一种与食管鳞癌及其分级相关的生物标志物的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及一种与食管鳞癌及其分级相关的生物标志物，具体的涉及的生物标志物为rp11-25g10.2。

背景技术

食管癌是世界范围内同时也是我国最常见的恶性上皮性肿瘤之一，全世界每年发病人数超过48万，仅中国就近26万例，严重危害着人类健康。我国食管癌发病有着非常特殊的地域特征，主要分布于太行山区附近，以河南地区高发。目前针对食管癌的治疗如手术切除、放射治疗、化学治疗及其它综合治疗虽然有一定的治疗效果，但患者的5年生存率仍然低下，肿瘤侵袭转移仍是导致患者死亡的主要原因，同时也是导致临床疗效和患者预后差的重要因素。

肿瘤的分级对患者的预后具有重要的作用，恶性肿瘤一般根据其分化程度的高低、异型性的大小及核分裂像的多少来确定恶性程度的级别。近年来较多的人倾向于用简明的、较易掌握的三级分级法，即ⅰ级为分化良好的，属低度恶性；ⅱ级为分化中等的，属中度恶性；ⅲ级为分化低的，属高度恶性。这种分级法虽有其优点，对临床治疗和判断预后也有一定意义。但缺乏定量标准，也不能排除主观因素的影响。随着分子生物学的发展，人们把开始关注基因与肿瘤的相关性，探讨基因评估食管鳞癌发展的进程，对于有效的预防和治疗食管鳞癌都具有重要的临床意义。

技术实现要素：

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与食管鳞癌及其分级相关的生物标志物，使用该标志物，可以判断患者是否患有食管鳞癌以及评估肿瘤的进程。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了检测rp11-25g10.2的试剂在制备诊断食管鳞癌或评估食管鳞癌危险程度的产品中的应用。

本发明的第二方面提供了检测rp11-25g10.2的试剂在制备评估食管鳞癌危险程度的产品中的应用，根据rp11-25g10.2的表达水平可以判断患者的肿瘤等级。与g1(i级)相比，rp11-25g10.2在g2(ii级)中呈现显著性上调，与g2相比，rp11-25g10.2在g3(iii级)中呈现显著性上调。

作为可选择的实施方式，对来自诊断为i级、iii级中间级肿瘤的对象的肿瘤细胞进行确定。用于本发明的细胞的非限制性的例子包括从所述对象新鲜分离的细胞、分离后冷冻的细胞、以及固定和/或包埋的细胞(如福尔马林固定的、石蜡包埋的(ffpe))。在一些实施方式中，所述细胞是食管细胞，如食管鳞癌细胞。

根据本发明第一方面或第二方面所述的应用，所述的试剂选自：

特异性识别rp11-25g10.2的探针；或

特异性扩增rp11-25g10.2的引物。

进一步，所述特异性扩增rp11-25g10.2的引物序列如seqidno.2～3所示。

本发明的第三方面提供了一种用于检测rp11-25g10.2的产品，所述产品包括检测rp11-25g10.2的试剂。其中所述产品包括(但不限于)芯片、试剂盒、核酸膜条。

进一步，所述试剂包括通过rt-pcr、实时定量pcr、原位杂交或芯片检测rp11-25g10.2表达水平的试剂。其中，所述用rt-pcr检测rp11-25g10.2表达水平的试剂至少包括一对特异扩增rp11-25g10.2基因的引物；所述用实时定量pcr检测rp11-25g10.2表达水平的试剂至少包括一对特异扩增rp11-25g10.2基因的引物；所述用原位杂交检测rp11-25g10.2表达水平的试剂包括：与rp11-25g10.2基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片检测rp11-25g10.2表达水平的试剂包括与rp11-25g10.2基因的核酸序列杂交的探针。

进一步，所述用实时定量pcr检测rp11-25g10.2表达水平的试剂至少包括一对特异性扩增rp11-25g10.2基因的引物，所述引物如seqidno.2和seqidno.3所示。

进一步，所述产品还包括用于配制反转录反应体系的试剂、用于配制qpcr反应体系的试剂和用于配制内参反应体系的试剂。

进一步，所述用于配制反转录反应体系的试剂还包括反转录酶、dntp混合液、核糖核酸酶抑制剂液、反转录缓冲液和无核酸酶纯水。

本发明的第四方面提供了本发明第三方面所述的产品的应用，用于制备诊断食管鳞癌的工具，或用于制备评估食管鳞癌危险程度的工具。

在本发明中，用于检测rp11-25g10.2的“样本”包括细胞、组织、脏器、体液(血液、淋巴液等)、消化液、咳痰、肺胞支气管清洗液、尿、粪便等。优选的，所述样本为组织、血液。在本发明的具体实施方式中，所述样本为组织。

本发明所述的产品可用于检测包括rp11-25g10.2基因在内的多个基因(例如，与食管鳞癌相关的多个基因)的表达水平。将食管鳞癌的多个标志物同时进行检测，可大大提高食管鳞癌诊断的准确率。

