本发明属于干细胞分化技术领域，具体涉及一种提高外周血多潜能细胞向软骨细胞分化的无血清培养基。
背景技术：
采用软骨细胞修复损伤的软骨组织是现代医学用于替代传统治疗方法的新技术。软骨细胞的来源在研究中不断的扩大。目前有研究采用外周血多潜能细胞，外周血多潜能细胞具有自我更新能力和多项分化的潜能，可在体外分化为多种细胞，包括软骨细胞，但是目前的培养基在外周血多潜能细胞向软骨细胞分化培养中，效率并不高，因此，需要一种专门用于外周血多潜能细胞诱导向软骨细胞分化的培养基。
技术实现要素：
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种提高外周血多潜能细胞向软骨细胞分化的无血清培养基。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
具体的技术方案为：
一种提高外周血多潜能细胞向软骨细胞分化的无血清培养基，包括基础培养基，基础培养基为高糖dmem培养液，所述的基础培养基中，还添加以下物质：
10-20ng/ml的转化生长因子β1；
2-12ng/ml的转化生长因子β3；
60-80ng/ml的胰岛素样生长因子；
0.1-1.0mg/l的黄芪多糖；
1-5mg/l的紫苏籽提取物；
0.1-0.4ng/ml的腔昆布提取物；
2-10mg/l的人参皂苷rg1；
1-10mol/l的地塞米松；
37-38mg/ml的抗坏血酸；
0.8-1.2μmol/ml的丙酮酸钠；
6-6.5μg/ml的转铁蛋白。
作为优选，还包括以下物质：
5-10mg/ml的硒酸；
5-10mg/ml的亚油酸；
1-5mg/ml的牛血清白蛋白；
10-30mg/ml的脯氨酸。
其中，所述的黄芪多糖，由以下方法制备所得：黄芪粉碎得到黄芪粉末，加黄芪粉末3-5倍重量的水，煮沸后保温40-60min，过滤，得滤液和初滤渣，初滤渣再加2-4倍重量的水，煮沸后保温30-50min，过滤，得到二次滤液和二次滤渣，向二次滤渣中加1-2倍重量的水，煮沸后保温20-30min，过滤，得三次滤液和滤渣，合并三次所得的滤液，旋蒸浓缩合并的滤液，浓缩到原体积的1/3-1/4，浓缩液中加入无水乙醇，并搅拌，静置后抽滤得沉淀物，沉淀物再用无水乙醇搅拌，并静置沉淀，沉淀物烘干，得黄芪多糖。
其中，所述的紫苏籽提取物，通过以下方法制备得到：
(1)将紫苏籽粉碎，加入紫苏籽重量35％的水和0.05％的酵母，密封发酵10-12天，发酵物真空干燥到含水量不大于7％；
(2)采用无水乙醇作为萃取剂，对步骤(1)烘干的发酵物进行亚临界萃取，萃取条件为：温度为60-65℃、压力为3.8-4.0mpa、时间为1-1.5h，得到萃取物；
(3)将萃取物减压浓缩，至原体积的1/3-1/4，所得浓缩液以0.6-0.8v/h的流速过活性炭柱，然后用70％乙醇溶液洗脱，最后再浓缩干燥，得紫苏籽提取物。
其中，腔昆布提取物的制备的方法，包括以下步骤：
(1)将干燥的腔昆布初剪碎，再进行冷冻，冷冻温度为-40至-20℃，冷冻介质选自液氮、干冰和低温冰箱中的一种；然后再粉碎至粉末状；
(2)在腔昆布粉末中加入细胞裂解液，并在30-60℃条件下浸泡；细胞裂解液选自曲拉通、乙二胺四乙酸、司盘、吐温和十二烷基磺酸钠中的一种；细胞裂解液的浓度为0.1-10％；
(3)浸泡所得的液体，依次经过多次抽滤和洗涤，合并滤液和洗涤液，加入溶剂提取，溶剂浓度为10-40％，静置、离心，所得沉淀为腔昆布提取物粗品；其中所述溶剂为乙醇、丙酮、甲醇、dmf、乙醚和异丙醇中的一种。腔昆布提取物粗品用95％乙醇、丙酮洗涤，冻干。
其中，步骤(1)冷冻的方法如下：从常温开始在10-15分钟内降温到0摄氏度保持15-20分钟，再于10-15分钟内迅速降温到-20摄氏度保持30-60分钟，然后在-20摄氏度2-3小时，然后在10-15分钟内降温到-40摄氏度，保存超过5小时，进行冷冻干燥，这是本发明的一个发明点经过了这个方法，可以最大限度保持营养物质，对细胞分化培养具有非常好的促进作用，这也是本发明的发明点之一。
