人髌前脂肪垫干细胞的分离鉴定方法与流程

本发明涉及干细胞技术领域，具体而言，涉及人髌前脂肪垫干细胞的分离鉴定方法。

背景技术：

间充质干细胞(mesenchymalstemcells)因具有强大的自我更新、多向分化及跨胚层发育的可塑性，在组织工程的构建及基因治疗方面具有巨大的发展潜力。

目前对髌前脂肪垫干细胞的研究好较少，对脂肪垫干细胞的分离、培养和鉴定方法还不够完善，因此脂肪垫干细胞不能作为细胞模型进行科学研究，所以需要尽快的发展脂肪垫干细胞的分离、培养和鉴定方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供人髌前脂肪垫干细胞的分离鉴定方法，提供一种稳定可靠的人髌前脂肪垫干细胞的分离鉴定方法，验证脂肪垫干细胞的可靠性。

为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：

人髌前脂肪垫干细胞的分离鉴定方法，分离鉴定方法包括以下步骤：

将人髌前脂肪垫组织用酶液消化、过滤和离心得到脂肪垫细胞；

将脂肪垫细胞接种于培养皿进行培养，脂肪垫细胞覆盖培养皿达到76％-82％时，用酶消化并计数，得到酶消化细胞；

将酶消化细胞接种于培养基，培养并计数，得到脂肪垫干细胞并流式进行表型鉴定和诱导培养鉴定分析。

与现有技术相比较，本发明的有益效果包括：本发明提供的人髌前脂肪垫干细胞的分离鉴定方法，通过酶处理得到脂肪垫细胞，表型鉴定后通过诱导培养，进行对细胞的干性的鉴定，得到人髌前脂肪垫干细胞，满足干细胞的相关特性，未来可作为细胞模型应用于多种不同实验。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实验例提供的脂肪垫干细胞显微结果示意图；

图2为本发明实验例提供的细胞生长曲线结果图；

图3为本发明实验例提供的流式表型分析图；

图4为本发明实验例提供的流式表型分析图；

图5为本发明实验例提供的流式表型分析图；

图6为本发明实验例提供的cd19和cd44标记的流式表型分析图；

图7为本发明实验例提供的cd73和cd90标记的流式表型分析图；

图8为本发明实验例提供的cd105和anti-hla-dr标记的流式表型分析图；

图9为本发明实验例提供的cd11b和cd45标记的流式表型分析图；

图10为本发明实验例提供的cd29和cd34标记的流式表型分析图；

图11为本发明实验例提供的cd71标记的流式表型分析图；

图12为本发明实验例提供的成骨分化显微结果示意图；

图13为本发明实验例提供的成脂分化显微结果示意图；

图14为本发明实验例提供的成软骨分化显微结果示意图；

图15为本发明实验例提供的细胞微尺度生长状况显微示意图；

图16为本发明实验例提供的成骨基因表达示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员应当理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的人髌前脂肪垫干细胞的分离鉴定方法进行具体说明。

干细胞按照来源不同，分为：骨髓来源干细胞；滑膜来源干细胞；脂肪来源干细胞；外周血来源干细胞；肌肉来源干细胞；脐带血来源干细胞；皮肤来源干细胞；骨膜来源干细胞；肌腱来源干细胞以及髌下脂肪垫来源的干细胞，不同来源干细胞具备各自的优缺点。

人髌前脂肪垫干细胞的分离鉴定方法，分离鉴定方法包括以下步骤：

将人髌前脂肪垫组织用酶液消化、过滤和离心得到脂肪垫细胞；

将脂肪垫细胞接种于培养皿进行培养，脂肪垫细胞覆盖培养皿达到76％-82％时，用酶消化并计数，得到酶消化细胞；

将酶消化细胞接种于培养基，培养并计数，得到脂肪垫干细胞并流式进行表型鉴定和诱导培养鉴定分析。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，酶液为0.1％的i型胶原酶液。

