诱导人多能性干细胞分化为RPE细胞的方法与流程

本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种诱导人多能性干细胞分化为rpe细胞的方法。

背景技术：

视网膜变性(retinaldegeneration,rd)疾病是一种以进行性视功能下降为特征的疾病，具有遗传性和后天性，是临床上多见而又难治的一类致盲性眼病。其主要包括各种类型的视网膜色素变性(retinitispigmentosa,rp)、stargardt病以及年龄相关性黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration,amd)等。rd发病多与眼内的rpe细胞的病变和凋亡相关。rpe是在位于bruch膜和视网膜中间的一层极性单层色素上皮细胞。rpe在视觉形成过程中承担着十分重要的作用：rpe不仅有助于血脑屏障的形成，而且完成与光感受细胞的营养和代谢产物的交换。在视觉形成中有如此重要的作用的rpe，在人体并没有自身的rpe修复和更新的系统。随着rd的病程的发展，除了营养支持和促进细胞的存活来延缓病程外，rpe细胞的凋亡过程是不可逆的，故rpe细胞的移植治疗已经成为rpe退行性rd疾病的最有治疗前景的治疗方法。

rpe细胞移植替代治疗是近30年国内外生物医学领域研究治疗rd的热点。rpe移植最关键的问题是细胞来源。早在上个世纪80年代，已经有报道分离、培养和保存人原代rpe细胞的方法。到目前，研究报道的供rd治疗的细胞有来自人的原代rpe细胞、人胎儿rpe细胞、成体干细胞、人胚胎干细胞来源的rpe(humanembryonicstemcellrpe,hesc-rpe)和人诱导多能干细胞来源的rpe(humaninducedpluripotentstemcell,hipsc-rpe)等。1991年peyman等第一次报道了移植人自体和异体来源的rpe细胞治疗amd。随后有关于胎儿来源的rpe、自体周围rpe以及成体rpe细胞悬液移植的研究报道相继出现。成体rpe细胞来源的局限性和伦理限制了成体rpe的临床使用。随着胚胎干细胞技术和诱导多能干细胞技术的出现和发展，胚胎干细胞和诱导多能干细胞为rpe细胞的移植提供了很好的选择。schwartz等移植胚胎干细胞来源的rpe临床治疗amd，接近一半的受试者的视力得到了部分提高。另外，mandai等利用自体诱导多能干细胞获得的rpe临床移植治疗amd病人一例，虽然病人的视力并未提高，但是却延缓了amd的病程的发展。

人多能性干细胞(humanpluripotentstemcell,hpsc)主要包括人诱导多能干细胞(humaninducedpluripotentstemcell,hipsc)和人胚胎干细胞(humanembryonicstemcell,hesc)。然而，直接移植hesc和hipsc是无法治疗rd的。体外诱导hesc和hipsc分化为rpe是利用hesc和hipsc治疗rd的关键。目前，诱导分化人hesc/hipsc分化为rpe主要有两种方法，早期通过hesc/hipsc形成类胚体的自发分化方式，在分化4到8周时可以得到含有色素细胞的类胚体(embryonicbody,eb)，该方法分化周期长、分化条件不确定而且效率很低，只有不到1％的eb含有具有色素的rpe细胞。另外一种较为普遍的方法是通过hesc/hipsc的过度生长，扩增到多层细胞时，撤去bfgf的诱导分化方法。在分化过程中加入调控分化的小分子或者小分子蛋白，该方法可以有效的提高rpe的分化效率。大部分研究报道显示多在去除bfgf后1到8周出现褐色素点。在6到14周，褐色素面积逐渐变大。这两种方法一般都机械分离色素区，然后扩增培养从而获得rpe细胞，但是效率低、周期长，仅能部分满足实验需求。

hpsc来源的rpe为治疗rd提供了丰富的细胞来源。但是在临床研究中发现，rpe细胞悬液移植的细胞活力低，治疗效果不佳。另外一种移植方式，rpe植片移植，即将rpe细胞培养在生物相容性的材料上，形成rpe的紧密连接和细胞极性后再移植治疗rd。却又面临的新的问题，植片材料的选择。rpe在体内所处的环境决定了对植片材料具有十分苛刻的要求。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种诱导人多能性干细胞分化为rpe细胞的方法，可通过移植rpe临床治疗rd。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明提供一种诱导人多能性干细胞分化为rpe细胞的方法，包括以下步骤：

