本发明涉及生物制品技术,尤其是涉及一种乙型肝炎病毒血清样本保存稀释液,本发明还涉及该保存稀释液的制备方法。
背景技术
乙型肝炎血清稀释样本多用于试剂盒质控及第三方质控。乙型肝炎病毒简称乙肝病毒,是一种dsdna病毒,属于嗜肝dna病毒科。乙肝病毒的基因组(dna)是由两条螺旋的dna链围成的一个环形结构。其中一条较长负链已经形成完整的环状;另一条长度较短的正链,呈半环状。导致dna降解的物质包括水和可消化dna的核酸酶。这两样物质在自然界里无处不在。引起dna降解的因素很多,如外界物理因素、化学因素、生物因素等。
常规的乙型肝炎血清保存稀释液主要有:1、人类阴性血清、血浆;2、depc水、dnasin等;3、用液氮或低温保存。其缺点为:1、保存效果差,易出血降解;2、稀释后样本需要立即进行低温保存。因此,开发一种类似人类血清状态的保持乙型肝炎血清样本稳定的保存稀释液,具有重要的意义。
技术实现要素:
本发明的目的在于提供一种可有效保护乙肝病毒核酸物质结构不受破坏的乙型肝炎病毒血清样本保存稀释液,本发明还提供该保存稀释液的制备方法。
为实现上述目的,本发明可采取下述技术方案:
本发明所述的乙型肝炎病毒(hbvdna)血清样本保存稀释液,其成分包括trise-hcl、nacl、bsa、硫酸庆大霉素、p-300、日落黄、柠檬黄和去离子纯化水;以1l去离子纯化水计,各成分含量为trise-hcl0.01mol,nacl8.8g,bsa20g,硫酸庆大霉素0.68ml,p-3002.0ml,日落黄0.01g,柠檬黄0.01g。
本发明乙型肝炎病毒血清样本保存稀释液的制备方法为:
第一步,量取适量的去离子纯化水;
第二步,将准确计量的trise-hcl、nacl、bsa、硫酸庆大霉素、p-300、日落黄、柠檬黄依次加入去离子纯化水中搅拌均匀;
第三步,调节溶液的ph至7.8~8.2后定容至1l;
第四步,密封后高压灭菌(121℃,15min),然后2~8℃保存备用。
本发明的优点在于成分少,制备方法简单,配制完成的成品保存稀释液可保护病毒核酸物质结构不受破坏,抑制dnase活性,有效保护病毒的dna免受降解,具有稳定、易保存、便捷等优点,适用于乙型肝炎病毒(hbvdna)血清样本的保存和稀释。试验证明,在乙型肝炎病毒(hbvdna)血清样本加入本发明配制的保存稀释液后,dna、rna可以完全好的在37℃下保存1周,在20-25℃下保存1个月,在4℃下保存6个月,在-20℃或-80℃下长期保存。
附图说明
图1显示对照组pcr扩增检测图。
图2显示实验组pcr扩增检测图。
图3显示37℃环境中阴性血清稀释的hbv血清临床样本pcr扩增检测图。
图4显示37℃环境中稀释液稀释的hbv血清临床样本pcr扩增检测图。
图5显示室温环境中阴性血清稀释的hbv血清临床样本pcr扩增检测图。
图6显示室温环境中稀释液稀释的hbv血清临床样本pcr扩增检测图。
图7显示2-8℃环境中阴性血清稀释的hbv血清临床样本pcr扩增检测图。
图8显示2-8℃环境中稀释液稀释的hbv血清临床样本pcr扩增检测图。
图9显示-20℃环境中阴性血清稀释的hbv血清临床样本pcr扩增检测图。
图10显示-20℃环境中稀释液稀释的hbv血清临床样本pcr扩增检测。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明。其中实施例中所用的技术手段若无特殊指明,均为常规方法;涉及到的试剂与耗材若无特殊说明均可以通过商业途径获取。
实施例1制备乙型肝炎病毒血清样本保存稀释液
第一步,量取适量的去离子纯化水;
第二步,将准确计量的trise-hcl0.01mol/l、nacl8.8g、bsa20g、硫酸庆大霉素0.68ml、p-3002.0ml、日落黄0.01g、柠檬黄0.01g依次加入去离子纯化水中并搅拌均匀;
第三步,调节溶液的ph至7.8~8.2后加去离子纯化水定容至1l;
第四步,密封后高压灭菌(121℃,15min),然后2~8℃保存。
实施例2稀释临床样本实验