在本发明中，rp11-25g10.2包括野生型、突变型或其片段。rp11-25g10.2是一种长链非编码rna，由于它是非蛋白编码的，故不存在蛋白质产物。在本发明的具体实施方式中，一种代表性的转录该rna的基因序列如seqidno.1所示。

在本发明中，可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

本发明的rp11-461a8.4使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术。

在本发明中，术语“生物标志物”指代具有特异性生物学特性、生物化学特征或者方面的分子指示物，其可用于确定存在或不存在特定疾病或状况和/或特定疾病或状况的严重程度。

在本发明中，术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

所述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是dna，也可以是rna，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过pna(polyamidenucleicacid，肽核酸)、lna(注册商标，lockednucleicacid，bridgednucleicacid，交联化核酸)、ena(注册商标，2′-o,4′-c-ethylene-bridgednucleicacids)、gna(glycerolnucleicacid，甘油核酸)、tna(threosenucleicacid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。

术语“引物”表示寡核苷酸，不管是在纯化的限制性消化物中天然存在还是合成产生，当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下，即在存在核苷酸和诱导剂如dna聚合酶并在合适温度和ph下时它能作为合成起点。引物可以是单链或双链，并且必须足够长以在诱导剂存在下引发合成预期的延伸产物。引物的确切长度依赖于很多因素，其中包括温度、引物来源和使用方法。例如，对于诊断应用，依赖于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有15-25个或更多核苷酸，尽管它可以含有更少核苷酸。参与确定引物适当长度的因素对于本领域技术人员容易知道。

在本发明中，可以以不同方式实施和实现将标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选的，在数学上组合rp11-25g10.2和一种或多种其他标志物的测定水平，并将组合值与实际的诊断问题关联起来，可以通过任何适宜的现有技术生物信息学方法将标志物值与rp11-25g10.2的测定组合。

统计学方法

在本发明中，实验至少采用3次重复实验，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，使用spss18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当p<0.05时具有统计学意义。

本发明的优点和有益效果：

本发明选择rp11-25g10.2作为分子标志物，可以实现食管鳞癌的危险度高低的分级分层，从而指导医生对危险度高中低不同的食管鳞癌患者采取不同的治疗策略、手段及措施，不但可以避免过度治疗，也可以避免治疗强度不足，从而提高食管鳞癌患者的治疗效果，节约医疗资源和成本。

本发明利用rp11-25g10.2开发成检测试剂盒，检测快速方便、检测灵敏度、特异度高、成本低，可以满足绝大多数食管鳞癌病人的检测需求，应用范围广。

附图说明

图1是利用qpcr检测rp11-25g10.2在食管鳞癌组织中的表达情况；

图2是利用tcga数据库交叉验证rp11-25g10.2在食管鳞癌中的表达情况图。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，本领域技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。

下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。

实施例1筛选与食管鳞癌相关的基因标志物

1、样品收集

各收集60例食管鳞癌组织和癌旁组织，其中包括经组织学分级为i级(g1)的患者15例，组织学分级为ii级(g2)的患者25例，组织学分级为iii级(g3)的患者20例。患者术前未接受任何治疗。患者均知情同意，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意每组各取3例标本进行基因表达谱的检测分析，进行差异表达基因的筛选，并在各组全部标本中进行验证实验。

2、rna样品的制备(利用qiagen的组织rna提取试剂盒进行操作)

取出冻存于液氮中的组织样本，把组织样本放入已预冷的研钵中进行研磨，按照试剂盒中的说明书提取分离rna。具体如下：

1)加入trizol，室温放置5min；

2)加入氯仿0.2ml，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5-10min；

3)12000rpm离心15min，将上层水相移到另一新的离心管中(注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质)，加入等体积的-20℃预冷的异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10min；

4)12000rpm高速离15min后小心弃掉上清液，按1ml/mltrizol的比例加入75％depc乙醇洗涤沉淀(4℃保存)，洗涤沉淀物，振荡混匀，4℃，12000rpm离心5min；

5)弃去乙醇液体，室温下放置5min，加入depc水溶解沉淀；

6)用nanodrop2000紫外分光光度计测量rna纯度及浓度，冻存于-70℃冰箱。

3、构建cdna文库

使用ribo-zero试剂盒除去总rna中的核糖体rna，利用illuminatruseqtmrnasampleprepkit进行cdna文库的构建，具体操作按说明书进行。

4、上机测序

使用illuminax-ten测序平台对cdna文库进行测序，具体操作按说明书进行。

5、高通量转录组测序数据分析

对测序结果进行生物信息学分析，分析前，删除不易检测到的lncrna，使用工具为r-3.3.3进行linearbylinearassociationtest分析，根据每个lncrna的表达量的四分位数将每个样本划分到为4个表达量区间，然后检测表达量区间与tumorgrade的相关性。当p值<0.05时，认为基因显著差异表达。