(1)诱导人多能性干细胞分化为神经前体细胞(npc)；

(2)培养神经前体细胞(npc)为神经上皮；

(3)诱导神经上皮转化为视神经上皮和视网膜前体细胞；

(4)视网膜前体细胞传代培养后形成幼稚rpe细胞。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，利用tgfβ受体抑制剂和bmp受体抑制剂培养人多能性干细胞分化为神经前体细胞。

在本发明的一个实施方式中，所述tgfβ受体抑制剂选用sb431542，所述bmp受体抑制剂选用dmh1。

在本发明的一个实施方式中，所述tgfβ受体抑制剂sb431542的加入量为2μm/ml，所述bmp受体抑制剂选用dmh1的加入量为2μm/ml。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，培养6天后，99.9％的hpsc分化表达神经前体标志性基因pax6细胞。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，培养基使用n2b27，tgfβ受体和bmp受体双抑制剂在n2b27培养条件下能高效的分化hpsc为npc。

在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，在shh、igf1和egf存在的条件下，培养神经前体细胞(npc)为神经上皮。

将神经前体细胞培养至融合的上皮样状态有利于分化为视神经上皮。神经前体细胞上皮样过程中添加shh、igf1和egf激活了erk和jnk信号通路促进了神经上皮的生长和形成。

具体而言，所述npc在第6天传代后，在shh、igf1和egf的条件培养下可以快速增殖，形成神经上皮样细胞。

shh、igf1和egf能激活erk和jnk信号通路，而erk和jnk信号通路是促进npc增殖为神经上皮的关键要素。

在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中，添加tgfβ信号通路激活因子和wnt信号激活因子诱导神经上皮转化为视神经上皮和视网膜前体细胞。

在本发明的一个实施方式中，tgfβ信号通路激活因子选用activina，wnt信号激活因子选用小分子chir99021。

tgfβ信号通路激活因子activina和wnt信号激活小分子chir99021能促进神经上皮细胞骨架重塑和表达视网膜神经上皮转录因子mitf。

在本发明的一个实施方式中，步骤(4)中，用酶消化培养的幼稚rpe得到幼稚rpe的细胞悬液。

在本发明的一个实施方式中，步骤(4)中，视网膜前体细胞使用胰酶消化，传代至新的matrigel包被的培养皿，使用添加egf成分培养基继续培养得到处于幼稚状态的rpe细胞。

在本发明的一个实施方式中，步骤(4)后，幼稚rpe继续培养可以成为结构和功能与原代rpe细胞相似的成熟rpe。成熟rpe细胞呈鹅卵石样，褐色素加深。

在本发明的一个实施方式中，所述人多能性干细胞包括人诱导多能干细胞(humaninducedpluripotentstemcell,hipsc)和人胚胎干细胞(humanembryonicstemcell,hesc)。

本发明中，所述的幼稚rpe细胞为具有增殖性相关基因蛋白和胞外基质基因蛋白的表达、色素含量低的一类rpe细胞，具有重建bruch膜的能力。

在本发明的一个实施方式中，幼稚rpe细胞悬液用于制备治疗视网膜退行性疾病药物的应用。

本发明可以在体外诱导hpsc高效分化为可供移植治疗视网膜变性的幼稚rpe细胞。在诱导分化过程中，本发明利用2μm/ml的tgfβ受体抑制剂sb431542和2μm/ml的bmp受体抑制剂dmh1培养诱导hpsc，培养6天后，99.9％的hpsc细胞分化为表达神经前体标志性基因pax6的细胞。而后继续使用shh、igf1和egf培养神经前体细胞至上皮样，添加chir99021和activina诱导神经前体细胞分化为视网膜前体细胞，视网膜前体细胞传代培养后可形成幼稚rpe。幼稚rpe继续培养可以成为结构和功能与原代rpe细胞相似的成熟rpe。

本发明还提供幼稚rpe作为治疗视网膜变性的应用。以及幼稚rpe细胞悬液用于治疗视网膜变性疾病，重建bruch膜的应用。

幼稚rpe细胞悬液直接注射到视网膜下腔下治疗的形式使用。

其中，移植幼稚rpe细胞悬液治疗视网膜变性优于成熟rpe细胞悬液移植。

在动物试验中，本发明利用视网膜下腔注射5μl的分化25天的幼稚rpe细胞悬液(3×10⁵)和分化45天的成熟rpe细胞悬液(3×10⁵)治疗rcs大鼠视网膜变性。移植结果显示幼稚rpe细胞悬液能够有效的保护rcs大鼠由于自身rpe损伤凋亡造成的视觉功能下降以及视网膜结构的破坏。

