本发明涉及一种米尔贝霉素的发酵工艺，属于生物制药技术领域，特别涉及到用微生物液体深层发酵技术生产米尔贝霉素的方法。
背景技术：
米尔贝霉素(milbemycin)是一系列十六元大环内酯类抗生素的混合物，由吸水链霉菌(streptomyceshygroscopicus)经发酵产生。米尔贝霉素的20多种组分中大多数对农业害虫具有广谱防治活性，如蚜、螨、黄褐天幕毛虫、肠道寄生虫以及其他危害作物及家畜的寄生虫，尤其对各种螨类都有较高的防治效果。米尔贝霉素具有对害虫作用强烈，用药量少，对人畜安全，不污染环境，只杀害虫，不杀害虫天敌，也不易产生抗药性的特点，是一种非常有前途的广谱、高效、新型无交叉抗性的生物杀虫剂。
在米尔贝霉素系列药物中，由于米尔贝霉素a3、a4的生物活性较强，产量较高，所以米尔贝霉素产品的商业化都围绕着米尔贝霉素a3、a4来进行。除了米尔贝霉素a3、a4的混合物广泛被用作杀螨剂以外，米尔贝霉素a3、a4的半合成肟化产物，米尔贝肟(milbemycinoxime，米尔贝肟，cas号:129496-10-2)，是一种新型的大环内脂类驱虫药，对体内体外寄生虫均有良好的驱杀作用，对控制和预防大部分常见的宠物寄生虫病都有很好的效果。米尔贝肟尤其是以其低毒高效的特点被公认为是一种广谱、高效、安全的驱虫药，特别是对一些对伊维菌素敏感的犬只更为安全。
米尔贝肟由米尔贝肟a3和米尔贝肟a4以一定比例混合组成，要求米尔贝肟a3+a4的含量不应小于95％，其中a3和a4的比例为(20±5)：(80±5)。米尔贝肟a3、a4的结构式如下式所示：
米尔贝肟a3(milbemycinoximea3)：r＝ch3
米尔贝肟a4(milbemycinoximea4)：r＝ch2ch3
工业上主要用吸水链霉菌(streptomyceshygroscopicus)发酵生产米尔贝霉素，在发酵过程中，米尔贝霉素a3、a4是被菌体同时产生的，以混合物的形式存在于发酵液中。由于a3、a4的结构和性质都非常相似，仅仅在c-25上的取代基不同，分别是甲基和乙基，从发酵液中分离出a3、a4单一组分非常困难，所以目前工业上一般都把a3、a4视为同一组分，一起从发酵液中提取分离出来，再经过氧化、肟化等一系列的半合成步骤后，最后经过分离纯化得到米尔贝肟成品。这就要求从一开始，发酵液中的米尔贝霉素a3与a4的比例就必须恰好是在(20±5)：(80±5)范围内，这样最后得到的米尔贝肟a3与a4的比例才能够符合要求。
目前国内米尔贝肟的发酵生产中遇到一个难题，每批发酵随着发酵进程的持续，米尔贝霉素总体发酵单位持续增长，但发酵中后期a3的发酵单位增长相对较慢，导致a3/a4的比例也在不断的下降，从发酵中期的1:3左右，到放罐前下降到1:7左右，而最终产品的要求是1:4左右，所以经常不得不在发酵单位还较低的时候就提前放罐。生产中遇到的这个难题就急需要找到一种方法，能够特异性的提高a3的产量，而不影响a4的产量，这样不仅能从整体上提高了米尔贝霉素的产量，而且还能够大大降低后续半合成生产米尔贝肟的难度，大幅度降低生产成本。
根据对米尔贝霉素α2、α4和d组分的400mhz13c核磁共振谱的解析，其配糖体骨架上的碳是从7个乙酸根和5个丙酸根衍生而来，与阿维菌素配糖体骨架的构成完全相同。所以根据阿维菌素合成途径(hikeda,somura.controlofavermectinbiosynthesisinstreptomycesavermitilisfortheselectiveproductionofausefulcomponent.《cheminform》,1996,27(1):549-62)来推断，米尔贝霉素a3组分的c-25位上的甲基取代基是由乙酸盐代谢衍生得到，a4组分的c-25位上的乙基取代基是由丙酸盐代谢衍生得到。