通过选用i型胶原酶液的处理，细胞间的结缔组织被酶液分解，就可以使得细胞游离出来，有利于进一步的对细胞的处理，而且游离出来的细胞具有更大的与培养基接触的比面积，更容易进行增殖生长，获得更多的细胞。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，过滤选用80-140目筛进行。

通过过滤，能将未被消化的大块的髌下脂肪垫样品过滤掉，有利于实验的进行。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，离心的转速为1300rpm，时间为6min。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，脂肪垫细胞覆盖培养皿达到76％-82％前，包括更换培养基，在接种脂肪垫细胞后22-27h更换培养基，然后每三天更换一次培养基。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，酶为胰酶。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，酶消化细胞的接种密度为3×10³-7×10³个/接种孔。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，流式表型鉴定包括将脂肪垫干细胞稀释分装于添加有表面分子标记的流式管，然后加入荧光抗体混合，避光孵育，加入pbs缓冲液混合后离心取上清，重新加入pbs缓冲液重悬并流式分析。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，流式表型鉴定包括将脂肪垫干细胞稀释分装于添加有表面分子标记的流式管，然后加入荧光抗体混合，避光孵育，加入pbs缓冲液混合后离心取上清，重新加入pbs缓冲液重悬并流式分析。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，表面分子标记cd11b-pe-cy5、cd19-fitc、cd29-apc、cd34-apc、cd44-fitc、cd45-pe-cy5、cd71-apc、cd73-pe、cd90-pe、cd105-pe和hla-dr-pe。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，诱导培养鉴定分析包括成骨诱导及茜素红染色分析、成脂诱导及油红染色分析、成软骨诱导及阿利辛蓝染色分析以及成骨诱导基因的表达分析。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供人髌前脂肪垫干细胞的分离鉴定方法，包括以下步骤：

1.1取人髌下脂肪垫组织用0.1％的i型胶原酶消化；

1.2用80目的过滤筛过滤后以1300rpm的转速离心5min，得到脂肪垫细胞；

1.3脂肪垫细胞接种于培养皿中，并在37℃恒温、5％的co2、95％湿度的细胞培养箱中培养；

1.4放入培养箱后24h更换培养基，然后每镉3天更换培养基；

1.5当脂肪垫细胞覆盖培养皿76％时；用胰酶进行消化得到酶消化细胞并计数；

1.6将酶消化细胞以3×10³个/接种孔的密度接种在24孔培养板中，且每孔添加0.5ml培养液，于37℃恒温、5％的co2、95％湿度的细胞培养箱中培养；

1.7培养24h后开始计数，每天取3个复孔分别消化并计数；

1.8未消化的细胞每3天全量换液一次，连续计数7天，制作生长曲线。

1.9得到脂肪垫干细胞可以进行流式表型鉴定，并用诱导培养基进行诱导培养脂肪垫干细胞，然后并进行鉴定分析。

诱导培养鉴定分析包括成骨诱导及茜素红染色分析、成脂诱导及油红染色分析、成软骨诱导及阿利辛蓝染色分析以及成骨诱导基因的表达分析。

流式细胞分析的方法包括以下步骤：

2.1用胰蛋白酶消化脂肪垫干细胞，并用pbs缓冲液稀释到浓度为5×10⁵个/ml，用12个流式管分装，每个管添加1ml的细胞液；

2.2在12个流式管中的11个流式管一一对应分别对应添加cd11b-pe-cy5、cd19-fitc、cd29-apc、cd34-apc、cd44-fitc、cd45-pe-cy5、cd71-apc、cd73-pe、cd90-pe、cd105-pe和hla-dr-pe表面分子标记，加入荧光抗体，fitc标记每管加入抗体3μl，pe标记每管加入抗体2μl，pe-cy5标记每管加抗体2μl，apc标记每管加抗体2μl，漩涡混合；