本发明首次发现了将神经前体细胞培养至融合的上皮样状态有利于分化为视神经上皮。同时，发现了神经前体细胞上皮样过程中添加shh、igf1和egf激活了erk和jnk信号通路促进了神经上皮的生长和形成。此外，在神经上皮状态，激活tgfβ和wnt信号通路可以诱导神经上皮向视神经上皮分化，得到视网膜前体细胞和rpe细胞。最后，直接移植分化过程中得到的幼稚rpe细胞悬液可以有效的在视网膜下腔形成有功能的rpe。

本发明提供了幼稚rpe细胞和成熟rpe细胞作为治疗神经系统退行性疾病的应用。可以是直接注射幼稚rpe和成熟rpe细胞悬液治疗的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：。

1、目前诱导hesc/hipsc分化为rpe细胞过程中，细胞状态不明确，得到的rpe的效率不高，周期较长；而本发明中，明确了分化过程中的细胞的状态以及分化过程需要添加的信号通路激活或抑制剂，极大的提高了分化效率和缩短了分化周期；

2、移植rpe植片治疗和rpe细胞悬液治疗是目前主流的两种视网膜下腔移植的rpe状态。前者rpe植片准备周期长，植片材料的生物相容性以及临床移植的技术都是其有待解决的问题和难点，难以满足临床上普及治疗的趋势。成熟rpe细胞悬液移植的细胞活力问题等也是需要解决的问题。而本发明中，利用分化得到的幼稚rpe细胞悬液，直接注射移植到视网膜下腔，解决了rpe活力和移植效果问题。

附图说明

图1：高效诱导hpsc分化为rpe的培养方案流程图

图2：诱导分化hpsc过程中细胞的典型细胞形态。

图3：流式细胞技术检测分化的npc、rpc、rpe的效率。

图4：免疫荧光技术检测分化过程中细胞的特征性蛋白的表达。

图5a：分化得到的成熟rpe的形态和特征性蛋白表达鉴定。

图5b：分化得到的成熟rpe和幼稚rpe的吞噬pos能力鉴定。

图6a和6b：移植幼稚rpe细胞和成熟rpe细胞的rcs大鼠的视觉电生理代表性ferg波形图和b波统计图。

图6c和6d：移植幼稚rpe治疗rcs大鼠7周视网膜组织图和核层外核层统计。

图6e：免疫组化鉴定幼稚rpe移植后位置。

图6f：免疫组化鉴定幼稚rpe移植后rcs大鼠体内吞噬能力。

图6g：移植后幼稚rpe视网膜凋亡tunel检测。

图7a：qpcr检测幼稚rpe和成熟rpe的特征性蛋白的表达。

图7b：qpcr检测幼稚rpe和成熟rpe的胞外基质基因的表达。

图7c：幼稚rpe和成熟rpe的贴附生长能力检测。

图7d：幼稚rpe和成熟rpe增殖相关蛋白的表达检测。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

以下实施例中，hipsc和hesc均为本领域常用的生物材料，可从多种途径获得，本实施例使用hipsc和hesc来自中国科学院金颖教授课题组，成分培养基为dmem/f12培养基含1×n-2supplement，1×b-27supplement，1×memnon-essentialaminoacidssolution，0.1％β巯基乙醇，10mg/ml维生素c。培养环境是37℃、5％co2和95％空气。dmh1购买自sigma公司，使用浓度为2μm。sb431542购自selleck公司，使用浓度为2μm。shh购买自r&d公司，使用浓度为25ng/ml。igf1购买自peprotech公司，使用浓度为10ng/ml。egf购买自thermofisherscientific公司，使用浓度为20ng/ml。activina购买自peprotech公司，使用浓度为10ng/ml。chir99021购买自biovision公司，使用浓度为2nm/ml。反转录试剂盒是primescript^tmrtmastermix(购自takara公司)，pcr试剂盒是superrealpremixplus(sybrgreen)(购自天根公司)。所用引物由苏州金维智公司合成。

实施例1

成分培养基诱导人多能性干细胞分化为rpe细胞。

1、神经上皮诱导：hpsc传代至matrigel包被的培养皿后，等30分钟至1小时贴壁生长后，使用添加2μm/ml的sb431542和2μm/ml的dmh1的成分培养基培养，每天更换培养基。培养6天后，细胞长至融合。融合的神经前体细胞使用accutase酶消化传代，使用添加50ng/ml的shh、10ng/ml的igf1、20ng/mlegf的成分培养基培养，每天更换培养基。3-4天后细胞融合，为神经上皮样。

