本发明涉及植物有效成分提取
技术领域：
，具体涉及一种白藜芦醇的生物提取工艺。
背景技术：
：白藜芦醇是一种具有芪类结构的非黄酮类多酚化合物，主要存在于葡萄、花生、桑葚和虎杖等植物中，在医药领域用于抗癌、抗炎和抗过敏、抗风湿、预防心血管疾病等；在美容行业用于制成降脂美容和减肥天然保健食品；在酒类中利用其抗氧化、抗自由基的特性，降低酒精中毒的风险。白藜芦醇在植物中含量较低，且植物提取物的成分复杂，除目标成分外，大多还含有黄酮类、酚酸类物质。因此，要得到高纯度的白藜芦醇，需要选择合适的提取方法。国内外对白藜芦醇进行了大量的研究，白藜芦醇的提取方法根据样品类型而定，提取方法有很多，如浸渍法、回流提取等。近年来出现了超声波辅助提取、微波提取、酶法提取、减压沸腾提取等提取方法。目前国内企业生产白藜芦醇的经典工艺路线是：虎杖药材—发酵—醇提浓缩—干柱柱层析(硅胶或氧化铝)—活性炭脱色—结晶与重结晶。此工艺路线的最终产品白藜芦醇的收率一般只有0.3-0.5％，颜色略带米黄或灰白色，白藜芦醇的纯度均在95-98％，其价格与纯度为99％的白藜芦醇有较大的差距。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题在于提供一种高纯度白藜芦醇的生物提取工艺。本发明所要解决的技术问题采用以下的技术方案来实现：一种白藜芦醇的生物提取工艺，包括以下步骤：(1)粉碎：采用真空低温冷风干燥机于30-32℃，将新鲜的虎杖干燥至含水量为27-30％，然后在粉碎机中粉碎成粒径为150-180目的原料粉末；(2)发酵：向原料粉末中加入2-3倍量水浸润5-10h，再添加纤维素酶、果胶酶、酿酶混合均匀，密封发酵5-10天，得发酵液；将发酵液用乙醇、乙酸乙酯混合溶液提取2-4次，每次提取1-2h，提取温度为60-80℃，将提取液进行离心处理，转速为220-260r/min；(3)沉淀：向提取液中加入沉淀剂搅拌均匀，放置2-3h，过滤除去沉淀，得澄清液；(4)酶解：向澄清液中加入醋酸钠调节ph值为4.5-5.1，再加入超氧化物歧化酶、β-葡萄糖苷酶、糖化酶进行酶解，控制温度为43-58℃，酶解5-10h，得酶解液；(5)纯化：向步骤4中的酶解液中加入纯化剂，80-90℃搅拌1-3h，过滤，所得滤液减压浓缩至溶剂完全回收，于40-45℃真空干燥至恒重，即得到白藜芦醇成品。所述纤维素酶、果胶酶、酿酶的质量比为5-10：5-10：1-5。所述乙醇、乙酸乙酯的体积比为10：1-5。所述沉淀剂的制备方法如下：利用20-25℃去离子水配制酒石酸饱和溶液，并通过硫酸调节ph值稳定在4-4.5，加入黄酮醇和钛酸四乙酯，加热至回流状态保温搅拌1-3h，所得混合物经自然冷却至室温后送入冷冻干燥机中，干燥所得固体经超微粉碎机制成微粉，即得沉淀剂。所述酒石酸、黄酮醇、钛酸四乙酯的质量比为15-20：10-15：1-3。所述超氧化物歧化酶、β-葡萄糖苷酶、糖化酶的质量比为5-10：1-5：1-5。所述纯化剂的制备方法如下：将蒙脱土加入到去离子水中，加热至回流状态保温搅拌10-20min，加入十一烷基咪唑啉继续回流搅拌10-30min，然后降温至40-50℃，加入羟丙基甲基纤维素和钛酸四乙酯，40-50℃搅拌20-30min，接着加入丙烯酸，继续搅拌1-2h，过滤，所得沉淀用去离子水和无水乙醇洗去杂质，送入烘干箱中，干燥至恒重即得到纯化剂。所述蒙脱土、十一烷基咪唑啉、羟丙基甲基纤维素、钛酸四乙酯、丙烯酸的质量比为10-15：1-5：15-30：1-3：10-20。所述羟丙基甲基纤维素的分子量为50000-100000。