技术实现要素：
本发明在现有的发酵生产米尔贝霉素技术的基础上，通过在发酵过程中适量补加特定的前体物质乙酸钠，解决了发酵中后期米尔贝霉素a3产量增长缓慢的技术问题，提供了一种可以特异性增加米尔贝霉素a3发酵产量的工艺方法，从而提高了米尔贝霉素发酵产物中a3的比例。
本发明人通过研究发现，米尔贝霉素是吸水链霉菌的次级代谢产物，米尔贝霉素a3结构中的特异配基是来自于乙酸根的，而相对的，米尔贝霉素a4结构中的特异配基是来自于丙酸根，说明乙酸根有可能是米尔贝霉素a3生物合成的特异性前体物质，在发酵液中额外补加乙酸盐有可能增加米尔贝a3的合成，而不影响a4的合成，这样就可以通过在发酵液中适量添加乙酸钠的方法，增加a3的产量，而不增加a4产量，从而达到改善a3/a4比例的目的。本发明人通过实验证实，在发酵配方中适量添加乙酸钠能够小幅度提高米尔贝霉素a3的产量，同时对米尔贝霉素a4的产量基本没有影响。
在以上研究基础上，推测在米尔贝霉素的发酵培养基中适量添加乙酸根可以节省菌体自身合成乙酸根所需的时间和营养，从而提高a3的产量，但是通过实验发现，采用在发酵基础培养基中添加乙酸根的措施，提高a3产量的效果并不明显，而在发酵周期48h后，初级代谢基本完成，次级代谢占据主要地位的时候补加乙酸根则有较好的效果，尤其是分次每天补加或连续流加的效果更优。
在以上研究的基础上，通过以下技术手段实现米尔贝霉素a3发酵产量和比例的显著提高：
(1)斜面菌种培养：将吸水链霉菌(streptomyceshygroscopicus)菌种接种于斜面培养基，在温度27-29℃，湿度20-60％条件下培养10-12天，得到成熟的斜面菌种。斜面培养基配方为蔗糖0.4％，脱脂奶粉0.1％，酵母粉0.2％，蛋白胨0.1％，琼脂2.0％。
(2)液体种子培养：从成熟的斜面菌种刮取适量孢子接种于液体种子培养基中，在温度27-29℃，搅拌转速100-500rpm条件下培养40-48小时，得到成熟的种子液。液体种子培养基配方为蔗糖2％，脱脂奶粉0.1％，黄豆饼粉0.5％，蛋白胨0.5％，碳酸钙0.1％。
(3)液体发酵培养：将成熟的种子液按照4-12％的接种量接种至发酵培养基中，在温度27-29℃，搅拌转速100-600rpm的条件下发酵培养，发酵到120h后，取样测定罐上发酵液中蔗糖浓度，当蔗糖浓度降低到2.0％以下时，开始补蔗糖溶液，维持罐上发酵液中蔗糖的浓度在1.5-2.5％之间，放罐前12h停止补糖。发酵240-288h后结束发酵，得到含有米尔贝霉素的发酵液。液体发酵培养基配方为：蔗糖8％，脱脂奶粉1.0％，黄豆饼粉1.0％，蛋白胨1.0％，磷酸氢二钾0.5％，硫酸亚铁0.1％，硫酸锌0.01％，硫酸铜0.05％，钼酸钠0.05％，碳酸钙0.5％。
(4)发酵补前体：发酵到48h后，每天在发酵液中补入0.05％的乙酸钠，将乙酸钠配成5％浓度的溶液，灭菌后，每天按照发酵液体积的1％将乙酸钠溶液补入发酵罐中。
本发明技术方案如下：
一种提高米尔贝霉素发酵产物中米尔贝霉素a3含量的方法，包括发酵过程中，向发酵液中补入一定量的乙酸盐。
进一步地，所述乙酸盐包括乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵、乙酸锌等中的一种或几种，优选为乙酸钠。
进一步地，所述乙酸盐以溶液的形式添加；所用乙酸盐溶液的浓度一般为0.5％-20％(质量分数)；优选为浓度5％的乙酸钠溶液。
进一步地，发酵到48h时，每天在发酵液中补入一定量的乙酸盐(优选乙酸钠)溶液，直至发酵结束。
进一步地，每天向发酵液中补入的乙酸盐的量为0.01-0.1％(指所补入的乙酸盐在发酵液中的质量分数)，优选为0.05％。
进一步地，向发酵液中补入乙酸盐的方式为每天一次间歇补入或用连续流加的方式补入。
