本发明属于营养食品技术领域，具体涉及豌豆蛋白降压肽制备方法及其应用。
技术背景
豌豆蛋白是一种优质蛋白质，其氨基酸比例较平衡，除蛋氨酸含量稍低外，其余必需氨基酸均达到fao/who推荐模式值“1”。另外，豌豆蛋白具有较好保水性、吸油性和凝胶形成性，可应用于各种功能性食品中。但目前为止。我国对豌豆加工重点是提取利用豌豆淀粉，制备淀粉后残渣中的蛋白尚未能进行充分开发和利用，目前绝大部分残渣仅作饲料之用，造成宝贵的蛋白质资源浪费，所以从豌豆蛋白中制备降压肽，可以充分利用资源、变废为宝、减少浪费。
据调查统计，50年来我国人群高血压患病率呈明显上升趋势，2016年我国18岁及以上成人高血压患病率为25.2%，每年新增患病人数1000万左右。目前我国高血压患者人数已超过3亿。基于我国高血压患病率的现状，高血压的治疗是一个极其重要的问题。
血管紧张素转换酶(angiotensini—convertingenzyme，简称ace)对调节血压起着关键性的作用，血管紧张素i(angiotensini，简称ai)不具有活性，但是ai在ace的作用下可以转变为具有活性的血管紧张素ii(angiotensinii，简称aii)，aii具有收缩血管平滑肌的活性功能，从而引起血压升高。由于体内ace活性太高而引起的高血压，可以通过抑制ace活性，阻止血管紧张素ii的生成和激肽降解的减少，从而达到治疗高血压的作用。因此，ace抑制剂可作为降血压的药物。
据报道，许多发达国家早已尝试化学合成ace的抑制剂，并在临床治疗中使用。然而，化学合成的降压药物往往会引起皮疹、喉咙肿痛、味觉系统失调、肾脏损害等各种副作用，不适合长期连续服用。研究表明，已经可以从动物蛋白、植物蛋白、微生物代谢产物中分离提取降血压肽。食源性像从豌豆蛋白提取降压肽与化学合成的降血压药物相比，具有无副作用、吸收好、并仅对病理性高血压患者有降压效果，对正常机体无副作用等优点。
有研究证明人们分别从不同来源的原料中制备出了高效的ace抑制肽，对植物蛋白源的研究有大豆、玉米、花生、米糠等，却还没有关于从豌豆蛋白制备降压肽的研究。
中国高血压发病人群逐年增加，高血压用药市场会进一步增加。目前，高血压患者中知情并且进行药物干预的人数占比较少，随着医疗水平和人们医疗意识的不断提升，高血压用药市场会进一步打开，前景广阔。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种豌豆蛋白降压肽制备方法及其应用，通过对豌豆蛋白粉进行挤压粉碎和利用中性蛋白酶进行酶解反应来制备降压肽，缩短了酶解时间，提高了酶解效率，豌豆肽的dpph清除率、.oh清除率和o2.-清除率都得到了很大的提高；并研究其对高血压的抑制作用，其只对高血压患者有降压作用，而对血压正常的机体没有影响，安全性高且无毒副作用。
本发明所述的豌豆蛋白降压肽的制备方法：挤压过程为：将含水量为28%~30%的豌豆蛋白粉在温度为53~55℃、螺杆转速为170~175r/min、膜孔孔径为10mm的条件下进行挤压，挤压后的豌豆蛋白粉冷却后粉碎至50目。
酶解过程为：将挤压粉碎后的豌豆蛋白粉溶解于ph值为6.7~7的磷酸盐缓冲溶液中，再用中性蛋白酶对其进行酶解，得到酶解产物。
其中：中性蛋白酶酶解最佳条件：酶解反应温度为40~42℃，酶解反应的ph值为6.7~7，加酶量为12.5%~13.2%（e/s），酶解反应中豌豆蛋白浓度为6.8%~6.92%（g/ml），酶解时间为2.6~3h。
酶解之后，灭酶温度为100℃，灭酶时间为10min。