本发明所涉及的反应原理如下：(1)酒石酸、黄酮醇通过酯化反应生成了沉淀剂，该沉淀剂能将白藜芦醇中的大分子杂质沉淀下来，达到初步提纯的目的，同时沉淀剂可以保护白藜芦醇不受到有机溶剂、高温等外界因素的破坏；(2)十一烷基咪唑啉和蒙脱土发生阳离子交换反应，进入到蒙脱土中，蒙脱土片层表面被烷基长链覆盖，增强了蒙脱土对有机原料的亲和性，同时较长的烷基分子链在片层间以一定的方式排列，可使片层间距增加，有利于大分子有机物的插层；(3)对羟丙基甲基纤维素、丙烯酸在催化剂的作用下发生酯化反应，但反应温度过低时，反应效率过低，温度过高时，纤维素容易分解，同样影响反应的效率；改性过后的蒙脱土可以对上述酯化反应起到活化作用，使其在常规温度下就可发生反应，反应高效；同时被烷基长链覆盖的蒙脱土片层结构限定了酯化反应进行的方向，使酯化产物整齐的吸附在蒙脱土片层中，对色素、杂质有优异的吸附效果，可以提高白藜芦醇的提取率。本发明的有益效果是：(1)本发明以酒石酸、黄酮醇通过酯化反应生成的沉淀剂能够初步将白藜芦醇中的大分子杂质沉淀下来，提高白藜芦醇的纯度；同时沉淀剂可以防止在提纯过程中，白藜芦醇被外界环境所破坏，提高提取效率；(2)对羟丙基甲基纤维素、丙烯酸合成的产物分布在蒙脱土的片层结构中，通过蒙脱土中交替重叠的片层结构，能够有效的将白藜芦醇中的小分子杂质、色素吸附下来，显著的提高了白藜芦醇的纯度；(3)本发明工艺简单、环保、成本低，适合工业生产，提高了资源的利用率。具体实施方式：为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。实施例1(1)粉碎：采用真空低温冷风干燥机于30-32℃，将20kg新鲜的虎杖干燥至含水量为27-30％，然后在粉碎机中粉碎成粒径为150目的原料粉末；(2)发酵：向原料粉末中加入2倍量水浸润10h，再添加5g纤维素酶、5g果胶酶、3g酿酶混合均匀，密封发酵5天，得发酵液；将发酵液用乙醇、乙酸乙酯混合溶液提取2次，每次提取1h，提取温度为60℃，将提取液进行离心处理，转速为220r/min；(3)沉淀：向提取液中加入10g沉淀剂搅拌均匀，放置2h，过滤除去沉淀，得澄清液；(4)酶解：向澄清液中加入醋酸钠调节ph值为4.5-5.1，再加入6g超氧化物歧化酶、4gβ-葡萄糖苷酶、4g糖化酶进行酶解，控制温度为43℃，酶解5h，得酶解液；(5)纯化：向步骤4中的酶解液中加入12g纯化剂，80℃搅拌1h，过滤，所得滤液减压浓缩至溶剂完全回收，于40℃真空干燥至恒重，即得到白藜芦醇成品。沉淀剂的制备：利用20-25℃去离子水配制酒石酸饱和溶液(酒石酸的质量为12g)，并通过硫酸调节ph值稳定在4-4.5，加入12g黄酮醇和1g钛酸四乙酯，加热至回流状态保温搅拌2h，所得混合物经自然冷却至室温后送入冷冻干燥机中，干燥所得固体经超微粉碎机制成微粉，即得到沉淀剂。纯化剂的制备：将10g蒙脱土加入到去离子水中，加热至回流状态保温搅拌10min，加入2g十一烷基咪唑啉继续回流搅拌15min，然后降温至40℃，加入20g羟丙基甲基纤维素和2g钛酸四乙酯，40℃搅拌20min，接着加15g入丙烯酸，继续搅拌1h，过滤，所得沉淀用去离子水和无水乙醇洗去杂质，送入烘干箱中，干燥至恒重即得到纯化剂。实施例2(1)粉碎：采用真空低温冷风干燥机于30-32℃，将20kg新鲜的虎杖干燥至含水量为27-30％，然后在粉碎机中粉碎成粒径为150目的原料粉末；(2)发酵：向原料粉末中加入2倍量水浸润10h，再添加5g纤维素酶、5g果胶酶、3g酿酶混合均匀，密封发酵5天，得发酵液；将发酵液用乙醇、乙酸乙酯混合溶液提取2次，每次提取1h，提取温度为60℃，将提取液进行离心处理，转速为220r/min；(3)沉淀：向提取液中加入10g沉淀剂搅拌均匀，放置2h，过滤除去沉淀，得澄清液；(4)酶解：向澄清液中加入醋酸钠调节ph值为4.5-5.1，再加入6g超氧化物歧化酶、4gβ-葡萄糖苷酶、4g糖化酶进行酶解，控制温度为43℃，酶解5h，得酶解液；(5)纯化：向步骤4中的酶解液中加入12g纯化剂，80℃搅拌1h，过滤，所得滤液减压浓缩至溶剂完全回收，于40℃真空干燥至恒重，即得到白藜芦醇成品。