一种培养基及用于诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的用途的制作方法

本发明属于干细胞领域，涉及骨髓间充质干细胞成骨分化。
背景技术：
骨髓间充质干细胞(bmscs)是骨祖细胞，能诱导分化成多种类型细胞，包括成骨细胞、软骨细胞等。报道表明，骨质疏松患者骨结构的损伤，与bmscs成骨分化及增殖作用减弱有关。因此，增强骨形成是防治骨质疏松的一个重要策略。促进bmscs成骨分化是解决上述问题的切入点。技术实现要素：本发明旨在促进骨髓间充质干细胞成骨分化。本发明上述目的通过如下技术方案实现：一种诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的培养基，含有表玫瑰萜醛d。表玫瑰萜醛d用于促进骨髓间充质干细胞成骨分化的用途。表玫瑰萜醛d在制备促进骨髓间充质干细胞成骨分化的药物中的应用。有益效果：本发明发现，莪术内酯a、莪术双环烯酮、表玫瑰萜醛d可以有效促进骨髓间充质干细胞成骨分化，莪术内酯b、玫瑰萜醛d作用不明显。因此，可以将莪术内酯a、莪术双环烯酮、表玫瑰萜醛d制备成促进骨髓间充质干细胞成骨分化的药物，也可将莪术内酯a、莪术双环烯酮、表玫瑰萜醛d添加到培养基制成促进骨髓间充质干细胞成骨分化的培养基。附图说明图1为待测化合物的化学结构式；图2为茜素红染色结果；图3为骨钙素表达水平。具体实施方式下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。一、实验材料动物采用spf级雌性sd大鼠，8周龄，体质量(200±20)g。莪术内酯a、莪术内酯b、莪术双环烯酮、玫瑰萜醛d、表玫瑰萜醛d购买或自制，纯度不低于98％，化学结构式如图1所示。l-dmen培养基购自hyclone公司，胎牛血清购自gibco公司，茜素红购自solarbio公司。pcr试剂盒购自takara。二、实验方法1、骨髓间充质干细胞的分离纯化和培养8周龄健康sd大鼠断颈法处死，无菌条件下分离股骨，磷酸盐缓冲液(pbs)漂洗3次后用咬骨钳咬去骨两骺端；用骨髓间充干细胞完全培养基(按体积分数配比：5％胎牛血清+1％双抗+94％l-dmem)冲洗骨髓腔制备骨髓细胞悬液；移液枪反复吹打制成单细胞悬液后，移至培养瓶中。显微镜下观察细胞后将细胞置于5％co2、37℃、湿度75％的培养箱中恒温培养。48h后首次更换培养基，之后每3天换1次培养基。待细胞80％融合后传代，用胰蛋白酶消化细胞至大部分细胞重新悬浮，再加入完全培养基终止胰蛋白酶消化作用，200r/min离心5min，弃上清，用完全培养基重悬细胞后移至新的培养瓶中培养。反复传代纯化骨髓间充质干细胞，并在传至第3代后进行成骨细胞的诱导。2、分组及给药取第3代bmscs以5×108/ml的细胞密度铺于6孔板中。并将实验分组如下：对照组：完全培养基；诱导组：完全培养基中加入成骨诱导剂(1mmol/l地塞米松、10mmol/l维生素c、1mol/lβ-甘油磷酸钠)；莪术内酯a组：诱导组培养基基础上再加入10μm莪术内酯a；莪术内酯b组：诱导组培养基基础上再加入10μm莪术内酯b；莪术双环烯酮组：诱导组培养基基础上再加入10μm莪术双环烯酮；玫瑰萜醛d组：诱导组培养基基础上再加入10μm玫瑰萜醛d；表玫瑰萜醛d组：诱导组培养基基础上再加入10μm表玫瑰萜醛d；每组设3个复孔。3、茜素红染色培养96h后，各组细胞用pbs缓冲液冲洗2次，体积分数95％乙醇固定10min，双蒸水冲洗3次后加入1％茜素红-tris-hcl(ph8.3)37℃孵育30min；双蒸水冲洗，65℃烤箱干燥后在倒置荧光显微镜下进行拍照，采集图片。4、rt-pcr法定量测定骨钙素培养96h后，使用trizol试剂从细胞中提取rna，并按制造商的规定分离。采用sybrgreen染料法进行实时定量pcr反应。相对于β-actin计算倍数变化，用δδct方法对骨钙素mrna分析。反应条件为95℃预变性30s；95℃3s，60℃30s，共40个循环。使用以下引物组：β-actin上游：5’-gtacgccaacacagtgctg-3’β-actin下游：5’-cgtcatactcctgcttgctg-3’骨钙素上游：5’-accatctttctgctcactctgct-3’骨钙素下游：5’-ccttattgccctcctgcttg-3’5、统计学方法用spss19.0软件对数据进行统计学分析，数据以均值±偏差表示，组间比较采用t检验，以p<0.05为差异有统计学意义。三、实验结果1、茜素红染色结果如图2所示。与诱导组相比，莪术内酯a组、莪术双环烯酮组、表玫瑰萜醛d组可见更为明显的钙沉淀，而莪术内酯b组、玫瑰萜醛d组不明显。钙在人体内大量存在，主要构成骨骼。钙在机体内以两种形式存在，一是离子钙存在于血循环内，称为血钙，另一种是和蛋白、磷酸或碳酸结合而沉着在细胞基质中以磷酸钙和碳酸钙形式存在的结合钙。细胞基质中钙盐沉积情况变化最直接地反映了细胞成骨的程度。茜素红染色是用于测定细胞基质中钙盐沉积的一种较特异和常用的方法。茜素红具有羟基蒽醌结构，与钙盐中的钙离子结合后，形成配合物，显示为红色。2、骨钙素定量测定结果如表1和图3所示。与诱导组相比，莪术内酯a组、莪术双环烯酮组、表玫瑰萜醛d组骨钙素表达水平显著升高(p＜0.05)；与诱导组相比，莪术内酯b组、玫瑰萜醛d组骨钙素表达水平无显著差异(p＞0.05)。表1骨钙素表达水平骨钙素/β-actin对照组1.00诱导组1.95±0.15莪术内酯a组4.83±0.21莪术内酯b组1.87±0.19莪术双环烯酮组5.29±0.26玫瑰萜醛d组2.01±0.17表玫瑰萜醛d组6.05±0.24骨钙素是成骨细胞合成并分泌的，能直接反映成骨细胞活性和骨形成情况，在骨质形成过程中起到重要作用。结果表明，莪术内酯a、莪术双环烯酮、表玫瑰萜醛d可以有效促进骨髓间充质干细胞成骨分化，莪术内酯b、玫瑰萜醛d作用不明显。因此，可以将莪术内酯a、莪术双环烯酮、表玫瑰萜醛d制备成促进骨髓间充质干细胞成骨分化的药物，也可将莪术内酯a、莪术双环烯酮、表玫瑰萜醛d添加到培养基制成促进骨髓间充质干细胞成骨分化的培养基。上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。当前第1页12