2、视神经上皮诱导：神经上皮形成后，使用添加50ng/ml的shh、10ng/ml的igf1、20ng/ml的egf、10μg/ml的activina和2μm/ml的chir99021的成分培养基培养。

3、幼稚rpe分化：视神经上皮诱导至分化第16-18天，使用0.25％胰酶消化5分钟，将细胞按1：3-5的比率传代至新的matrigel包被的培养皿。使用添加20ng/ml的egf成分培养基继续培养7-9天，每天更换培养基。

4、成熟rpe分化：幼稚rpe继续使用添加20ng/ml的成分培养基培养10-15天，每天更换培养基，细胞呈鹅卵石样，且褐色素加深。

本实施例具体实施流程如图1，hipsc细胞、神经前体细胞、神经上皮细胞、视神经上皮细胞以及幼稚rpe细胞形态如图2。

实施例2

诱导hpsc分化为rpe过程中分化效率检测

1、细胞固定：将细胞培养皿中的细胞用accutase酶消化后，使用2mlpbs轻轻吹打，转移至15ml离心管，1500rpm离心3分钟；离心后去上清，加1ml4％多聚甲醛重悬，固定5分钟。

2、特异性抗体标记：固定的细胞使用0.1％tritonx-100透膜10分钟,1500rpm离心3分钟；pbs漂洗5分钟1次；继续1500rpm离心3分钟，加入3％bsa轻轻吹打重悬，室温孵育1小时；离心1500rpm，3分钟，加入用3％bsa稀释的一抗抗体，室温孵育1小时，阴性对照加入等抗体浓度的igg；1500rpm离心3分钟，加入1mlpbs漂洗3次，每次5分钟；加入用3％bsa稀释的荧光二抗，室温孵育1小时，1500rpm离心3分钟，再用pbs重悬漂洗3次，每次5分钟；最后使用500μl重悬，转入流式细胞管。

3、上机测试和数据分析：使用bdfacsverse流式细胞仪检测细胞分布，先测试阴性对照组细胞，划定电压和门，继续上机实验组细胞；数据使用flowjov10软件分析，先使用fsc和ssc圈定单细胞门，排除细胞碎片和多聚体细胞；再以阴性对照组2％阳性为门，圈定的门复制到实验组，计算阳性细胞分布比例并作图。

实验结果显示如图3，在第6天，使用sb431542和dmh1可以诱导hipsc分化为pax6阳性的神经前体细胞，效率为99％，而其他rpe相关的标志蛋白没有表达。神经上皮前体在第9天使用视神经上皮分化培养方案后，在第12天，79％的细胞表达视神经上皮标志蛋白mitf；pax6阳性仍为99％以上；在第15天，99％以上的细胞表达mitf；在第18天，99％以上的细胞表达mitf和rpe色素代谢相关的蛋白rlbp1；在第25天，表达rpe另一标志蛋白best1。本实施例中，关键节点分化效率都达到了99％以上的分化效率。

实施例3

诱导过程中神经上皮、视神经上皮和幼稚rpe的鉴定

1、细胞样本收集:在分化第0天和第6天，将分化的细胞传代至细胞爬片上,按实施例1步骤诱导分化，在第3天、6天、9天、15天、18天收集细胞，使用pbs漂洗2次去除死细胞，加入4％多聚甲醛固定5分钟。

2、透膜和封闭：固定后的细胞使用0.1％tritonx-100透膜5分钟，pbs漂洗2次，每次5分钟；加入3％牛血清白蛋白室温封闭1小时；

3、抗体染色：吸去封闭液，加入用3％牛血清白蛋白稀释的一抗抗体，4℃孵育过夜；吸去一抗，pbs漂洗3次，每次5分钟；加入用3％bsa稀释的荧光二抗，室温避光孵育1小时；吸去二抗，pbs漂洗3次，每次5分钟；

4、核染色和封片：加入0.2ug/ml的dapi，室温孵育5分钟；pbs漂洗3次，每次5分钟。最后，使用防猝灭封片剂封在载玻片上，避光保存。

5、照片采集：使用nikona1激光共聚焦显微镜采集图像。

实验结果如图4所示，在分化第3天部分细胞表达pax6、otx2和sox1；在分化第6天，所有细胞表达神经前体细胞标志蛋白pax6、otx2和sox1；在分化第9天即神经上皮，所有细胞表达pax6、otx2和sox1；在分化第18天即视网膜神经上皮，所有细胞表达眼发育初始阶段表达的mitf特异性蛋白和增殖性蛋白pcna。这一结果表明，本专利各阶段细胞定性明确。

