗除去多聚甲醛，再用0.05％tritonx-100(购自sigma公司)室温浸泡处理10分钟，然后用5％山羊血清(购自生工生物)在室温封闭1h，pbs清洗两次，细胞分成4组，分别加入一抗，组1为抗tuj-1，组2为抗neun和抗nse，组3为抗syn，一抗均购自abcam公司，4℃湿盒孵育过夜；pbs浸洗三次，每次10min；依次加入荧光标记二抗，组1为alexa488、组2为alexa488和alexa647标记二抗，组3为alexa647(二抗均购自联科生物公司)，37℃孵育1h，pbs浸洗三次；3组细胞dapi(购自sigma公司)染核，激光共聚焦显微镜(carlzeiss)观察拍照。结果见图3，放大100倍。

(3)悬浮凝胶的配制：成品结冷胶(gelrite^@)加热至90℃添加蒸馏水配制成浓度为0.01％-0.1％质量分数比的溶液，选取其中浓度为0.02％，0.04％，0.06％，0.08％和0.1％质量分数比的结冷胶溶液加入浓度为10mmol/dm³的氯化钙溶液在室温下冷却至30-35℃，最后加入dmem/f12基础培养液即成悬浮凝胶-dmem培养基。采用激光共聚焦显微镜观察不同浓度结冷胶溶液配制的悬浮凝胶中网络结构的致密度和孔径的大小，筛选出适合神经元样细胞培养增殖和诱导分化的悬浮凝胶配比浓度和相应的载体构造，将选取的神经细胞移入悬浮凝胶-dmem培养基中完成培养增殖。

(4)神经细胞微结构检测：收集诱导21天的细胞于离心管中，1000rpm/min离心10min，弃上清，细胞沉淀用2.5％戊二醛固定，4℃固定30min，pbs漂洗3次，1％锇酸固定2h，pbs漂洗，丙酮脱水，包埋，90nm切片，透射电镜观察拍照。结果见图5和图6所示。

结果表明，培养所得的神经元样细胞具有神经细胞的形态特征和神经细胞标志蛋白表达(neun和nse双标记阳性)，此外，在电子显微镜下也观察到经悬浮凝胶-dmem培养基培养增殖的神经元样细胞具备神经元细胞特征性的突触样结构和微绒毛，并有细胞间的中间连接形成，表明本悬浮培养方法能够有效地促进神经元样细胞的增殖并产生有效的细胞间连接。