人体脐带血间充质干细胞提取物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物医学的干细胞与组织工程学
技术领域：
，特别是涉及一种人体脐带血间充质干细胞提取物及其制备方法和应用。
背景技术：
：间充质干细胞(mscs)是一种具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，存在于骨髓、脂肪组织、脐血及多种胎儿组织。它可分泌多种细胞因子及生长因子，促进造血干细胞(hsc)的增殖与分化。mscs还具有免疫调节、抗炎和组织修复作用，可减轻移植物抗宿主病(gvhd)及其他移植相关并发症。间充质干细胞(mesenchymalstemcells，mscs)目前主要是从脊髓和脐血中提取的。脐带血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液。人体脐带血间充质干细胞是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。目前已经有临床实验证明人体脐带血间充质干细胞产量和绝大多数生物学特征与骨髓源间充质干细胞相似,相比于骨髓间充质干细胞，脐血间充质干细胞具有以下优点:(1)无伦理问题，来源广泛，易采集，易扩增。(2)具有更强的增值能力，比骨髓msc快数倍。(3)是一种更原始的msc群。(4)较低的hla-abc(经典人类白细胞抗原ⅰ类抗原)和hla-dr表达。因此人体脐带血间充质干细胞是一类比骨髓间充质干细胞更理想的细胞类群。但目前，只能通过人体脐带血间充质干细胞可从细胞中获得其有效成分，或通过人体脐带血间充质干细胞制备其分泌型内容物，而缺少同时获得其有效成分和分泌型内容物的研究。人们尤其是女性对于日常生活中的护肤美容也越来越重视，对于能够减缓皮肤细胞衰老和紫外损伤的产品的诉求也在不断增强。而且人们越来越重视护肤品的质量和安全性。有必要结合体脐带血间充质干细胞的有效成分和分泌型内容物研究抗氧化产品。技术实现要素：为了解决上述通过人体脐带血间充质干细胞获得的有效成分单一的技术问题，本发明提出一种体脐带血间充质干细胞提取物及其制备方法和应用。本发明的技术问题通过以下的技术方案予以解决：一种人体脐带血间充质干细胞提取物，由下述步骤制备：1)从人剂带血中分离人脐带血间充质干细胞，并在添加有维生素c的培养基中培养人脐带血间充质干细胞；2)从培养过所述人脐带血间充质干细胞的培养基中获得所述人脐带血间充质干细胞的分泌型内容物；3)将经过培养的人脐带血间充质干细胞破碎，获得人脐带血间充质干细胞的非分泌型内容物；4)将所述分泌型内容物与所述非分泌型内容物混合。优选地，从体外培养不超过五代的培养基中获得所述分泌型内容物；和/或，从体外培养不超过五代的人体脐带血间充质干细胞获得所述非分泌型内容物。本发明还提供一种上述人体脐带血间充质干细胞提取物的制备方法，包括以下步骤：1)从人剂带血中分离人脐带血间充质干细胞，并在添加有维生素c的培养基中培养人脐带血间充质干细胞；2)从培养过所述人脐带血间充质干细胞的培养基中获得所述人脐带血间充质干细胞的分泌型内容物；3)将经过培养的人脐带血间充质干细胞破碎，获得人脐带血间充质干细胞的非分泌型内容物；4)将所述分泌型内容物与所述非分泌型内容物混合。优选地，在步骤1)中，所述维生素c在所述培养基中的浓度为40um/ml-60um/ml。优选地，在步骤1)中，在步骤1)中，所述培养基在体积比为5-7％的二氧化碳和体积比为5-7％的氧气的条件下培养所述人脐带血间充质干细胞。优选地，在步骤1)中，还包括对分离后的人脐带血间充质干细胞进行鉴定。此外，本发明还提出上述人体脐带血间充质干细胞提取物或上述制备方法制备的人体脐带血间充质干细胞提取物在化妆品中的应用。此外，本发明还提出一种抗衰老组合物，包括上述所述的人体脐带血间充质干细胞提取物或上述所述的制备方法制备的人体脐带血间充质干细胞提取物。优选地，还包括表皮细胞生长因子、谷胱甘肽、烟酰胺和棕榈酸五胜肽。