实施例4

hpsc来源的rpe细胞的特征鉴定

1、细胞处理：将hpsc来源的rpe细胞接种于预置在培养皿中的细胞爬片上，待细胞长至鹅卵石样并带有明显褐色素时，取出细胞爬片；

2、固定：用4％多聚甲醛固定10分钟，pbs洗3次，每次5分钟；

3、透膜：0.1％tritonx-100透膜10分钟，pbs洗3次，每次5分钟；

4、封闭：3％牛血清白蛋白室温封闭1小时；

5、一抗：加3％牛血清白蛋白稀释的一抗，置于湿盒内防止干燥，4℃孵育过夜；

6、二抗：pbs洗3次，每次5分钟；加3％牛血清白蛋白稀释的荧光标记的二抗，置于湿盒内，避光室温孵育1小时，pbs洗3次，每次5分钟；

7、染核：用0.2μg/mldapi染细胞核3分钟，pbs洗3次，每次5分钟；

8、封片：用荧光封片剂封片。

9、拍照：用nikona1激光共聚焦显微镜采集图像。

实验结果如图5a中的免疫荧光图所示，成熟的hpsc来源的rpe细胞呈褐色鹅卵石样形态，细胞间连接紧密。同时，细胞表达rpe特异性蛋白rpe65和紧密连接蛋白zo1。此外，细胞表达integrinαvβ1和integrinαvβ5蛋白，并且两种蛋白分布在上下两级，表明分化得到的rpe具有正常的细胞极性。

实施例5

hipsc来源的rpe的pos吞噬功能检测

1、细胞准备：将细胞接种在细胞爬片上，待细胞形成鹅卵石样的成熟结构时(如实施例1中所述)，用于吞噬检测；

2、猪光感受器外节(photoreceptoroutersegments，pos)制备：猪眼来自于上海五丰食品有限公司当天处死的生猪，取出后保存在冰上；在超净工作台中，使用含10％青霉素和链霉素pbs冲洗猪眼3次，将猪眼解剖并取出视网膜，视网膜通过剪碎和蔗糖梯度离心分离得到猪pos，存放于-80℃冰箱备用。

3、生物素标记猪pos：1ml猪pos加入1mg生物素室温孵育1小时进行生物素标记，使用kcl缓冲液洗涤两次，5000rpm离心5分钟，弃上清并使用rpe培养基重悬。

4、hpsc来源的rpe细胞吞噬：将细胞爬片上成熟的hipsc来源的rpe，加入含生物标记的pos的培养基，继续在细胞培养箱培养4小时。

5、rpe吞噬后免疫荧光染色：培养后的细胞使用pbs漂洗3次，洗去未被吞噬的pos；使用4％多聚甲醛固定5分钟；使用0.1％tritonx-100透膜5分钟，pbs漂洗5分钟；使用3％牛血清白蛋白室温封闭1小时；加入抗zo1抗体和抗生物素抗体，4℃孵育过夜；pbs漂洗3次，每次5分钟；加入荧光二抗，室温孵育1小时；pbs漂洗3次，每次5分钟；dapi染核，室温5分钟；pbs漂洗2次，使用防猝灭封片剂将细胞爬片转至载玻片上；

6、拍照：图像使用nikona1共聚焦显微镜逐层扫描记录。

实验结果如图5b所示，hpsc来源的成熟的rpe具有较强的吞噬猪pos的能力，而幼稚的rpe极少数细胞能吞噬猪pos。这表明，实施例1获得hipsc来源的rpe具有吞噬pos的生理功能，与体内正常的rpe细胞一致。

实施例6

视网膜下腔移植幼稚rpe和成熟rpe细胞悬液

1、rcs大鼠准备：rcs大鼠为本领域研究常用的成熟大鼠模型，可从多种途径购买获得，本实施例使用的rcs大鼠由中国科学院健康科学研究所金颖教授惠赠，饲养和繁殖在同济大学动物中心。选取出生后3周rcs大鼠，随机分为三组，pbs对照组，幼稚rpe细胞悬液治疗组，成熟rpe细胞悬液治疗组。