利用透析袋分离豌豆蛋白降压肽：采用7kda、3.5kda、1kda的透析袋，对酶解液依次分离。将透析袋进行预处理，向处理好的透析袋中加入约三分之二的酶解液，两端封好，放在蒸馏水中进行搅拌，每隔0.5h换一次水，直至透出液不再有颜色变化，将透出液用旋转蒸发仪浓缩后，浓缩液进行冷冻干燥，得到豌豆蛋白降压肽粉。
其中，酶解产物经透析得到四个级分：分离得到小于1kda、1～3.5kda、3.5～7kda和大于7kda4个不同组分的酶解液。测定其o2.-自由基清除率分别为83%、35%、21%、14%。发现分子量小于1kda的酶解液活性最强，分子量大多集中在在200～800da左右，说明酶解后得到的肽大多是2～8肽。
酶解反应后，豌豆肽的dpph清除率、.oh清除率、o2.-清除率分别为98%、83%、76%。
本发明所述的豌豆蛋白降压肽的应用：2-3mg豌豆蛋白降压肽的添加量对1单位ace酶活的抑制率最高，此时抑制率为37%~39%。
对高血压患者有明显降压作用，可添加制成降压药物或者具有降压功能的营养食品。
与现有的技术相比，本发明的有益效果如下：
（1）本发明中，豌豆蛋白经过挤压粉碎，空间结构发生了一定变化，链状结构比例增加，孔隙增多，表面的凹凸感更为强烈，比面积增加，所以豌豆蛋白与中性蛋白酶的接触面积更大，有利于酶进入豌豆蛋白内部，减少酶解时间，提高酶解反应效率。
（2）本发明中，从豌豆蛋白中提取的降压肽作为一种生物活性多肽，只对高血压患者有降压作用，而对血压正常的机体没有影响，安全性高且无毒副作用。可以取代传统的化学降压药物。
（3）本发明中，豌豆蛋白肽还具有提高人体新陈代谢、增强免疫力、延缓衰老等功能，对人体有益无害。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
豌豆蛋白降压肽的制备方法：将含水量为30％的豌豆蛋白粉在温度为55℃、螺杆转速为175r/min、膜孔孔径为10mm的条件下进行挤压，挤压后的豌豆蛋白粉经冷却，粉碎至50目。
称取3.46g的豌豆蛋白挤出物样品，加入6.6g的中性蛋白酶并溶解于ph值为6.99的磷酸盐缓冲溶液中，摇匀，置于恒温振荡水浴锅中，振荡酶解3h，结束后，沸水浴灭酶10min。冷却后，将蛋白酶解液过滤，取滤液待用。
本实验采用1kda的透析袋，对酶解液进行依次分离。将透析袋进行预处理，向处理好的透析袋中加入约三分之二的酶解液，两端封好，放在蒸馏水中进行搅拌，每隔一段时间换一次水，直至透出液不再有颜色变化，将透出液用旋转蒸发仪浓缩，对浓缩液进行冷冻干燥24h，得到豌豆蛋白降压肽粉。
其中：
制备豌豆蛋白降压肽的中性蛋白酶酶解反应温度为40℃，酶解反应的ph值为6.7，加酶量为13.2%（e/s），酶解反应中豌豆蛋白浓度为6.92%（g/ml），酶解时间为3h。
酶解之后，灭酶温度为100℃，灭酶时间为10min。
ph值为6.99的磷酸盐缓冲溶液由0.2m的na2hpo4和0.2m的nah2po4配制而成。
酶解反应后，豌豆肽的dpph清除率、.oh清除率、o2.-清除率分别为95%、88%、45%。