更优选地，所述人体脐带血间充质干细胞提取物的体积比为0.05-5％、所述表皮细胞生长因子的浓度为10-30ug/ml，所述谷胱甘肽的浓度为2-8ug/ml，所述烟酰胺的浓度为2-8mg/ml和所述棕榈酸五胜肽的浓度为1-3mg/ml。在其中一个实施例中，所述人体脐带血间充质干细胞提取物的体积比为1％、所述表皮细胞生长因子的浓度为20ug/ml，所述谷胱甘肽的浓度为5ug/ml，所述烟酰胺的浓度为5mg/ml和所述棕榈酸五胜肽的浓度为2mg/ml。本发明与现有技术对比的有益效果包括：从人剂带血中分离人脐带血间充质干细胞，并在添加有维生素c的培养基中培养人脐带血间充质干细胞，获得干细胞培养基，提高了干细胞培养基中人体脐带血间充质干细胞的分泌型内容物的产量，此外也加快了细胞的繁殖速率；从所述干细胞培养基中获得所述人脐带血间充质干细胞的分泌型内容物；将经过培养的人脐带血间充质干细胞破碎，获得人脐带血间充质干细胞的非分泌型内容物；将所述分泌型内容物与所述非分泌型内容物混合，得到人体脐带血间充质干细胞提取物，充分利用了人剂带血中分离人脐带血间充质干细胞制备包括分泌型内容物和非分泌型内容物的提取物。附图说明图1是本发明实施例1中分离培养的人体脐带血间充质干细胞形态图。图2是本发明实施例2中人体脐带血间充质干细胞流式分析图。图3是本发明实施例3中人体脐带血间充质干细胞内容物无菌检测效果图。图4是本发明实施例4中含有人体脐带血间充质干细胞提取物的抗衰老组合物无菌检测效果图。图5是本发明实施例5中含不同体积比的人体脐带血间充质干细胞提取物的抗衰老组合物对于减缓人皮肤细胞衰老效果的测定比较图。图6是本发明实施例5中不同时间的紫外线照射处理后人皮肤成纤维细胞增殖速率的测定比较图。图7是本发明实施例5中含人体脐带血间充质干细胞提取物的抗衰老组合物对于减缓人皮肤细胞衰老和紫外损伤效果的测定比较图。具体实施方式为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。实施例1分离并培养人脐带血间充质干细胞1.1脐带血采集通过与我司有长期合作的妇产科医院的协助，选择30岁以下健康的，无遗传性疾病，无传染病，抗hiv及乙肝血清标志物检测都为阴性的剖宫产妇采集脐血。采集完成后将脐血置于冰盒内并立即运输至实验室进行分离处理。其中，涉及的产妇对分离的脐带血实验方案知情并同意。1.2脐带血间充质干细胞的分离与培养采集的脐带血用磷酸盐缓冲液(简称pbs)进行等体积稀释，之后使用淋巴分离液进行密度梯度离心，收集白膜层，获得单个核细胞。用含浓度为50um/ml的维生素c的dmem培养基洗涤2次，然后，按照2x106/ml的密度接种于t25的细胞培养瓶中，置于37℃，含有体积比为5％二氧化碳和体积比为5％氧气的低氧培养箱中进行培养，在低氧的环境中可提高人体脐带血间充质干细胞的增殖速率以及分泌型内容物的产量，获得更多的人体脐带血间充质干细胞和分泌型内容物，培养基还是采用含浓度为50um/ml的维生素c的dmem培养基；vc可以帮助防止自由基对细胞的伤害，保持细胞活力，进一步提高人体脐带血间充质干细胞的增殖速率以及分泌型内容物的产量。72小时后进行换液，去掉未贴壁的细胞。以后每3天换一次液，并且换液前收集细胞培养基，置于-20度冰箱保存。大约在12天时，细胞密度达到80％的融合。用0.25％的胰酶进行消化，并按照1:3的比例进行传代，之后每日镜下观察细胞生长情况。分离的脐带血间充质干细胞形态见附图1。从图1可以看出：经过实施例1获得的细胞呈梭形均匀分布，具有典型的间充质干细胞的细胞形态。实施例2对分离的人体脐带血间充质干细胞进行细胞类型鉴定2.1取体外培养到第三代的脐带血间充质干细胞，消化，离心，并用pbs将细胞密度调整到1x106个/ml，分装多个管内。2.2分别吸取以下抗体：itc-anti-human-iggfc(购自biolegend，货号409309)、fitc-anti-hunman-cd44(购自biolegend，货号338803)、fitc-anti-hunman-cd105(购自biolegend，货号323203)、pe-anti-human-iggfc(购自biolegend，货号409311)、pe-anti-hunman-cd14(购自biolegend，货号367103)、pe-anti-hunman-cd34(购自biolegend，货号343505)、pe-anti-hunman-cd31(购自biolegend，货号303105)5ul；2.3将抗体加入到加入至步骤2.1中不同管内的细胞悬液中，常温，避光孵育15min，用bindingbuffer将每管体积补充到500ul。