进一步地，当发酵液中总糖浓度降低到2.0％(质量分数，下同)以下时，开始补加蔗糖溶液，维持发酵液中总糖的浓度在1.5-2.5％之间。
进一步地，当发酵到120-150h后，检测发酵液中总糖浓度，当发酵液中总糖浓度降低到2.0％以下时，开始补加蔗糖溶液，维持发酵液中总糖的浓度在1.5-2.5％之间。
进一步地，放罐(结束发酵)前12h停止补加蔗糖。
进一步地，发酵240-288h后结束发酵。
进一步地，发酵条件包括：温度27-29℃，搅拌转速100-600rpm，通气量0.4-1.2vvm，控制发酵罐上溶氧值(do)≥30％。
一般地，可采用本领域常规产米尔贝霉素的微生物进行发酵，例如吸水链霉菌(streptomyceshygroscopicus)。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，即得本发明各较佳实例。
具体地，上述提高米尔贝霉素发酵产物中米尔贝霉素a3比例的方法，包括如下步骤：
1)斜面菌种培养
将吸水链霉菌(streptomyceshygroscopicus)菌种接种于斜面培养基，在温度27-29℃，湿度20-60％条件下培养10-12天，得到成熟的斜面菌种；
斜面培养基配方为：蔗糖0.4％，脱脂奶粉0.1％，酵母粉0.2％，蛋白胨0.1％，琼脂2.0％。
2)液体种子培养
从成熟的斜面菌种刮取适量孢子接种于液体种子培养基中，在温度27-29℃，搅拌转速100-500rpm条件下通气培养40-48小时，得到成熟的种子液；
或者，进一步将成熟的种子液按相同的方法再进行一次扩大培养；
液体种子培养基配方为：蔗糖2％，脱脂奶粉0.1％，黄豆饼粉0.5％，蛋白胨0.5％，碳酸钙0.1％；
一般地，种子液的接种量为1％-8％。
3)液体发酵培养
将成熟的种子液按照4-12％的接种量接种至发酵培养基中，在温度27-29℃，搅拌转速100-600rpm条件下通气发酵培养，通气量0.4-1.2vvm，控制发酵罐上溶氧值(do)≥30％；
液体发酵培养基配方为：蔗糖8％，脱脂奶粉1.0％，黄豆饼粉1.0％，蛋白胨1.0％，磷酸氢二钾0.5％，硫酸亚铁0.1％，硫酸锌0.01％，硫酸铜0.05％，钼酸钠0.05％，碳酸钙0.5％；
4)发酵到48h时，每天在发酵液中补入浓度为5％的乙酸钠溶液，每天补入乙酸钠的量为0.01-0.1％(指补入的乙酸钠在发酵液中的质量分数)，优选为0.05％，直至发酵结束；
补入乙酸钠溶液的方式为每天一次间歇补入或用连续流加的方式；
5)发酵到120-150h后，取样检测发酵液中总糖浓度，当总糖浓度降低到2.0％以下时，开始补蔗糖溶液，维持发酵液中总糖的浓度在1.5-2.5％之间，放罐前12h停止补糖，发酵240-288h后结束发酵，即可。
本发明还包括上述方法所制得的发酵产物。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种特异性提高米尔贝霉素a3发酵产量的方法，而对米尔贝霉素a4的产量基本无影响，所以提高了米尔贝霉素a3组分在最终产物中的比例。本发明的工艺方法解决了传统米尔贝霉素发酵中后期米尔贝霉素a3发酵产量增长缓慢的问题，使得米尔贝霉素a3和a4能够同步增长，提高了发酵后期发酵产物中米尔贝霉素a3的比例，从而延长了发酵周期，显著提高了米尔贝霉素的发酵产量。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
以下所用斜面菌种培养：将吸水链霉菌(streptomyceshygroscopicus)的菌种接种于斜面培养基，在温度27-29℃，湿度20-60％条件下培养10-12天，得到成熟的斜面菌种。斜面培养基配方为：蔗糖0.4％，脱脂奶粉0.1％，酵母粉0.2％，蛋白胨0.1％，琼脂2.0％。
