一种海藻发酵藻糕的制作方法

本发明涉及农产品深加工技术领域，具体涉及一种海藻发酵藻糕。

背景技术：

龙须菜等海藻原藻具有特殊的藻腥味，不仅给加工带来一定的困难，也让消费者难以接受。目前，对于研究海藻脱腥方法的报道有很多，主要的脱腥方法有三种，即物理脱腥、化学脱腥、生物脱腥。比较三种方法脱腥技术，以物理脱腥效果较差，会破坏龙须菜特有的藻香典型性风味；化学脱腥存在安全与污染问题，不适宜产业化应用；生物脱腥不仅可实现海带的脱腥、改善风味，且可提高营养。生物脱腥技术在鱼类、贝类脱除腥味成分方面的文献报道比较多，对龙须菜等海藻的生物脱腥技术研究报道鲜少。如何解决上述技术问题，研制出脱除海藻腥味且含特有藻香味的新产品，是研发人员所面临的难题。

技术实现要素：

本发明提供了一种产香酵母菌，该菌株结合形态特征和基于细菌26srdna基因序列的系统发育分析，鉴定为酿酒酵母jj4(saccharomycescerevisiaejj4)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为cctccno：m2018219，保藏日期为2018年4月19日。

本发明还提供了上述产香酿酒酵母jj4在海藻发酵藻糕中的应用。

一种海藻发酵藻糕的制备方法，利用本发明的酿酒酵母jj4对海藻进行脱腥处理，得到海藻发酵液，再将海藻发酵液制备成海藻发酵藻糕。

所述海藻发酵液的制备方法如下：

(1)将海藻洗净、沥干，切成4.5-5.5mm宽的块状或颗粒；

(2)按照海藻与水的质量比为1:2-5，往海藻中添加水，打浆至无明显颗粒物，得到藻浆；

(3)将藻浆的ph值调至4.0-4.6(利于酿酒酵母jj4的快速生长繁殖)，然后往藻浆中加入海藻质量4.5-5.5％的甜味剂，得到调配液，将所述调配液加热溶解、灭菌、冷却；

(4)将酿酒酵母于糖蜜培养基中30℃培养20-24h，得到酿酒酵母jj4菌种培养液；

(5)往冷却后的调配液中加入酿酒酵母jj4菌种培养液，于25-35℃发酵72-130h，得到脱腥后的海藻发酵液。

步骤(1)中，所述海藻为龙须菜、海带、紫菜、裙带菜或石花菜等海藻。

步骤(3)中，所述藻浆采用苹果酸、乳酸或柠檬酸调节ph值；所述甜味剂为葡萄糖、蔗糖中的一种或两种，生理生化试验结果表明，酿酒酵母jj4可代谢利用碳源葡萄糖和蔗糖，因此，在发酵时添加一定量的葡萄糖和蔗糖混合物，更有利于jj4的快速生长繁殖。

步骤(3)中，所述加热溶解的温度为95℃-100℃，灭菌的温度为100℃，灭菌时间10-12min。

步骤(4)中，所述糖蜜培养基中含有0.1-1.0g/l的葡萄糖、麦芽糖或蔗糖中的一种或几种。

在糖蜜培养基中加入以上酿酒酵母jj4可利用的糖类，可促进酿酒酵母jj4生长繁殖。培养基组成均为食品添加剂范围，可直接将活化好的菌种连同培养基一起进行下一步发酵，突破传统菌种培养或使用过程中将非可食用成分带入的技术瓶颈。

进一步，所述糖蜜培养基的制备方法为：：将糖蜜用水搅拌稀释至可溶性固形物含量为45-50％，将ph值调节至3.5-3.8，搅拌加热至85-90℃保温10-15min，冷却后过滤取清液，将清液稀释至可溶性固形物含量为10-15％，然后加入葡萄糖、麦芽糖或蔗糖中的一种或几种，最后调节ph值至5.0，121℃灭菌20min。