2.4将处理好的样本进行细胞流式分析。分析结果如图2所示。流式细胞分析结果表明：通过实施例1分离并培养的细胞高表达间充质干细胞特征性细胞表面标志物cd44和cd105，不表达造血干细胞特征性表面标志物cd34和cd14，也不表达内皮细胞特征性表面标志cd31，因此，通过实施例1分离并培养的细胞为间充质干细胞类群。实施例3提取人脐带血间充质干细胞内容物3.1提取人脐带血间充质干细胞培养基中干细胞内容物；3.1.1将细胞培养过程中收集的在-20度冰箱中保存的培养基置于4度冰箱化冻；3.1.2使用低温离心机控制温度。当低温离心机温度达到4度时，将化冻好的细胞培养基移入50ml离心管中，并使用1000r/min离心5min，将上清用0.45um的滤器进行过滤。3.1.3将过滤好的上清移到一支新的50ml高速离心管中，10000r/min离心20min。弃去上清液体，用2％体积比的无菌水重悬离心管底部的沉淀物，用0.45um的滤器进行过滤，获得培养基中人脐带血间充质干细胞的分泌型内容物。3.2提取人脐带血间充质干细胞中的非分泌型内容物3.2.1收集细胞沉淀，计数；3.2.2每1x107细胞沉淀用1ml无菌水重悬；3.2.3将重悬的细胞悬液置于液氮中2min，使其快速冷冻，然后将其置于37度恒温金属浴5min，使其化冻，接着用漩涡震荡仪快速震荡3min，使细胞破裂；3.2.4重复3.2.3步骤三次；3.2.5使用低温离心机控制温度。当低温离心机温度达到4度时，将3.2.4获得的细胞混合物置于离心机中1000r/min离心5min。吸取上清液体，将上清用0.45um的滤器进行过滤，获得人脐带血间充质干细胞的非分泌型内容物；3.2.6将3.1.3获得的分泌型内容物和3.2.5获得的非分泌型内容物混合在一起，即获得人体脐带血间充质干细胞提取物，并按每管100ul的体积进行分装，并取一支进行无菌检测。在本实施例中分泌型内容物与非分泌型内容物按体积比2:5进行混合。3.3人体脐带血间充质干细胞提取物的无菌检测将3.2.6获得的人体脐带血间充质干细胞提取物用无菌水稀释5倍，涂布于无抗性的lb平板上，取等体积的无菌水作为阴性对照，取等体积的非灭菌水作为阳性对照。72小时后观察结果。结果见例图3。其中，1为阳性对照；2为阴性对照；3为人体脐带血间充质干细胞提取物的干细胞组合物。结果表明：经实施例3提取的人体脐带血间充质干细胞提取物是无菌的，可以进行后续操作。实施例4配制抗衰老组合物4.1表皮细胞生长因子的配制：人源的重组表皮细胞生长因子蛋白采购自thermofisher。配制前，用离心机简单离心，将粉末离心至瓶底，用无菌水配制成1000ug/ml的母液，分装成50ul/管，置于-20度冰箱保存。4.2烟酰胺的配制：烟酰胺采购自sigma。称取适量的烟酰胺粉末，用无菌水配制成100mg/ml的母液，用0.22um滤器过滤除菌，分装成50ul/管，置于-20度保存。4.3棕榈酸五胜肽的配制：棕榈酸五胜肽采购自南京肽业。称取适量的棕榈酸五胜肽粉末，用无菌水配制成50mg/ml的母液，用0.22um滤器过滤除菌，分装成50ul/管，置于-20度冰箱保存。4.4谷胱甘肽的配制：还原型谷胱甘肽采购自sigma。称取适量的l-还原型谷胱甘肽粉末，用无菌水配制成100ug/ml的母液，用0.22um滤器过滤除菌，分装成50ul/管，置于-20度冰箱保存。采用上述几种物质的依据如下：表皮细胞生长因子(epidermalgrowthfactor，egf)是人体内分泌的一种重要的生长因子，极微量即能强烈促进皮肤细胞的分裂和生长，此外，它还能刺激细胞外一些大分子(如透明质酸和糖蛋白等)的合成和分泌，滋润皮肤，因此它既可作为化妆品的添加剂及用于面部整形手术，促进人皮肤的新陈代谢、减少皮肤畸形；也可在医药上治疗皮肤外伤、术后创口、褥疮、口腔溃疡和坏疽、以及放射治疗引起的皮炎等。