本发明提供的一种提高外周血多潜能细胞向软骨细胞分化的无血清培养基，具有以下有益效果：
本发明提供的细胞培养液中包含多种生长因子和多种提取物，各组分配伍合理，协同促进了诱导外周血多潜能细胞向软骨细胞分化，提高了外周血多潜能细胞向软骨细胞分化的数量并缩短了分化的时间。
具体实施方式
结合实施例说明本发明的具体技术方案。
实施例1
一种提高外周血多潜能细胞向软骨细胞分化的无血清培养基，包括基础培养基，基础培养基为高糖dmem培养液，所述的基础培养基中，还添加以下物质：
10ng/ml的转化生长因子β1；
5ng/ml的转化生长因子β3；
70ng/ml的胰岛素样生长因子；
0.5mg/l的黄芪多糖；
5mg/l的紫苏籽提取物；
0.1ng/ml的腔昆布提取物；
8mg/l的人参皂苷rg1；
6mol/l的地塞米松；
37mg/ml的抗坏血酸；
0.8μmol/ml的丙酮酸钠；
6.5μg/ml的转铁蛋白。
其中，所述的黄芪多糖，由以下方法制备所得：黄芪粉碎得到黄芪粉末，加黄芪粉末4倍重量的水，煮沸后保温40min，过滤，得滤液和初滤渣，初滤渣再加3倍重量的水，煮沸后保温30min，过滤，得到二次滤液和二次滤渣，向二次滤渣中加1-2倍重量的水，煮沸后保温20min，过滤，得三次滤液和滤渣，合并三次所得的滤液，旋蒸浓缩合并的滤液，浓缩到原体积的1/3，浓缩液中加入无水乙醇，并搅拌，静置后抽滤得沉淀物，沉淀物再用无水乙醇搅拌，并静置沉淀，沉淀物烘干，得黄芪多糖。
其中，所述的紫苏籽提取物，通过以下方法制备得到：
(1)将紫苏籽粉碎，加入紫苏籽重量35％的水和0.05％的酵母，密封发酵10-12天，发酵物真空干燥到含水量不大于7％；
(2)采用无水乙醇作为萃取剂，对步骤(1)烘干的发酵物进行亚临界萃取，萃取条件为：温度为60-65℃、压力为3.8-4.0mpa、时间为1.5h，得到萃取物；
(3)将萃取物减压浓缩，至原体积的1/3-1/4，所得浓缩液以0.8v/h的流速过活性炭柱，然后用70％乙醇溶液洗脱，最后再浓缩干燥，得紫苏籽提取物。
其中，腔昆布提取物的制备的方法，包括以下步骤：
(1)将干燥的腔昆布初剪碎，再进行冷冻，冷冻温度为-40℃，冷冻介质选自液氮；然后再粉碎至粉末状；
(2)在腔昆布粉末中加入细胞裂解液，并在30-60℃条件下浸泡；细胞裂解液选自曲拉通；细胞裂解液的浓度为5％；
(3)浸泡所得的液体，依次经过多次抽滤和洗涤，合并滤液和洗涤液，加入溶剂提取，溶剂浓度为20％，静置、离心，所得沉淀为腔昆布提取物粗品；其中所述溶剂为乙醇。腔昆布提取物粗品用95％乙醇、丙酮洗涤，冻干。
实施例2
一种提高外周血多潜能细胞向软骨细胞分化的无血清培养基，包括基础培养基，基础培养基为高糖dmem培养液，所述的基础培养基中，还添加以下物质：
17ng/ml的转化生长因子β1；
9ng/ml的转化生长因子β3；
68ng/ml的胰岛素样生长因子；
0.7mg/l的黄芪多糖；
3mg/l的紫苏籽提取物；
0.2ng/ml的腔昆布提取物；
6mg/l的人参皂苷rg1；
8mol/l的地塞米松；
38mg/ml的抗坏血酸；
1.2μmol/ml的丙酮酸钠；
6.5μg/ml的转铁蛋白；
6mg/ml的硒酸；
5mg/ml的亚油酸；
1mg/ml的牛血清白蛋白；
20mg/ml的脯氨酸。
其中，所述的黄芪多糖，由以下方法制备所得：黄芪粉碎得到黄芪粉末，加黄芪粉末5倍重量的水，煮沸后保温40min，过滤，得滤液和初滤渣，初滤渣再加2倍重量的水，煮沸后保温40min，过滤，得到二次滤液和二次滤渣，向二次滤渣中加1倍重量的水，煮沸后保温30min，过滤，得三次滤液和滤渣，合并三次所得的滤液，旋蒸浓缩合并的滤液，浓缩到原体积的1/4，浓缩液中加入无水乙醇，并搅拌，静置后抽滤得沉淀物，沉淀物再用无水乙醇搅拌，并静置沉淀，沉淀物烘干，得黄芪多糖。
其中，所述的紫苏籽提取物，通过以下方法制备得到：