步骤(5)中，所述酿酒酵母jj4菌种培养液的添加量为调配液质量的0.1-3.0％。

进一步，将海藻发酵液制备成海藻发酵藻糕的方法为：

1)将白砂糖和净水按质量比2.5-3.5∶1的比例混合，加热溶解制备成糖液；

2)将海藻发酵液经100-220目目绢布过滤，收集藻沉淀，将藻沉淀与上述糖液混合均匀得到混合料，糖液的用量为使得混合料中可溶性固形物含量为28-35％，然后将混合料倒入容器中，于55-65℃下热风干燥10-24h，得到海藻发酵藻糕。

进一步，所述混合料中还可以添加0.01-0.15％的食品胶，所述食品胶为果胶，魔芋胶或卡拉胶。

本发明提供的酿酒酵母jj4具有显著的海藻脱腥效果和产香能力。本发明通过采用该酿酒酵母jj4对龙须菜等海藻进行生物发酵，代谢脱除藻腥味、产生具有果香的风味物质，具体是以海藻为原料，制成藻浆，添加酿酒酵母jj4，调控发酵，制备得到无藻腥味、具有乳酸发酵香的海藻发酵液，然后利用发酵液自有胶体多糖，辅以卡拉胶等，经调配、均质、成型、干燥制作成的休闲食品。本发明保持了海藻富含活性多糖等功能营养物质，同时去除藻腥味，赋予发酵的果香味，实现海藻的高值化加工利用。

附图说明

图1为产香酿酒酵母jj4的菌落形态图；

图2为产香酿酒酵母jj4的微观形态图；

图3为产香酿酒酵母jj4与相关种的26srdna序列系统发育树。

具体实施方式

以下实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

安琪酵母jaq：购于安琪酵母股份有限公司。

酵母菌分离纯化培养基：改良马铃薯葡萄糖培养基pda。马铃薯200g/l、葡萄糖20g/l、去氧胆酸钠0.5g/l、氯霉素0.1g/l、琼脂15g/l。其中去氧胆酸钠可以抑制丝状真菌菌丝的蔓延生长。

麦芽汁培养基：可溶性固形物含量10％麦芽汁，使用乳酸及氢氧化钠调节ph值至5.4，121℃灭菌20min，冷却备用。加2％琼脂可制成麦芽汁琼脂培养基。

大米糖化液培养基：称量100g的糯米于500ml锥形瓶中，浸泡过夜后沥干，121℃灭菌20min，冷却后添加150ml无菌水，再分别加入用量为每g米饭70u、560u的α-淀粉酶和糖化酶，酶解后基质固形物含量30％，总酸0.23g/l，ph值6.0。

实施例1菌株的分离、筛选、鉴定及保存

采用平板划线法，从风味优良的蜂窝样品发酵液中分离酵母菌；通过发酵风味和酿造特性试验，筛选出具有独特发酵风味的优良酵母菌。

1.菌株的分离、纯化

以风味优良的蜂窝样品为选育菌源，梯度稀释并涂布于酵母菌分离纯化培养基平板上，经多次划线分离和镜检，得到较纯的菌株。根据ttc颜色变化试验，挑选出具有典型酵母菌菌落特征的菌株6株，编号为jj1、jj2、jj3、jj4、jj5、jj6，得到的菌株分别接种于麦芽汁斜面培养基上，28℃培养1d，4℃冰箱保藏，备用。

2.菌株的初筛

将分离得到的菌株分别以2％的接种量加入大米糖化液培养基中，在20℃控温发酵3d，以发酵风味为指标初筛产香酵母菌株。

发酵样品按其风味特征分为3级。一级为发酵香浓郁，标记为“+++”；；二级为发酵一般，标记为“++”；三级为发酵香不明显，标记为“-”。请24个经培训过的专业人士进行独立评价，取平均值统计分析。