2、细胞准备：hpsc细胞维持培养在成分培养基上，经上述诱导分化方法分化得到分化第25天的幼稚rpe细胞和分化第40天成熟rpe细胞。

3、注射用细胞悬液制备：分化的幼稚rpe细胞和成熟的rpe细胞使用0.25％胰酶消化5分钟，使用pbs温柔吹打后转入15ml离心管离心；使用pbs重悬并计数；按照已经计算好的细胞量和注射量，使得细胞的终浓度为1×10⁵个/μl。

4、视网膜下腔注射：注射前rcs大鼠腹腔注射2％戊巴比妥钠(1ml/400g体重)进行麻醉，肌肉注射1×速眠新(0.1ml/200g)进行肌肉松弛，然后给予0.5％托吡卡胺散瞳和0.4％盐酸丁卡因表面麻醉。在体视显微镜下，先用30g针头自角膜缘后2mm处进针扎一小孔，然后再用显微注射器和33g针头的由该孔向视网膜下腔注入5μl制备的细胞悬液或pbs，见到视网膜出现水泡样隆起为注射成功。

实施例7

rcs大鼠视网膜电图erg采集

1.采集前准备：aps全自动视觉电生理检查仪器(aps-2000)购于重庆康华科技有限公司；rcs大鼠在采集前12小时移入暗室，进行暗适应，饮食正常。

2.大鼠的准备：rcs大鼠腹腔注射2％戊巴比妥钠(1ml/500g体重)进行麻醉，肌肉注射速眠新(0.1ml/200g)进行肌肉松弛，然后给予0.5％托吡卡胺散瞳和0.4％盐酸丁卡因局部麻醉。电极连接：地线接大鼠近尾部皮下；负极接大鼠头顶部皮下；正极接双眼角膜上，注意正极不要触到眼睑和巩膜。

3.数据采集和标定：打开仪器配套软件，选择“ferg”检查，选定左右眼通道，刺激次数为2次，刺激频率为0.05hz；依次点击刺激闪光强度为(1)―0.0006325(cd*s/m)、(5)―0.006325(cd*s/m)、(9)―0.06325(cd*s/m)。点“示波”，待波的基线平稳时，点击“采集”，采集完毕，点击“保存”。更换闪光刺激强度，重新采集，每次强度至少间隔2分钟，依次类推。ferg的b波数值标定，双击曲线，曲线变为白色，点击“标定”。标定完a波后，按空格键，标定b波。

数据如图6a所示，6a为ferg的典型的波形图，6b为b波波幅的统计图，由图可知，经视网膜下腔移植幼稚rpe细胞悬液治疗组与pbs对照组相比，erg波幅明显上升；同时与视网膜下腔移植成熟rpe细胞悬液组相比，幼稚rpe治疗组erg波幅明显上升；而成熟rpe治疗组与pbs对照组并没有明显差异，说明视网膜下腔移植幼稚rpe悬液能够有效的治疗rcs大鼠的视网膜退行性疾病造成的视觉功能损伤。

实施例8

眼球冰冻切片的制备

1.眼球准备：rcs大鼠在移植后第4周和第8周颈椎脱臼处死后，小心取下眼球，注意保留部分视神经；置于4％多聚甲醛固定30分钟；

2.眼球解剖：在解剖显微镜下沿角巩膜缘上缘解剖眼球，小心去除角膜，虹膜和晶状体，保留完整的视杯，操作中避免造成视网膜脱离；

3.脱水和包埋：依次用10％、20％、30％的蔗糖过夜脱水；用组织包埋液oct包埋4℃平衡过夜；将眼球的位置尽量垂直居中，以视神经水平为指针；立即冻存于-80℃冰箱。