(1)将紫苏籽粉碎，加入紫苏籽重量35％的水和0.05％的酵母，密封发酵12天，发酵物真空干燥到含水量不大于7％；
(2)采用无水乙醇作为萃取剂，对步骤(1)烘干的发酵物进行亚临界萃取，萃取条件为：温度为60-65℃、压力为3.8-4.0mpa、时间为1h，得到萃取物；
(3)将萃取物减压浓缩，至原体积的1/4，所得浓缩液以0.6-0.8v/h的流速过活性炭柱，然后用70％乙醇溶液洗脱，最后再浓缩干燥，得紫苏籽提取物。
其中，腔昆布提取物的制备的方法，包括以下步骤：
(1)将干燥的腔昆布初剪碎，再进行冷冻，冷冻温度为-20℃，冷冻介质干冰；然后再粉碎至粉末状；
(2)在腔昆布粉末中加入细胞裂解液，并在30-60℃条件下浸泡；细胞裂解液为乙二胺四乙酸；细胞裂解液的浓度为3％；
(3)浸泡所得的液体，依次经过多次抽滤和洗涤，合并滤液和洗涤液，加入溶剂提取，溶剂浓度为25％，静置、离心，所得沉淀为腔昆布提取物粗品；其中所述溶剂为丙酮。腔昆布提取物粗品用95％乙醇、丙酮洗涤，冻干。
实施例3
一种提高外周血多潜能细胞向软骨细胞分化的无血清培养基，包括基础培养基，基础培养基为高糖dmem培养液，所述的基础培养基中，还添加以下物质：
10ng/ml的转化生长因子β1；
10ng/ml的转化生长因子β3；
60ng/ml的胰岛素样生长因子；
0.8mg/l的黄芪多糖；
5mg/l的紫苏籽提取物；
0.4ng/ml的腔昆布提取物；
10mg/l的人参皂苷rg1；
1mol/l的地塞米松；
38mg/ml的抗坏血酸；
0.8μmol/ml的丙酮酸钠；
6.5μg/ml的转铁蛋白；
10mg/ml的硒酸；
5mg/ml的亚油酸；
5mg/ml的牛血清白蛋白；
10mg/ml的脯氨酸。
其中，所述的黄芪多糖，由以下方法制备所得：黄芪粉碎得到黄芪粉末，加黄芪粉末3倍重量的水，煮沸后保温60min，过滤，得滤液和初滤渣，初滤渣再加2倍重量的水，煮沸后保温30min，过滤，得到二次滤液和二次滤渣，向二次滤渣中加1倍重量的水，煮沸后保温30min，过滤，得三次滤液和滤渣，合并三次所得的滤液，旋蒸浓缩合并的滤液，浓缩到原体积的1/4，浓缩液中加入无水乙醇，并搅拌，静置后抽滤得沉淀物，沉淀物再用无水乙醇搅拌，并静置沉淀，沉淀物烘干，得黄芪多糖。
其中，所述的紫苏籽提取物，通过以下方法制备得到：
(1)将紫苏籽粉碎，加入紫苏籽重量35％的水和0.05％的酵母，密封发酵10-12天，发酵物真空干燥到含水量不大于7％；
(2)采用无水乙醇作为萃取剂，对步骤(1)烘干的发酵物进行亚临界萃取，萃取条件为：温度为60-65℃、压力为3.8-4.0mpa、时间为1-1.5h，得到萃取物；
(3)将萃取物减压浓缩，至原体积的1/4，所得浓缩液以0.6-0.8v/h的流速过活性炭柱，然后用70％乙醇溶液洗脱，最后再浓缩干燥，得紫苏籽提取物。
其中，腔昆布提取物的制备的方法，包括以下步骤：
(1)将干燥的腔昆布初剪碎，再进行冷冻，冷冻温度为-40，冷冻介质选自液氮；然后再粉碎至粉末状；
(2)在腔昆布粉末中加入细胞裂解液，并在30-60℃条件下浸泡；细胞裂解液选自吐；细胞裂解液的浓度为4％；
(3)浸泡所得的液体，依次经过多次抽滤和洗涤，合并滤液和洗涤液，加入溶剂提取，溶剂浓度为40％，静置、离心，所得沉淀为腔昆布提取物粗品；其中所述溶剂为异丙醇中的一种。腔昆布提取物粗品用95％乙醇、丙酮洗涤，冻干。
取外周血多潜能细胞接种于15ml离心管中，于1000r/min离心5min，使细胞成团聚集在离心管底部，管盖拧松一半，放入培养箱中培养，培养条件为37℃、5％的co2。培养24h后除去原培养液，添加1ml以上实施例制备的培养液，使细胞团漂浮，管盖拧松一半，放入培养箱中培养，培养条件为37℃、5％的co2。诱导分化培养18h后，对细胞进行石蜡切片、番红0-快绿染色及ii型胶原免疫组化等实验。由染色结果可知，细胞切片有着色，桃红色区域明显，说明细胞基质有粘多糖生成；ii型胶原免疫组化结果为：显示黄褐色区域，说明有ii型胶原合成。实施例2和实施例3效果好于实施例1。