6株菌株在不同培养基中的发酵风味试验结果见表1。酵母菌jj2、jj4和jj6在大米糖化液中具有浓郁的发酵香，评分为“+++”，酵母菌jj3在大米糖化液均具有发酵香，评分为“+”，酵母菌jaq、jj1和jj5均不能产生发酵香，评分为“-”。结果表明，具有独特发酵风味的优良酵母菌共有3株，编号分别为jj2、jj4和jj6。

表16株酵母菌在培养基中的发酵风味评价

3.菌株的复筛

将龙须菜洗净、沥干，切成4.5-5.5mm宽的龙须菜颗粒。按龙须菜颗粒与水的质量比为1:5添加蒸馏水，搅拌均匀，打浆至无明显颗粒物，得到藻浆。将藻浆的ph值调至4.3-4.7，然后往藻浆中加入龙须菜颗粒质量5％的葡萄糖，加热溶解，然后分装于三角瓶中，100℃灭菌10min，冷却后加入5％的酵母菌jj2、jj4、jj6菌种培养液，控温30℃发酵120h，取发酵液进行感官风味评价，以不添加酵母菌的处理为对照，筛选龙须菜脱腥适宜酵母菌株，结果见表2。结果表明，jj4发酵产香的风味最好，为龙须菜脱腥适宜菌株。

表2酵母菌复筛

4.菌株的鉴定

将菌株jj4接种于mea培养基，28℃培养7d，观察到呈乳白色，质地粘稠，表面反光，边缘不整齐的菌落，如图1所示。如图2，显微镜下观察到细胞呈椭圆形或棒状，大小2.5-6×4-15μm，繁殖方法为出芽生殖。

表3菌株jj4的生理生化特征

注：+表示反应为阳性，-表示反应为阴性。

从表3中可以看出，菌株jj4可以d-葡萄糖、海藻糖、d-麦芽糖、d-棉籽糖、d-半乳糖、d-蔗糖为碳源。

对菌株jj4进行26srdna检测，测序结果如seqidno.1所示。序列比对结果如下：

alignment：酵母菌jj4

100％saccharomycescerevisiaenrrly-12632t(ay048154)

99％saccharomycescariocanusnrrly-27337t(af398478)

99％saccharomycesparadoxusnrrly-17217t(ay048155)

98％saccharomyceskudriavzeviinrrly-27339t(af398480)

98％saccharomycesarboricoluscbs10644t(ef580918)

98％saccharomycesbayanusvar.uvarumnrrly-17034t(ay130339)

98％saccharomycesbayanusnrrly-12624t(ay048156)

98％saccharomycespastorianusnrrly-27171t(ay048172)

97％saccharomycesmikataenrrly-27341t(af398479)

采用mega5.0软件，邻位连接法显示菌株“酵母菌jj4”与相关种的26srdna序列系统发育树，进行1000次的相似度重复计算，图3中发育树节点只显示bootstrap值大于70％数值，上标“t”代表模式菌株。

根据菌株的基因测序结果与酿酒酵母具有高度的同源性，结合菌株的生理生化特征等鉴定结果，将菌株jj4鉴定为saccharomycescerevisiaejj4，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为cctccno：m2018219，保藏日期为2018年4月19日。

实施例2采用酿酒酵母jj4对龙须菜进行脱腥处理

1.试验组样品制备：

(1)将龙须菜洗净、沥干，切成4.5-5.5mm宽的龙须菜颗粒；

(2)按照龙须菜颗粒与水的质量比为1:2-5，往龙须菜颗粒中添加蒸馏水，搅拌均匀，打浆至无明显颗粒物，得到藻浆；

(3)往藻浆中加入龙须菜颗粒质量0.28-0.3％的苹果酸(目的是将ph值调到4.5左右,该ph值为酵母菌的最适起始生长ph值)，然后加入龙须菜颗粒质量4.5-5.5％的白砂糖，得到调配液，将所述调配液于95℃-100℃加热溶解，然后分装于三角瓶中，于100℃灭菌10min，冷却；