它可以加速伤口和溃疡面的愈合。胶原蛋白可以清理皮肤氧化过程中的有害物质，修复皮肤损坏的弹力纤维细胞，达到防止肌肤老化和增强皮肤弹性的作用。同时，胶原蛋白可以促进皮肤活性细胞生成，增加皮肤紧致度。另外，胶原蛋白可以加快皮肤细胞的新陈代谢速度，促进角质自然脱落，消除黑色素沉淀淡化皮肤色斑。谷胱甘肽(glutathione)广泛存在于动、植物中，是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合，含有巯基的的三肽。机体新陈代代谢产生的过多自由基会损伤生物膜，侵袭生命大分子，加快机体衰老，并诱发肿瘤或动脉粥样硬化的产生。谷胱甘肽在人体内的生化防御体系起重要作用，具有多方面的生理功能。它的主要生理作用是能够清除掉人体内的自由基，做为体内一种重要的抗氧化剂，保护许多蛋白质和酶等分子中的巯基，使体内自由基的清除反应能够持续进行。谷胱甘肽不仅能消除人体自由基，还可以提高人体免疫力。谷胱甘肽维护健康，抗衰老，在老人迟缓化的细胞上所发挥的功效比年轻人大。烟酰胺也叫维生素b3，是美容皮肤科学领域公认的皮肤抗老化成份，最重要的功效是减轻和预防皮肤在早期衰老过程中产生的肤色黯淡，还可以修复受损的角质层脂质屏障，提高皮肤抵抗力，并且具有强大的深层锁水功效。五胜肽可以促进胶原蛋白，弹力纤维和透明质酸合成，提高肌肤的含水量，增加皮肤厚度及减少细纹，利于损伤或发炎皮肤的修复，。表皮生长因子，胶原蛋白，谷胱甘肽，烟酰胺和五胜肽都有一定的减缓皮肤衰老的功能，其本身对皮肤没有损伤，分别在不同的美容产品中有用到。结合下述实验数据表明，本发明将这几种物质结合人体脐带血间充质干细胞提取物，有助于缓解皮肤细胞衰老和紫外损伤。4.5含有人脐带血干细胞内容物的干细胞组合物的配制：按照表皮细胞生长因子20ug/ml，谷胱甘肽5ug/ml，烟酰胺5mg/ml，棕榈酸五胜肽2mg/ml配制混合液，同时分别加入体积比为4％，1％，0.25％，0.063％，0.016％和0％的实施例3获得的人体脐带血间充质干细胞提取物，最终配制成不同浓度的含有人体脐带血间充质干细胞提取物的抗衰老组合物，并将之制成干粉状态，用以检测含有不同体积比的人体脐带血间充质干细胞提取物的抗衰老组合物对于缓解人皮肤细胞衰老和紫外线照射损伤的效果。4.6获得的含有人脐带血间充质干细胞内容物的干细胞组合物无菌检测：将4.5获得的抗衰老组合物(人体脐带血间充质干细胞提取物的体积比为4％)用无菌水溶解，涂布于无抗性的lb平板上，取等体积的无菌水作为阴性对照，取等体积的非灭菌水作为阳性对照。72小时后观察结果。结果如图4所示。其中，4为阳性对照；5为阴性对照；6为含有人体脐带血间充质干细胞提取物的抗衰老组合物。结果表明：经实施例4获得的含有人体脐带血间充质干细胞提取物的抗衰老组合物是无菌的，可以进行后续操作。实施例5检测本发明制备的含有人体脐带血间充质干细胞提取物的抗衰老组合物减缓皮肤细胞衰老和紫外损伤的功效5.1含有人体脐带血间充质干细胞提取物的抗衰老组合物对于减缓人皮肤细胞衰老效果的测定各种不同浓度的含有人体脐带血间充质干细胞提取物的抗衰老组合物分组中，将不含含有人体脐带血间充质干细胞提取物的组别作为对照组)。表1.不同浓度的含有人体脐带血间充质干细胞提取物的抗衰老组合物分组表组别人脐带血间充质干细胞内容物含量(百分比)a0b0.016％c0.063％d0.25％e1％f4％使用人皮肤成纤维细胞，按照1x103/孔接种于96孔板，5复孔接种，共接种3块96孔板。分别在接种后第3天(即d3)，第5天(即d5)和第7天(即d7)进行mtt测试。检测结果见表2及附图5。表2.mtt检测含不同浓度的人脐带血间充质干细胞内容物的干细胞组合物处理的人皮肤细胞增殖速率结合表2和附图5，mtt检测结果表明：1.本发明制备的含有人体脐带血间充质干细胞提取物的抗衰老组合物能有效缓解细胞衰老；2.当含有人体脐带血间充质干细胞提取物含量为0.016％时，对人皮肤细胞的衰老的缓解作用不明显。3.