沉淀剂的制备：利用20-25℃去离子水配制酒石酸饱和溶液(酒石酸的质量为12g)，并通过硫酸调节ph值稳定在4-4.5，加入12g黄酮醇和1g钛酸四乙酯，加热至回流状态保温搅拌2h，所得混合物经自然冷却至室温后送入冷冻干燥机中，干燥所得固体经超微粉碎机制成微粉，即得到沉淀剂。纯化剂的制备：将10g蒙脱土加入到去离子水中，加热至回流状态保温搅拌10min，加入2g十一烷基咪唑啉继续回流搅拌15min，然后降温至40℃，加入20g羟丙基甲基纤维素和2g钛酸四乙酯，40℃搅拌20min，接着加15g入丙烯酸，继续搅拌1h，过滤，所得沉淀用去离子水和无水乙醇洗去杂质，送入烘干箱中，干燥至恒重即得到纯化剂。对照例1(1)粉碎：采用真空低温冷风干燥机于30-32℃，将20kg新鲜的虎杖干燥至含水量为27-30％，然后在粉碎机中粉碎成粒径为150目的原料粉末；(2)发酵：向原料粉末中加入2倍量水浸润10h，再添加5g纤维素酶、5g果胶酶、3g酿酶混合均匀，密封发酵5天，得发酵液；将发酵液用乙醇、乙酸乙酯混合溶液提取2次，每次提取1h，提取温度为60℃，将提取液进行离心处理，转速为220r/min；(3)沉淀：向提取液中加入10g沉淀剂搅拌均匀，放置2h，过滤除去沉淀，得澄清液；(4)酶解：向澄清液中加入醋酸钠调节ph值为4.5-5.1，再加入6g超氧化物歧化酶、4gβ-葡萄糖苷酶、4g糖化酶进行酶解，控制温度为43℃，酶解5h，得酶解液；(5)纯化：向步骤4中的酶解液中加入12g纯化剂，80℃搅拌1h，过滤，所得滤液减压浓缩至溶剂完全回收，于40℃真空干燥至恒重，即得到白藜芦醇成品。沉淀剂的制备：利用20-25℃去离子水配制酒石酸饱和溶液(酒石酸的质量为12g)，并通过硫酸调节ph值稳定在4-4.5，加入1g钛酸四乙酯，加热至回流状态保温搅拌2h，所得混合物经自然冷却至室温后送入冷冻干燥机中，干燥所得固体经超微粉碎机制成微粉，即得到沉淀剂。纯化剂的制备：将10g蒙脱土加入到去离子水中，加热至回流状态保温搅拌10min，加入2g十一烷基咪唑啉继续回流搅拌15min，然后降温至40℃，加入20g羟丙基甲基纤维素和2g钛酸四乙酯，40℃搅拌20min，接着加15g入丙烯酸，继续搅拌1h，过滤，所得沉淀用去离子水和无水乙醇洗去杂质，送入烘干箱中，干燥至恒重即得到纯化剂。对照例2(1)粉碎：采用真空低温冷风干燥机于30-32℃，将20kg新鲜的虎杖干燥至含水量为27-30％，然后在粉碎机中粉碎成粒径为150目的原料粉末；(2)发酵：向原料粉末中加入2倍量水浸润10h，再添加5g纤维素酶、5g果胶酶、3g酿酶混合均匀，密封发酵5天，得发酵液；将发酵液用乙醇、乙酸乙酯混合溶液提取2次，每次提取1h，提取温度为60℃，将提取液进行离心处理，转速为220r/min；(3)沉淀：向提取液中加入10g沉淀剂搅拌均匀，放置2h，过滤除去沉淀，得澄清液；(4)酶解：向澄清液中加入醋酸钠调节ph值为4.5-5.1，再加入6g超氧化物歧化酶、4gβ-葡萄糖苷酶、4g糖化酶进行酶解，控制温度为43℃，酶解5h，得酶解液；(5)纯化：向步骤4中的酶解液中加入12g纯化剂，80℃搅拌1h，过滤，所得滤液减压浓缩至溶剂完全回收，于40℃真空干燥至恒重，即得到白藜芦醇成品。沉淀剂的制备：利用20-25℃去离子水配制酒石酸饱和溶液(酒石酸的质量为12g)，并通过硫酸调节ph值稳定在4-4.5，加入12g黄酮醇和1g钛酸四乙酯，加热至回流状态保温搅拌2h，所得混合物经自然冷却至室温后送入冷冻干燥机中，干燥所得固体经超微粉碎机制成微粉，即得到沉淀剂。