(4)将酿酒酵母于糖蜜培养基培养中30℃培养24h，4800rpm离心10min，取菌坭沉淀用等体积的生理盐水重悬，菌量达10⁸cfu/ml，得到酿酒酵母jj4菌种培养液；

(5)往冷却后的调配液中加入酿酒酵母jj4菌种培养液，接种后菌量为10⁵cfu/ml以上，于30℃培养箱中发酵120h，得到脱腥后的龙须菜发酵液。

对照组样品：未进行脱腥处理的龙须菜原浆。

2.脱腥处理后的风味物质测定

2.1固相微萃取(spme)取样

取脱腥处理得到的龙须菜发酵液样品5g置于20ml的顶空进样瓶中进行萃取。萃取条件：萃取头老化温度250℃；老化时间15min；平衡温度60℃；平衡时间30min；250℃解吸附3min。

2.2gc-ms分析条件以及数据处理

gc条件：db-5ms(30m×0.25mm，膜厚0.25μm)；采用程序升温方式，起始温度50℃，保持3min，以10℃/min的速率上升至90℃，保持5min，以10℃/min的速率上升至230℃，保持2min；以20℃/min的速率上升至280℃，保持5min；载气为he，流速1.0ml/min；不分流进样。

ms条件：电子电离源；电子能量70ev；离子源温度230℃；质量扫描范围m/z35～550；发射电流100μa。

gc-ms数据分析：对不同龙须菜发酵液样品挥发性物质的定性分析主要采用gc-ms联用仪nist14谱库对照，选择相似度大于80％的物质，另外结合保留指数(retentionindex，ri)进行确定。按以下公式计算ri：

式中：n和n+1为未知物流出前、后正构烷烃碳原子数；tn+1和tn为正构烷烃的保留时间/min；tr为未知物的保留时间/min(tn＜tr＜tn+1)。

采用面积归一化法进行定量分析，求得各挥发性成分的相对含量。

2.3感官评价

邀请20位经过培训的感官评定分析员组成评价小组，对样品进行感官描述。

3.结果与分析

3.1龙须菜感官评价

表4龙须菜感官评价

3.2龙须菜gc-ms结果分析

表5龙须菜发酵液挥发性风味物质hs-spme-gc-ms分析结果

对jj4发酵脱腥前后的龙须菜挥发性风味物质进行gc-ms解析，对龙须菜藻腥味起主要作用的风味物质有正十九烷、1-辛烯-3-醇、十六醇/棕榈醇、1-十三醇和z-2-庚烯醛等，其经发酵后其相对含量下降甚至未检出。发酵产生了β-苯乙醇等醇类物质、z-2-庚烯醛、苯乙醛等醛类物质、己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、反式-4-癸烯酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸异戊酯、月桂酸乙酯、己酸-2-苯乙酯、十五烷酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、棕榈酸乙酯、十七烷酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、(e)-9-十八碳烯酸乙酯、十九烷酸乙酯等多种酯类，以及辛酸、癸酸等酸类物质，这些物质赋予了龙须菜独特的酵母发酵风味。结果表明，通过酿酒酵母jj4发酵不仅脱除龙须菜藻腥味，还可赋予龙须菜浓郁的酵母发酵香。

实施例3酿酒酵母jj4最适发酵条件的确定

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种：酿酒酵母jj4。

1.1.2生长培养基：ypd液体培养基。

1.2主要仪器设备

spx-250bs-ⅱ生化培养箱：上海新苗医疗器械制造有限公司；hzp-250型全温振荡培养箱：上海精宏实验设备有限公司；yxq-cs-50sⅱ全自动立式压力蒸汽灭菌器：上海博达实业有限公司医疗设备厂；dhg-9123a型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；sw-cj-1fd型单人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司。sartorius-bs电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.3测定方法