2.3在4℃条件下孵育30min；

2.4每个管中加入1ml的pbs缓冲液，1000rpm离心5min，去上清；

2.5重新加入1ml的pbs缓冲液重悬，进行流式表型鉴定。

实施例2

本实施例提供人髌前脂肪垫干细胞的分离鉴定方法，包括以下步骤：

1.1取人髌下脂肪垫组织用0.1％的i型胶原酶消化；

1.2用140目的过滤筛过滤后以1300rpm的转速离心8min，得到脂肪垫细胞；

1.3脂肪垫细胞接种于培养皿中，并在37℃恒温、5％的co2、95％湿度的细胞培养箱中培养；

1.4放入培养箱后24h更换培养基，然后每隔3天更换培养基；

1.5当脂肪垫细胞覆盖培养皿82％时；用胰酶进行消化得到酶消化细胞并计数；

1.6将酶消化细胞以7×10³个/接种孔的密度接种在24孔培养板中，且每孔添加0.5ml培养液，于37℃恒温、5％的co2、95％湿度的细胞培养箱中培养；

1.7培养24h后开始计数，每天取3个复孔分别消化并计数；

1.8未消化的细胞每3天全量换液一次，连续计数7天，制作生长曲线。

1.9得到脂肪垫干细胞可以进行流式表型鉴定，并用诱导培养基进行诱导培养脂肪垫干细胞，然后进行鉴定分析。

诱导培养鉴定分析包括成骨诱导及茜素红染色分析、成脂诱导及油红染色分析、成软骨诱导及阿利辛蓝染色分析以及成骨诱导基因的表达分析。

流式细胞分析的方法包括以下步骤：

2.1用胰蛋白酶消化脂肪垫干细胞，并用pbs缓冲液稀释到浓度为5×10⁵个/ml，用12个流式管分装，每个管添加1ml的细胞液；

2.2在12个流式管中的11个流式管一一对应分别添加cd11b-pe-cy5、cd19-fitc、cd29-apc、cd34-apc、cd44-fitc、cd45-pe-cy5、cd71-apc、cd73-pe、cd90-pe、cd105-pe和hla-dr-pe表面分子标记，加入荧光抗体，fitc标记每管加入抗体3μl，pe标记每管加入抗体2μl，pe-cy5标记每管加抗体2μl，apc标记每管加抗体2μl，漩涡混合；

2.3在4℃条件下孵育30min；

2.4每个管中加入1ml的pbs缓冲液，1000rpm离心5min，去上清；

2.5重新加入1ml的pbs缓冲液重悬，进行流式表型鉴定。

实施例3

本实施例提供人髌前脂肪垫干细胞的分离鉴定方法，包括以下步骤：

1.1取人髌下脂肪垫组织用0.1％的i型胶原酶消化；

1.2用100目的过滤筛过滤后以1300rpm的转速离心6min，得到脂肪垫细胞；

1.3脂肪垫细胞接种于培养皿中，并在37℃恒温、5％的co2、95％湿度的细胞培养箱中培养；

1.4放入培养箱后24h更换培养基，然后每隔3天更换培养基；

1.5当脂肪垫细胞覆盖培养皿80％时；用胰酶进行消化得到酶消化细胞并计数；

1.6将酶消化细胞以5×10³个/接种孔的密度接种在24孔培养板中，且每孔添加0.5ml培养液，于37℃恒温、5％的co2、95％湿度的细胞培养箱中培养；

1.7培养24h后开始计数，每天取3个复孔分别消化并计数；

1.8未消化的细胞每3天全量换液一次，连续计数7天，制作生长曲线。

1.9得到脂肪垫干细胞可以进行流式表型鉴定，并用诱导培养基进行诱导培养脂肪垫干细胞，然后进行鉴定分析。

诱导培养鉴定分析包括成骨诱导及茜素红染色分析、成脂诱导及油红染色分析、成软骨诱导及阿利辛蓝染色分析以及成骨诱导基因的表达分析。

流式细胞分析的方法包括以下步骤：

2.1用胰蛋白酶消化脂肪垫干细胞，并用pbs缓冲液稀释到浓度为5×10⁵个/ml，用12个流式管分装，每个管添加1ml的细胞液；

2.2在12个流式管中的11个流式管一一对应分别对应添加cd11b-pe-cy5、cd19-fitc、cd29-apc、cd34-apc、cd44-fitc、cd45-pe-cy5、cd71-apc、cd73-pe、cd90-pe、cd105-pe和hla-dr-pe表面分子标记，加入荧光抗体，fitc标记每管加入抗体3μl，pe标记每管加入抗体2μl，pe-cy5标记每管加抗体2μl，apc标记每管加抗体2μl，漩涡混合；