纯化剂的制备：将10g蒙脱土加入到去离子水中，加热至回流状态保温搅拌25min，然后降温至40℃，加入20g羟丙基甲基纤维素和2g钛酸四乙酯，40℃搅拌20min，接着加15g入丙烯酸，继续搅拌1h，过滤，所得沉淀用去离子水和无水乙醇洗去杂质，送入烘干箱中，干燥至恒重即得到纯化剂。对照例3(1)粉碎：采用真空低温冷风干燥机于30-32℃，将20kg新鲜的虎杖干燥至含水量为27-30％，然后在粉碎机中粉碎成粒径为150目的原料粉末；(2)发酵：向原料粉末中加入2倍量水浸润10h，再添加5g纤维素酶、5g果胶酶、3g酿酶混合均匀，密封发酵5天，得发酵液；将发酵液用乙醇、乙酸乙酯混合溶液提取2次，每次提取1h，提取温度为60℃，将提取液进行离心处理，转速为220r/min；(3)沉淀：向提取液中加入10g沉淀剂搅拌均匀，放置2h，过滤除去沉淀，得澄清液；(4)酶解：向澄清液中加入醋酸钠调节ph值为4.5-5.1，再加入6g超氧化物歧化酶、4gβ-葡萄糖苷酶、4g糖化酶进行酶解，控制温度为43℃，酶解5h，得酶解液；(5)纯化：向步骤4中的酶解液中加入12g纯化剂，80℃搅拌1h，过滤，所得滤液减压浓缩至溶剂完全回收，于40℃真空干燥至恒重，即得到白藜芦醇成品。沉淀剂的制备：利用20-25℃去离子水配制酒石酸饱和溶液(酒石酸的质量为12g)，并通过硫酸调节ph值稳定在4-4.5，加入12g黄酮醇和1g钛酸四乙酯，加热至回流状态保温搅拌2h，所得混合物经自然冷却至室温后送入冷冻干燥机中，干燥所得固体经超微粉碎机制成微粉，即得到沉淀剂。纯化剂的制备：将10g蒙脱土加入到去离子水中，加热至回流状态保温搅拌10min，加入2g十一烷基咪唑啉继续回流搅拌15min，然后降温至40℃，过滤，所得沉淀用去离子水和无水乙醇洗去杂质，送入烘干箱中，干燥至恒重即得到纯化剂。对照例4(1)粉碎：采用真空低温冷风干燥机于30-32℃，将20kg新鲜的虎杖干燥至含水量为27-30％，然后在粉碎机中粉碎成粒径为150目的原料粉末；(2)发酵：向原料粉末中加入2倍量水浸润10h，再添加5g纤维素酶、5g果胶酶、3g酿酶混合均匀，密封发酵5天，得发酵液；将发酵液用乙醇、乙酸乙酯混合溶液提取2次，每次提取1h，提取温度为60℃，将提取液进行离心处理，转速为220r/min；(3)沉淀：向提取液中加入10g沉淀剂搅拌均匀，放置2h，过滤除去沉淀，得澄清液；(4)酶解：向澄清液中加入醋酸钠调节ph值为4.5-5.1，再加入6g超氧化物歧化酶、4gβ-葡萄糖苷酶、4g糖化酶进行酶解，控制温度为43℃，酶解5h，得酶解液；(5)纯化：向步骤4中的酶解液中加入12g纯化剂，80℃搅拌1h，过滤，所得滤液减压浓缩至溶剂完全回收，于40℃真空干燥至恒重，即得到白藜芦醇成品。沉淀剂的制备：利用20-25℃去离子水配制酒石酸饱和溶液(酒石酸的质量为12g)，并通过硫酸调节ph值稳定在4-4.5，加入12g黄酮醇和1g钛酸四乙酯，加热至回流状态保温搅拌2h，所得混合物经自然冷却至室温后送入冷冻干燥机中，干燥所得固体经超微粉碎机制成微粉，即得到沉淀剂。纯化剂：蒙脱土。实施例3以实施例1为基础，设置不添加黄酮醇的对照例1、不添加十一烷基咪唑啉的对照例2、仅以改性蒙脱土为纯化剂的对照例3、以蒙脱土为纯化剂的对照例4。利用实施例1-2、对照例1-4进行白藜芦醇的提取，所得白藜芦醇的含量和纯度如表1所示。表1白藜芦醇的含量和纯度组别白藜芦醇的含量(g)白藜芦醇的纯度(％)实施例189899.8实施例289999.9对照例184596.3对照例283395.1对照例380989.6对照例475883.2以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。当前第1页12