1.3.1生物量的比浊法检测：将样品稀释10倍测定od600值。

1.4试验方法

1.4.1种子液：将保藏的菌种接入ypd液体培养基中，28℃恒温培养24h，菌体生物量达10⁷cfu/ml后进行以下试验。

1.4.2酵母菌jj4最适生长温度的试验

菌种按1％接种量接入ypd液体培养基，在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃下恒温培养8h后测定od600，确定酿酒酵母jj4最适生长温度。试验重复三次。

1.4.3酵母菌jj4最适生长ph值的试验

将ypd培养基ph值分别调整为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0中，菌种按1％接种量分别接入，在28℃下恒温培养8h，测定od600，确定酿酒酵母jj4生长的最适ph值。试验重复三次。

1.5数据分析

用dps进行显著性分析。

2结果与分析

2.1酵母菌jj4最适生长温度

表6酵母菌jj4最适生长温度

由表6可知，菌株jj4的最适生长温度为30-35℃。

2.3酵母菌jj4的最适ph

表7菌株jj4的最适ph试验结果

由表7知，jj4的最适生长ph值为4.0-4.5。

实施例4

一种龙须菜发酵藻糕，其是利用本发明的酿酒酵母jj4对龙须菜进行脱腥处理，得到龙须菜发酵液，再将发酵液制备成龙须菜发酵藻糕，步骤如下：

(1)将龙须菜洗净、沥干，切成4.5-5.5mm宽的块状或颗粒；

(2)按照龙须菜与水的质量比为1:3.5，往龙须菜中添加水，打浆至无明显颗粒物，得到藻浆；

(3)采用柠檬酸将藻浆的ph值调至4.5，然后往藻浆中加入海藻质量5.0％的甜味剂(葡萄糖或蔗糖)，得到调配液，将所述调配液于98℃加热溶解，100℃灭菌时间12min，冷却；

(4)将酿酒酵母于糖蜜培养基中30℃培养20h，得到酿酒酵母jj4菌种培养液；

其中糖蜜培养基的制备方法为：将糖蜜用水搅拌稀释至可溶性固形物含量为47.5％，将ph值调节至3.7，搅拌加热至85℃保温15min，冷却后过滤取清液，将清液稀释至可溶性固形物含量为10％，然后加入葡萄糖、麦芽糖和蔗糖的混合物(0.5g/l)，最后调节ph值至5.0，121℃灭菌20min；

(5)往冷却后的调配液中加入其质量1.5％的酿酒酵母jj4菌种培养液，于30℃发酵96h，得到脱腥后的龙须菜发酵液；

(6)将白砂糖和净水按质量比3∶1的比例混合，加热溶解制备成糖液；

将海藻发酵液经100目绢布过滤，收集藻沉淀，将藻沉淀与上述糖液混合均匀得到混合料，糖液的用量为使得混合料中可溶性固形物含量为30％，然后再往混合料中添加0.12％的果胶，混合均匀后将混合料倒入容器中，于60℃下热风干燥18h，得到海藻发酵藻糕。

实施例5

一种龙须菜发酵藻糕，其是利用本发明的酿酒酵母jj4对龙须菜进行脱腥处理，得到龙须菜发酵液，再将发酵液制备成龙须菜发酵藻糕，步骤如下：

(1)将龙须菜洗净、沥干，切成4.5-5.5mm宽的块状或颗粒；

(2)按照龙须菜与水的质量比为1:2，往龙须菜中添加水，打浆至无明显颗粒物，得到藻浆；

(3)采用苹果酸将藻浆的ph值调至4.0，然后往藻浆中加入海藻质量4.5％的甜味剂(蔗糖)，得到调配液，将所述调配液于95℃加热溶解，100℃灭菌时间10min，冷却；