2.3在4℃条件下孵育30min；

2.4每个管中加入1ml的pbs缓冲液，1000rpm离心5min，去上清；

2.5重新加入1ml的pbs缓冲液重悬，进行流式表型鉴定。

实验例

本实验例通过实施例3提供的人髌前脂肪垫干细胞的分离鉴定方法；分离得到脂肪垫干细胞，然后进行流式表型分析、骨诱导及茜素红染色分析、成脂诱导及油红染色分析、成软骨诱导及阿利辛蓝染色分析以及成骨诱导基因的表达分析。

实验得到脂肪垫干细胞进行显微观察和计数；并以培养的时间为横坐标，计数得到的细胞数为纵坐标，绘制脂肪垫干细胞的生长曲线图；然后继续进行流式表型分析。

流式表型分析的方法参考实施例3，显微观察的结果如图1所示，显微镜下可见脂肪垫干细胞多呈铺展多边形，与人骨髓来源干细胞外形并无明显差异，后续实验为达到统一性，脂肪垫干细胞均采用p5代。每个膝关节可至少得到1×10⁸的干细胞。

生长曲线如图2所示，发现其符合干细胞扩增的特点(快速增长期、平台期、稳定期)。

如图3-11所示，流式细胞仪检测p5代脂肪垫干细胞表面标记物发现：脂肪垫干细胞表达cd105、cd44、cd29、cd90、cd73以及hla-abc这些干性标志物，而cd45、cd34、cd14、hla-dr这些血管生成的标志物阴性。表明脂肪垫干细胞是与骨髓间充质干细胞同源的处于未分化状态的非定向干细胞。

成骨诱导及茜素红染色：将脂肪垫干细胞用胰酶消化并计数，用基础培养基重悬细胞至2.5×10⁴/ml，35mm培养皿接种2ml；按照说明书提前配置成骨诱导培养基；第二天吸去基础培养基，加入2ml诱导培养基；每隔5-6天更换新的诱导培养基，直至肉眼能够明显看到细胞表面出现白色的钙质沉淀；弃去诱导培养基，贴壁极慢加入pbs，轻轻洗去诱导培养基；贴壁极慢加入4％中性甲醛，固定30min；弃去固定液，贴壁极慢加入pbs，轻轻洗去固定液，加入茜素红染色10-30min；弃去染色液，贴壁极慢加入pbs，轻轻洗去染色液，可重复几次，待染色液清洗干净后，显微镜下观察拍照。

结果如图12所示，脂肪垫干细胞向成骨细胞诱导分化后第14天时，茜素红染色后可见着红色的典型钙化结节沉积；向脂肪细胞分化潜能鉴定。

脂肪垫干细胞成脂诱导及油红染色，基本操作同成骨诱导，后需添加成脂诱导培养基；每隔4-5天更换新的诱导培养基，一般7-10d后显微镜下即可观察到脂滴的出现。再延长诱导时间，直至出现较大的脂滴；弃去诱导培养基，贴壁极慢加入pbs，轻轻洗去诱导培养基；贴壁极慢加入10％中性甲醛，固定30min；弃去固定液，加入pbs，轻轻洗去固定液；油红o饱和溶液用pbs稀释，稀释比例为油红o：pbs＝3:2，稀释后的油红o工作液用定性滤纸过滤去除杂质；加入油红o工作液染色30min；弃去染色液，加入pbs，轻轻洗去染色液，可重复几次，待染色液清洗干净后，显微镜下观察拍照。

结果如图13所示，向脂肪细胞分化潜能鉴定，脂肪垫干细胞向脂肪细胞诱导过程中，可以看到细胞内小脂滴逐渐融合形成大的脂滴。成脂诱导分化第7-10d即可观察到脂滴的出现。再延长诱导时间，直至出现较大的脂滴。