豌豆蛋白降压肽对ace酶抑制率的测定：采用cushman的测定方法，在2ml的离心管中，每次测试的总体积为0.2ml。将hhl溶解在0.1mol/l含0.3mol/l氯化钠的硼酸盐缓冲液中（ph=8.3），配制成浓度为5mmol/l的马尿酰组氨酰亮氨酸（hhl）溶液备用。在离心管中依次加入80μl的hhl，100μl去离子水，10ul豌豆蛋白降压肽水解液（0.20mg/ml），将此混合液放入37℃恒温水浴中保温3min，然后加入10μlace酶液启动反应。恒温保持30min，加入0.2ml的1mol/lhcl终止反应，再加入1.2ml（-20℃)的乙酸乙酯，均匀混合大约15s，以萃取被ace所释放的马尿酸（hip），最后，离心（3500r/min）5min后取出0.8ml酯层，转入另一个试管中，在120°c的烘箱中烘干1h左右，重新溶于0.8ml的去离子水中，在228nm处测定吸光值。
空白对照管除在反应前先加入0.2ml的1mol/lhcl终止反应外，其余操作相同。
其中，抑制率计算式如下：抑制率（%）=（oda-odb）/(oda-odc)
odb为存在抑制剂与酶时的吸光值；oda为不存在抑制剂时的吸光值（去离子水代替水解液）；odc为抑制剂与酶都不存在时的吸光值（用去离子水代替水解液，并在反应前加盐酸终止反应）。
豌豆蛋白降压肽对ace酶抑制率为37.1%。
实施例2
豌豆蛋白降压肽的制备方法：将含水量为28％的豌豆蛋白粉在温度为53℃、螺杆转速为170r/min、膜孔孔径为10mm的条件下进行挤压，挤压后的豌豆蛋白粉经冷却，粉碎至50目。
称取3.46g的豌豆蛋白挤出物样品，加入6.6g的中性蛋白酶并溶解于ph值为6.7的磷酸盐缓冲溶液中，摇匀，置于恒温振荡水浴锅中，振荡酶解2.6h，结束后，沸水浴灭酶10min。冷却后，将蛋白酶解液过滤，取滤液待用。
本实验采用1kda的透析袋，对酶解液进行依次分离。将透析袋进行预处理，向处理好的透析袋中加入约三分之二的酶解液，两端封好，放在蒸馏水中进行搅拌，每隔一段时间换一次水，直至透出液不再有颜色变化，将透出液用旋转蒸发仪浓缩，对浓缩液进行冷冻干燥24h，得到豌豆蛋白降压肽粉。
其中：
制备豌豆蛋白降压肽的中性蛋白酶酶解反应温度为42℃，酶解反应的ph值为6.7，加酶量为12.5%（e/s），酶解反应中豌豆蛋白浓度为6.8%（g/ml），酶解时间为3h。
酶解之后，灭酶温度为100℃，灭酶时间为10min。
ph值为6.7的磷酸盐缓冲溶液由0.2m的na2hpo4和0.2m的nah2po4配制而成。
酶解反应后，豌豆肽的dpph清除率、.oh清除率、o2.-清除率分别为94%、88%、46%。
豌豆蛋白降压肽对ace酶抑制率的测定：
实验在2ml的离心管中进行，每次测试的总体积为0.2ml：含50mmol/l的ph为8.3的hepes缓冲液，300mmol/lnacl，5mmol/lhhl，0.25mg/ml的豌豆蛋白降压肽水解液10ul以及100ul去离子水，在37℃恒温水浴保温5min，然后加入10μl的ace酶液(0.1u溶于1ml相同缓冲液中)启动反应，恒温保持30min后，加入0.2ml的1mol/lhcl终止反应。再加入1.2ml冷冻后的乙酸乙酯，均匀混合15s，离心(3500r/min，5min)后取出0.8ml酯层转入另一试管中，在120℃的烘箱中经1h烘干，再将它重新溶于0.8ml的去离子水中，在228nm处测定吸光值。
酶活单位定义：1单位酶活定义为在37℃、1min内催化hhl形成1umol马尿酸的酶量。
其中，抑制率计算式如下：抑制率（%）=（oda-odb）/(oda-odc)
odb为存在抑制剂与酶时的吸光值；oda为不存在抑制剂时的吸光值（去离子水代替水解液）；odc为抑制剂与酶都不存在时的吸光值（用去离子水代替水解液，并在反应前加盐酸终止反应）。
豌豆蛋白降压肽对ace酶抑制率为39.2%。