(4)将酿酒酵母于糖蜜培养基中30℃培养24h，得到酿酒酵母jj4菌种培养液；

其中糖蜜培养基的制备方法为：将糖蜜用水搅拌稀释至可溶性固形物含量为45％，将ph值调节至3.5，搅拌加热至90℃保温10min，冷却后过滤取清液，将清液稀释至可溶性固形物含量为15％，然后加入麦芽糖(0.5g/l)，最后调节ph值至5.0，121℃灭菌20min；

(5)往冷却后的调配液中加入其质量0.1％的酿酒酵母jj4菌种培养液，于25℃发酵130h，得到脱腥后的龙须菜发酵液；

(6)将白砂糖和净水按质量比2.5∶1的比例混合，加热溶解制备成糖液；

将海藻发酵液经220目绢布过滤，收集藻沉淀，将藻沉淀与上述糖液混合均匀得到混合料，糖液的用量为使得混合料中可溶性固形物含量为28％，然后再往混合料中添加0.01％的魔芋胶和0.08％的果胶，混合均匀后将混合料倒入容器中，于55℃下热风干燥24h，得到海藻发酵藻糕。

实施例6

一种龙须菜发酵藻糕，其是利用本发明的酿酒酵母jj4对龙须菜进行脱腥处理，得到龙须菜发酵液，再将发酵液制备成龙须菜发酵藻糕，步骤如下：

(1)将龙须菜洗净、沥干，切成4.5-5.5mm宽的块状或颗粒；

(2)按照龙须菜与水的质量比为1:5，往龙须菜中添加水，打浆至无明显颗粒物，得到藻浆；

(3)采用乳酸的ph值调至4.6，然后往藻浆中加入海藻质量5.5％的甜味剂(葡萄糖和蔗糖的混合物)，得到调配液，将所述调配液于100℃加热溶解，100℃灭菌时间10min，冷却；

(4)将酿酒酵母于糖蜜培养基中30℃培养22h，得到酿酒酵母jj4菌种培养液；

其中糖蜜培养基的制备方法为：将糖蜜用水搅拌稀释至可溶性固形物含量为50％，将ph值调节至3.8，搅拌加热至88℃保温12min，冷却后过滤取清液，将清液稀释至可溶性固形物含量为10％，然后加入葡萄糖和蔗糖的混合物(1.0g/l)，最后调节ph值至5.0，121℃灭菌20min；

(5)往冷却后的调配液中加入其质量3％的酿酒酵母jj4菌种培养液，于35℃发酵72h，得到脱腥后的龙须菜发酵液；

(6)将白砂糖和净水按质量比3.5∶1的比例混合，加热溶解制备成糖液；

将海藻发酵液经100目绢布过滤，收集藻沉淀，将藻沉淀与上述糖液混合均匀得到混合料，糖液的用量为使得混合料中可溶性固形物含量为35％，然后再往混合料中添加0.15％的卡拉胶，混合均匀后将混合料倒入容器中，于65℃下热风干燥10h，得到海藻发酵藻糕。

以上以龙须菜为例，阐述了本发明的酿酒酵母jj4在龙须菜藻糕中的应用，所述的制备方法同样适用于海带、紫菜、裙带菜、石花菜等海藻类藻糕的准备。

序列表

<110>福建省农业科学院农业工程技术研究所

<120>一种海藻发酵藻糕

<130>1

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>528

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tttgaaatctggtaccttcggtgcccgagttgtaatttggagagggcaactttggggccg60

ttccttgtctatgttccttggaacaggacgtcatagagggtgagaatcccgtgtggcgag120

gagtgcggttctttgtaaagtgccttcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctctaa180

gtgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtac240

agtgatggaaagatgaaaagaactttgaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttga300

aagggaagggcatttgatcagacatggtgttttgtgccctctgctccttgtgggtagggg360

aatctcgcatttcactgggccagcatcagttttggtggcaggataaatccataggaatgt420

agcttgcctcggtaagtattatagcctgtgggaatactgccagctgggactgaggactgc480

gacgtaagtcaaggatgctggcataatggttatatgccgcccgtcttg528