脂肪垫干细胞成软骨诱导及阿利辛蓝染色，配置成软骨诱导培养基；胰酶消化；计数，用基础培养基重悬细胞至3×10⁵/ml，15ml透气离心管接种1ml，300rpm离心5min；轻轻吸去基础培养基，贴壁缓慢加入1ml诱导培养基；静置隔夜培养，第二天即可看到沉于离心管底部的细胞聚集成为小球。观察小球状态，如结构比较紧凑，可在第二天用移液管吸出小球至新的离心管，以减少未成球细胞对诱导培养基养分的消耗。如小球比较松散，可待第三或第四天进行；每隔3-4天更换新的诱导培养基，一般10-14d左右软骨小球即可进行切片；冰冻切片机，切10-12μm的薄片；4％中性甲醛，固定30min；pbs轻轻洗去固定液；阿利新蓝，避光染色30min；弃去染色液，pbs轻轻洗去染色液，显微镜下观察拍照。

结果如图14所示，在更换诱导培养基，静置隔夜培养，第二天即可看到沉于离心管底部的细胞聚集成为小球。每隔3-4天更换新的诱导培养基，一般10-14d左右软骨小球即可进行切片阿利新蓝，避光染色30min。

脂肪垫干细胞向脂肪细胞诱导过程中，可以看到细胞内小脂滴逐渐融合形成大的脂滴。成脂诱导分化第7-10d即可观察到脂滴的出现。再延长诱导时间，直至出现较大的脂滴。在油红o染色下，胞浆中的脂滴被染色成饱满的橘红色，并将细胞核挤向一边；脂肪垫干细胞向软骨细胞分化潜能鉴定，脂肪垫干细胞在更换诱导培养基，静置隔夜培养，第二天即可看到沉于离心管底部的细胞聚集成为小球。每隔3-4天更换新的诱导培养基，一般10-14d左右软骨小球即可进行切片阿利新蓝，避光染色30min。

脂肪垫干细胞接种于hacg微尺度支架、明胶微尺度支架7天、14天，提取细胞rna，quantitativereal-timepcr检测成骨诱导基因(alp、col1、runx2)的表达。用toyobo公司sybrgreenmastermix试剂盒，在bioradcfx96实时定量pcr仪上运行quantitativereal-timepcr检测成骨诱导基因：分别提取两组细胞总rna，经nanodrop分光光度计检测吸光值(a值)，测rna浓度。分别以如下体系逆转cdna：5μgrna；非特异性引物oligodt1(100μmol)；水补齐到12μl；70℃10分钟；迅速放到冰上，短速离心收集；m-mlvbuffer5×4；dntp10mm5×4；mlv(200u/μl)0.5or2(200u)。quantitativereal-timepcr反应体系总体积20μl：2×superrealpremixplus10μl；上游引物(10μm)1μl；下游引物(10μm)1μl；cdna模板0.25μl；ddh2o7.75μl。各引物信息见表1。设置条件为95℃，15min；95℃，10s；60℃，32s；40个循环；获得熔解曲线。比较两组中alp、col1、runx2的相对表达。以gapdh为内参，差异以2^-△△ct表达。

如图15和图16所示，接种于hacg微尺度支架、明胶微尺度支架后，细胞生长良好，有部分细胞可以从支架中流出到培养皿内。在普通培养基中，无论与纯明胶微尺度支架还是hacg微尺度支架三维培养，其成骨基因均变化不明显，无明显规律。然而在添加成骨诱导培养基时，在三维培养14天，我们发现相应成骨基因如，alp、col1、runx2，于hacg微尺度支架组较纯明胶微尺度支架组及二维培养组均升高。

综上所述，本发明实施例提供的人髌前脂肪垫干细胞的分离鉴定方法，构建了脂肪垫干细胞分离、培养与鉴定的平台，脂肪垫干细胞可以满足自体细胞数量要求，且满足干细胞鉴定要求，我们认为人脂肪垫干细胞除能满足干细胞的国际标准外，相对于其它来源的干细胞，其更容易获得。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。