1、仪器、试剂和样本
主要仪器:干式恒温金属浴、flex提取仪、生物安全柜、移液器、宏石实时荧光定量pcr仪等。
主要试剂:中山大学达安基因股份有限公司的乙型肝炎病毒核酸测定试剂盒(pcr-荧光探针法)。
样本:新鲜的hbv临床阳性样本。
2、实施方案
用实施例1配制的病毒血清样本保存稀释液将hbv阳性样本稀释5倍、50倍、500倍、5000倍。设计对照组合实验组两种稀释液,用中山大学达安基因股份有限公司的乙型肝炎病毒核酸测定试剂盒(pcr-荧光探针法)对两组不同稀释液稀释的样本进行提取扩增。
对照组:阴性血清稀释液和hbv阳性样本。
实验组:本发明病毒血清样本保存稀释液和hbv阳性样本。
3、实验结果
pcr扩增检测图见图1、图2。
表1hbv阳性样本的检测结果
实验结果表明,用本发明配制的病毒血清样本保存稀释液稀释的hbv阳性样本,扩增曲线呈典型的s曲线,稀释的浓度梯度间隔较好,适用于临床血清血浆样本的稀释。
实施例3保存稳定性测试
1、仪器、试剂和样本
主要仪器:干式恒温金属浴、flex提取仪、生物安全柜、移液器、宏石实时荧光定量pcr仪等。
主要试剂:中山大学达安基因股份有限公司的乙型肝炎病毒核酸测定试剂盒(pcr-荧光探针法)
样本:新鲜的hcv假病毒样本
2、实验方案
用实施例1配制的乙型肝炎病毒(hbvdna)血清样本保存稀释液将hbv阳性样本稀释100倍、1000倍,作为中、低浓度测试样本,分别标记为p1、p2。分别于-20±5℃环境中、2-8℃环境中、室温(20-25℃)环境中和37℃环境中放置,本实验设计如下:把稀释后的样本做好标记,分别放入指定环境中,按指定周期进行检验,具体如下:①-20±5℃环境中,3个月或半年检测一次;②2-8℃环境中,每7天检测一次,检测35天;③室温(20-25℃)环境中,每3天检测一次,检测10天;④37℃环境中,每隔一天检测一次,检测7天。用试剂盒进行提取。
对照组:放置-80℃环境中阴性血清稀释的样本,放置-80℃环境中本发明保存稀释液稀释的样本。
实验组:本发明配制的乙型肝炎病毒(hbvdna)核酸血清样本保存稀释液稀释的样本分别放置-20-20±5℃环境中、2-8℃环境中、室温(20-25℃)环境中和37℃环境中。
3、实验结果
表2-20±5℃环境中阴性血清稀释样本的稳定性检测结果(见图3)
结论:从图3和表2可以看出:在-20±5℃环境中阴性血清稀释样本放置24个月两个浓度样本浓度值和线性稳定性较稳定。
表3-20±5℃环境中稀释液稀释样本的稳定性检测结果(见图4)
表42-8℃环境中阴性血清稀释样本的稳定性检测结果(见图5)
结论:从图5和表4可以看出:在2-8℃环境中阴性血清稀释样本放置35天两个浓度样本浓度值和线性稳定性较稳定。
表52-8℃环境中稀释液稀释样本的稳定性检测结果(见图6)
结论:从图6和表5可以看出:在2-8℃环境中稀释液稀释样本放置35天两个浓度样本浓度值和线性稳定性较好。
表6(20-25℃)室温环境中阴性血清稀释样本的稳定性检测结果(见图7)
结论:从图7和表6可以看出:在(20-25℃)室温环境中阴性血清稀释样本放置10天两个浓度样本浓度值和线性稳定性较稳定。
表7(20-25℃)室温环境中稀释液稀释样本的稳定性检测结果(见图8)
结论:从图8和表7可以看出:在(20-25℃)室温环境中稀释液稀释样本放置10天两个浓度样本浓度值和线性稳定性较稳定。
表837℃环境中阴性血清稀释样本的稳定性检测结果(见图9)
结论:从图9和表8可以看出:从图9和表8可以看出:在37℃环境中阴性血清稀释样本放置7天两个浓度样本浓度值和线性稳定性均较稳定。
表937℃环境中稀释液稀释样本的稳定性检测结果(见图10)
结论:从图10和表9可以看出:在37℃环境中稀释液稀释样本放置7天两个浓度样本浓度值和线性稳定性均较稳定。
通过以上实验可以看出:用本发明制备的乙型肝炎病毒(hbvdna)血清样本保存稀释液保存的hbv样本稳定性较好,完全可以替代阴性血清稀释乙型肝炎病毒(hbvdna)血清样本保存。