4.冰冻切片：用leica冰切机按8μm的厚度进行连续切片，取过视神经乳头的切片。切片吹干后，存放在-20℃保存。

实施例9

视网膜冰冻切片免疫荧光

1、切片准备：取实施例9中所得的眼球冰冻切片样品进行免疫荧光染色检测；

2、固定：4％多聚甲醛固定5分钟，再用pbs漂洗3次，每次5分钟；

3、透膜：用0.1％triton-x100透膜15分钟，pbs漂洗3次，每次5分钟；

4、封闭：3％牛血清白蛋白室温封闭1小时；

5、一抗：加3％牛血清白蛋白稀释的相应一抗，置于湿盒内防止干燥，4℃孵育过夜，pbs漂洗3次，每次5分钟；

6、二抗：加3％牛血清白蛋白稀释的荧光素酶标记的抗体，置于湿盒内，避光室温孵育1小时，pbs漂洗3次，每次5分钟；

7、dapi染核和封片：用0.2μg/mldapi染细胞核5分钟，pbs洗2次，每次5分钟。用荧光封片剂封片；

8、拍照观察：在荧光显微镜下拍照观察。

如图6c、6d、6e和6f所示，为冰冻眼球切片免疫荧光图片，图6c分别为幼稚rpe治疗后第4周rcs大鼠视网膜核层情况，由图我们可以看出在幼稚rpe移植侧，视网膜的外核层有十分明显的保护，在未移植侧，视网膜外核层几乎完全消失。图6d为在第4周和第8周，视网膜核层厚度统计图，结果显示幼稚rpe可以一直保护视网膜。图6e为抗人属抗体cd147的染色，表明移植的hipsc来源的rpe一直在rcs大鼠视网膜下腔，并有色素产生。图6f为rhodopsin特异性染色的rcs大鼠光感受器外节与hipsc来源的rpe特异染色的dct共定位，表明移植的rpe可以吞噬rcs大鼠的光感受器外节，发挥生理功能。这进一步说明移植的幼稚rpe细胞悬液在移植部位形成了成熟的有功能的rpe，从而治疗了rcs大鼠由于自身rpe损伤造成的视网膜退行性疾病。

实施例10

视网膜冰冻切片视网膜细胞凋亡检测

1、切片准备：取实施例9中所得的眼球冰冻切片样品进行凋亡染色检测；

2、固定：4％多聚甲醛固定5分钟，再用pbs漂洗3次，每次5分钟；

3、透膜：用0.1％triton-x100透膜15分钟，pbs漂洗3次，每次5分钟；

4、封闭：3％牛血清白蛋白室温封闭1小时；

5、tunel试剂染色：tunel试剂盒购买自roche，反应液配置：enzymesolution与labelsolution按体积比1：9配制，每冰冻切片样本加100μl反应液，37℃避光反应1小时；pbs漂洗3次，每次5分钟；

6、dapi染核和封片：用0.2μg/mldapi染细胞核5分钟，pbs洗2次，每次5分钟。用防猝灭封片剂封片；

7、拍照观察：在荧光显微镜下拍照观察。

实验结果如图6g所示，移植幼稚rpe后第4周视网膜外核层几乎无tunel阳性染色，而未移植视网膜外核层几乎都小时，仅存的外核层细胞都为tunel阳性染色表现为凋亡，这一结果表明，移植幼稚rpe可以保护视网膜外核层免于凋亡，从而保护rcs大鼠的视网膜的功能。

实施例11

幼稚rpe与成熟rpe细胞特征基因表达和胞外基质基因表达检测

将幼稚rpe和成熟rpe细胞分别用1mltrizol收集在1.5ml管中，进行抽提总rna。经过逆转录和实时定量pcr分析，采用半定量的方法计算。

主要步骤如下：

1、向trizol收集的样品中，加入五分之一体积(200μl)的氯仿，振荡混匀后，以12000rpm的转速4℃离心15分钟；

2、离心后，将上清转移到新的离心管中，注意不要取到中间的蛋白层，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀；

3、12000rpm的转速4℃离心10分钟，弃去上清，将沉淀用75％的乙醇洗2次；

4、将沉淀室温干燥后，用适量的去离子水溶解；

5、nanodrop定量，并计算反转录所需的体积；

6、rna反转录：

(1)反转录体系：1000ng的rna，加4μl的takara的5×primescript^tmrtmastermix，再加灭菌去离子水补到20μl；

(2)反转录程序：37℃反应15分钟，85℃反应15秒，然后可于-20℃冰箱保存备用。

7、定量pcr

(1)将rna反转录后得到的cdna10倍稀释作为为模板，设计引物如表1。

表1qpcr中所用到的引物序列表

(2)利用天根公司的sybrgreen实时荧光定量pcr检测试剂盒，qpcr的体系为20μl，2μl的cdna模板，1μl的引物，10μl的2×pcrmix，7μl的灭菌去离子水，检测目的基因mrna的表达量。qpcr扩增条件如下：94℃变性10分钟，进入循环(95℃5秒，60℃60秒)，一共40个循环，收集ct值。

(3)数据分析，采用2^-△△ct法进行处理，以gapdh作为内参基因。

实验结果如图7a所示，成熟rpe的标志蛋白表达量均高于幼稚rpe，但是两类rpe细胞均能表达rpe特异性蛋白；胞外基质表达量如图7b，幼稚rpe的多数胞外基质蛋白mrna水平的表达量高于成熟rpe。这一结果表明，幼稚rpe已经表达rpe的特异性基因，同时高表达胞外基质基因，以及合成bruch膜的所有基因，促进rpe的黏附和功能形成，具有重建bruch膜的能力。