当含有人体脐带血间充质干细胞提取物的含量达到0.064％及以上时，细胞数目相较于对照组有一定的提升；结合d3及d5的检测结果，含有人体脐带血间充质干细胞提取物的体积比越大，对人皮肤细胞的促进增殖效果越明显；结合d7的检测结果，同时对于缓解测试的人皮肤细胞的衰老效果也越明显。5.2构建紫外线照射的人皮肤细胞损伤模型使用人皮肤成纤维细胞，按照1x103/孔接种于96孔板，5复孔接种，共接种4块96孔板。在接种后第1天，使用紫外线分别照射细胞已经贴壁的96孔板0h(对照)，1h，2h，3h，4h后接着培养。然后，分别在接种后第3天(即d3)，第5天(即d5)和第7天(即d7)进行mtt测试。检测结果见表3及附图6。表3.mtt检测不同时间紫外线照射处理人皮肤成纤维细胞增殖速率0h1h2h3h4hd3100.03±0.01396.05％±0.01290.38％±0.03585.21％±0.02985.49％±0.038d599.99％±0.01594.06％±0.01088.18％±0.03073.94％±0.07374.38％±0.042d7100.01±0.01794.05％±0.00788.04％±0.02776.89％±0.02974.92％±0.028mtt检测结果表明：1.结合d3、d5和d7的检测结果，在紫外照射时间范围处于03小时内，随着紫外照射时间的延长，细胞损伤程度增大；2.紫外线照射超过3个小时，对人皮肤细胞的增殖造成损伤达到临界值；3.结合d5和d7的检测结果，随着细胞增殖速率的下降，这种损伤表现得尤其明显。因此，本发明提供的通过紫外线照射使人皮肤细胞损伤的造模方法是可行的。5.3含有人体脐带血间充质干细胞提取物的抗衰老组合物对于减缓人皮肤细胞衰老和紫外损伤效果的测定几种不同体积比的人体脐带血间充质干细胞提取物的抗衰老组合物分组中，将不含人体脐带血间充质干细胞提取物，并且不接受紫外线照射，作为对照组。检测在紫外线照射的细胞损伤模型中，含人体脐带血间充质干细胞提取物的抗衰老组合物对于人皮肤细胞的损伤修复能力。使用人皮肤成纤维细胞，按照1x103/孔接种于96孔板，5复孔接种，共接种5块96孔板。在接种后第1天，使用紫外线(波长为280nm～320nm的中波紫外线，能量剂量为80mj/cm2)分别照射细胞已经贴壁的96孔板1h，2h，3h，4h后接着培养。在接种后第7天进行mtt测试。检测结果见表2及附图7。表4.mtt检测紫外损伤模型中使用含不同体积比的人体脐带血间充质干细胞提取物的抗衰老组合物对人皮肤细胞增殖速率的影响mtt检测结果表明：1.在紫外照射时间范围处于0-3小时内，随着紫外照射时间的延长，细胞损伤程度增大；紫外线照射超过3个小时，对人皮肤细胞的增殖造成的损伤达到临界值。这与5.2中的数据是吻合的，因此一方面说明本发明提供的紫外损伤模型的稳定性，同时此数据说明人体脐带血间充质干细胞提取物的抗衰老组合物对紫外模型损伤的有较好的修复效果。2.使用本发明制备的人体脐带血间充质干细胞提取物的抗衰老组合物能有效缓解人皮肤细胞的紫外照射产生的损伤；其中，当人体脐带血间充质干细胞提取物体积比为0.016％时，对缓解人皮肤细胞由于紫外线造成的损伤效果不明显。但是，当人体脐带血间充质干细胞提取物的含量达到0.064％及以上时，使用本发明制备的衰老组合物对于缓解由于紫外照射造成的人皮肤细胞的损伤效果逐步增强，人体脐带血间充质干细胞提取物体积比越大，效果越明显。甚至，在紫外照射造成的损伤在一定范围之内(损伤效果小于连续3小时的紫外照射，如紫外照射1至2小时)，使用本发明配制的人体脐带血间充质干细胞提取物的衰老组合物(其中，人体脐带血间充质干细胞提取物的体积比超过1％)不仅能缓解，甚至能修复由于紫外线照射造成的人皮肤细胞的损伤。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属
技术领域：
的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干等同替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应当视为属于本发明的保护范围。当前第1页12