以下所用液体种子培养基配方为：蔗糖2％，脱脂奶粉0.1％，黄豆饼粉0.5％，蛋白胨0.5％，碳酸钙0.1％。
以下所用液体发酵培养基配方为：蔗糖8％，脱脂奶粉1.0％，黄豆饼粉1.0％，蛋白胨1.0％，磷酸氢二钾0.5％，硫酸亚铁0.1％，硫酸锌0.01％，硫酸铜0.05％，钼酸钠0.05％，碳酸钙0.5％。
实施例1
(1)取生长好的菌种斜面，刮取约0.5cm×0.5cm斜面上的孢子接种到500ml种子摇瓶中，种子摇瓶装量为50ml，接种好的种子摇瓶在转速为180rpm的摇床上28℃培养48h。
(2)将培养好摇瓶种子按照8％的接种量接种至5l玻璃发酵罐上，发酵罐的装量为2.5l，发酵罐培养条件为罐温28℃，通气量0.8vvm，搅拌转速200rpm，发酵过程中通过提高搅拌转速，控制发酵罐上溶氧值(do)≥30％。
(3)发酵培养到48h时，开始补灭菌好的5％浓度的乙酸钠溶液，每天补一次，每次补25ml，即在发酵到48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h、216h时各补入一次乙酸钠。
(4)发酵培养到150h时，开始流加补蔗糖溶液，通过调节补糖速度控制发酵液中蔗糖浓度在1.5-2.5％之间，228h时停止补糖。
(5)发酵培养到240h时结束培养，取发酵液检测，发酵液中总的米尔贝霉素的含量为1.88g/l，其中米尔贝霉素a3含量为0.37g/l，a3：a4＝1：4.08。
以同批次不补加乙酸钠的发酵液为对照，其培养到240h时发酵液中总的米尔贝霉素的含量为1.79g/l，其中米尔贝霉素a3的含量为0.25g/l，a3：a4＝1：6.16。
说明本批补乙酸钠的发酵工艺能够提高米尔贝霉素a3的产量约48％，而且将a3与a4的比例从1：6左右提高1：4左右，达到了最终产品米尔贝肟的要求，大大降低了米尔贝肟的生产成本。
实施例2
(1)取生长好的菌种斜面，刮取约0.5cm×0.5cm斜面上的孢子接种到500ml种子摇瓶中，种子摇瓶装量为50ml，接种好的种子摇瓶在转速为180rpm的摇床上28℃培养48h。
(2)将培养好摇瓶种子按照1％的接种量接种至10l不锈钢种子罐上，种子罐的装量为5.0l，种子罐培养条件为罐温28℃，通气量1.0vvm，搅拌转速100rpm，培养过程中通过提高搅拌转速，控制种子罐上溶氧值(do)≥30％，种子罐培养时间为24h。
(3)将培养好种子罐种子液按照8％的接种量接种至50l发酵罐上，发酵罐的装量为30l，发酵罐培养条件为罐温28℃，通气量0.8vvm，搅拌转速100rpm，培养过程中通过提高搅拌转速，控制发酵罐上溶氧值(do)≥30％。
(4)发酵培养到48h时，开始补灭菌好的5％浓度的乙酸钠溶液，用匀速流加补料的方式，补入量为300ml/天，288h时停止补乙酸钠。
(5)发酵培养到150h时，开始流加补蔗糖溶液，通过调节补糖速度控制发酵液中蔗糖浓度在1.5-2.5％之间，276h时停止补糖。
(6)发酵培养到288h时结束培养，取发酵液检测，发酵液中米尔贝霉素的含量为2.17g/l，其中米尔贝霉素a3含量为0.42g/l，a3：a4＝1：4.17。
以同批次不补加乙酸钠的发酵液为对照，其培养到288h时发酵液中总的米尔贝霉素的含量为2.03g/l，其中米尔贝霉素a3的含量为0.26g/l，a3：a4＝1：6.81。
表明本批补乙酸钠的发酵工艺能够提高米尔贝霉素a3的产量约62％，而且将a3与a4的比例从1：7左右提高1：4左右，也达到了最终产品米尔贝肟的要求，无需再分离出a3、a4的单一组分，大大降低了米尔贝肟的生产难度和生产成本。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。