实施例12

幼稚rpe与成熟rpe贴壁能力检测

1、细胞传代：hpsc来源的幼稚rpe和成熟rpe使用0.25％胰酶消化后，1500rpm离心后，重悬计数，以相同的密度传代至新的无matrigel包被的培养皿中培养；

2、图像采集：培养3天后，使用倒置显微镜观察并拍照采集图片。

实验结果如图7c所示，幼稚rpe传代后，多数细胞均已贴壁生长，而成熟rpe只有少数细胞贴壁，生长缓慢。这一结果表明，与成熟rpe相比，幼稚rpe有很好的黏附能力和增殖能力。

实施例13

幼稚rpe与成熟rpe增殖性蛋白表达鉴定

1、蛋白样本制备：实施例1中hpsc来源的幼稚rpe和成熟rpe制备后，加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的ripa裂解液，在冰上裂解5分钟后，使用刮刀收集到1.5mlep管中，冰上继续裂解20分钟；10000rpm离心15分钟，将含总蛋白的上清收集至新的ep管中，备用；

2、蛋白浓度的测定：蛋白定量采用thermoscientificpiercebca定量试剂盒，具体方法如下：bca工作液配制：试剂a和试剂b按50:1的体积比充分混匀，现配现用；将标准品按0μl、1μl、2μl、4μl、8μl、16μl的体积加到酶标孔中，每孔加入200μl的bca工作液，制作标准曲线；待测样品每孔加入2μl，再加入200μl的bca工作液，37℃孵育30分钟；用bio-rad多功能酶标仪测定560nm处的吸光度值。

3、蛋白样品的准备：根据准备上样的蛋白量和蛋白浓度，加入5×上样缓冲液，混合后于100℃加热10分钟，使其充分的变性，4℃，12000rpm，离心2分钟，除去沉淀，-80℃贮存备用。

4、sds-page电泳：10％分离胶(10ml)的制备：30％聚丙烯酰胺3.3ml、ddh2o2.7ml、1mtris-hcl(ph8.8)3.8ml、10％sds0.1ml、10％过硫酸铵0.1ml、temed0.004ml，加完后充分混匀，迅速灌胶。5％浓缩胶(4ml)的制备：30％聚丙烯酰胺0.67ml、ddh2o2.7ml、1mtris-hcl(ph6.8)0.5ml、10％sds0.04ml、10％过硫酸铵0.04ml、temed0.004ml，加完后充分混匀，迅速灌胶。将浓缩胶溶液缓慢加入分离胶的上层，然后小心插入梳子，注意不要产生气泡，待凝胶之后准备电泳。将准备好的蛋白样品和蛋白标记分子加入到加样孔中，使用bio-rad电泳仪，电泳条件为：80v电压，30分钟，换120v电压至溴酚蓝刚好跑出分离胶底部停止。

5、转膜：sds-page凝胶电泳结束以后，剪取与凝胶大小相似的pvdf膜放入无水甲醇中浸泡2分钟；采用bio-rad的转膜系统，以夹三明治的方式，从黑面到白面的顺序依次为：黑面(负极)-海绵垫-滤纸-凝胶-pvdf膜-滤纸-海绵-白面(正极)，注意滤纸、凝胶和pvdf膜要对齐，彻底清除内部气泡，然后放入装满转膜液的转膜仪中。转膜条件为300毫安，3小时；转膜槽置于冰浴中。转膜结束后以参考蛋白marker转上pvdf膜作为转膜成功的标志。

6、免疫杂交反应：将膜浸入5％的bsa封闭液，室温封闭1小时。加入用tbst稀释的一抗，4度孵育过夜；1×tbst洗膜3次，每次10分钟。加入tbst稀释的hrp标记的二抗，室温孵育1小时。1×tbst洗膜3次，每次10分钟。ecl化学发光采集结果，以actin作为对照内参。

实验结果如图7d所示，以hipsc为阳性对照，由图可知幼稚rpe的增殖性蛋白pcna和mcm2表达量明显高于成熟rpe。成熟rpe未见mcm2表达，而pcna仅有极低的表达。这一结果表明，幼稚rpe表达较多的增殖相关蛋白pcna和mcm2，促进了幼稚rpe的存活和增殖。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。