6、结果

与食管鳞癌癌旁组织相比，rp11-25g10.2基因在食管鳞癌组织中的表达量显著上调，与g1相比，g2和g3中rp11-25g10.2的表达显著上调，与g2相比，g3中rp11-25g10.2的表达显著上调，提示rp11-25g10.2可能有效的区分食管鳞癌患者与非食管鳞癌，以及不同分化程度的食管鳞癌。

实施例2qpcr测序验证rp11-25g10.2基因的差异表达

1、对rp11-25g10.2基因差异表达进行大样本qpcr验证。

2、rna提取步骤如实施例1所述。

3、逆转录：

采用fastqμantcdna第一链合成试剂盒(货号：kr106)进行mrna反转录，首先去除基因组dna反应，在试管中加入5×gdnabμffer2.0μl，总rna1μg，加rnasefreeddh2o使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热3min，再将10×fastrtbμffer2.0μl，rtenzymemix1.0μl，fq-rtprimermix2.0μl，rnasefreeddh2o5.0μl，混合后加入上述试管中一起混合共20μl，水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min。

4、qpcr扩增检测

根据rp11-25g10.2和gapdh的序列设计qpcr扩增引物，由博迈德生物公司合成。具体引物序列如下：

rp11-25g10.2基因：

正向引物为5’-aagcactcacagacaata-3’(seqidno.2)；

反向引物为5’-catcaggtcagacatctt-3’(seqidno.3)。

管家基因gapdh的引物序列为：

正向引物：5’-ctctggtaaagtggatattgt-3’(seqidno.4)

反向引物：5’-ggtggaatcatattggaaca-3’(seqidno.5)

用superrealpremixplus(sybrgreen)(货号：fp205)，进行扩增，实验操作按产品说明书进行。

采用20μl反应体系：2×superrealpremixplus10μl，正反向引物(10μm)各0.6μl，5×roxreferencedye△2μl，dna模板2μl，灭菌蒸馏水4.8μl。每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。

扩增程序为：95°15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)×40个循环，95℃15s，60℃60s，95℃15s)。以sybrgreen作为荧光标记物，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，2^-δδct法进行相对定量。

6、结果

结果如图1所示，与癌旁组织相比，rp11-25g10.2在食管鳞癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(p<0.05)，且在不同分化程度的组织中呈现显著性差异。

实施例3分析rp11-25g10.2在tcga数据库中的表达情况

1、数据收集

从tcga数据库中收集72例食管鳞癌患者的lncrna的表达谱数据，其中g115例，g238例，g319例。分析rp11-25g10.2在不同分化程度的癌组织中的表达水平，绘制箱形图。

2、roc曲线分析

使用r语言中的proc包分析lncrnarp11-25g10.2的受试者工作特征，计算二项精确置信空间，绘制roc曲线。

3、结果

rp11-25g10.2的表达水平如图2所示，rp11-25g10.2(p＝1.39e-05)在不同分化程度的癌组织中呈现显著性差异。

rp11-25g10.2的roc曲线(g1-g2/g3)显示，rp11-25g10.2的auc值高为0.82，且具有较高的特异性和敏感性，说明frp11-25g10.2应用于食管鳞癌的分化程度评估具有较高的准确性。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110>高鑫

<120>一种与食管鳞癌及其分级相关的生物标志物

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>794

<212>dna

<213>homosapiens

<400>1

acagcttggttgttctcccatgggcaggaccagtgctacccggccttcctgcactccatt60

ggagaacaggagtggtacagagccactgcgatgctgagtccacagtggcaacagacacca120

actggcatctccatgaaaagtcacaactgaccgcctggctgccaagatctttgagtttga180

ggtctggccctacaatgaaggtgctgtcactctgagtatcagttgtcaactctggcaaaa240

tacaggggagctgtcagctaacaggaaatatggacattggggctgtctgggcaccccagt300

ttgctcctgtagagtgtggaatacactggcactgtaatattagaatggaaagaacttctg360

gaaggcatttagaccagaggtcacaattttttttaaatttttttatttttttctgtaaga420

ggacagatagtaaatatttttggtttgtggggatataagtttctgttgcaatgattcaac480

cctgcgttgtagtgcaaaagcactcacagacaatatgccagcagatgggcctggcaaggt540

tccagtgaaactttatttagggatgcttacgtataaatttcatgtaattttcgacccatg600

agatattctccttttgattcatttcccccatatttattgacgtacagttgaaaaacaaaa660

attttatgtacttaagatgtctgacctgatgttttgatatatacatcaagctaattaaca720

tatccatcactttacagttaccattgttttttcatcttctttctcttggtggtgagaaca780

ctttgaatccaccc794

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

aagcactcacagacaata18

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

catcaggtcagacatctt18

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ctctggtaaagtggatattgt21

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

ggtggaatcatattggaaca20