一种全牛源O型口蹄疫病毒广谱中和抗体的制备方法与流程

本发明涉及抗体制备技术领域，具体涉及一种全牛源o型口蹄疫病毒广谱中和抗体的制备方法。

背景技术

口蹄疫(foot-and-mouthdisease，fmd)是危害我国畜牧业健康发展的重大动物疫病，主要侵害牛、羊与猪等偶蹄动物，对家畜及其产品的国际贸易具有重大的影响。口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus，fmdv)是一种小rna病毒，具有rna病毒的准种特性，七个血清型病毒又因为流行区域不同而形成了许多有地域特征的拓扑型，每个拓扑型内包含有多个谱系。我国目前存在3个谱系的o型fmdv，分别为东南亚拓扑型(o/mya98)，中东南亚拓扑型(o/panasia)和中国拓扑型(o/cathay)，三个谱系病毒的抗原结构存在较大差异，交叉免疫保护效果较弱。o/cathay的经典毒株相对具有较好的免疫原性与抗原谱，但其新分离变异株的免疫原性趋弱，具有逃逸免疫的倾向。即使是免疫原性好的毒株，在疫苗抗原含量低时，对与其遗传关系较远的新流行毒也不能提供很好的免疫保护；需要研制多组份抗原苗，以提高疫苗的抗原谱，抗原谱广的疫苗毒株的筛选难度增大，需要借助基因工程手段来构建优良疫苗毒株。中和抗体是fmd保护性免疫的重要组成部分，但是对fmdv广谱中和抗体产生的抗原位点研究仍然有许多空白。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种全牛源o型口蹄疫病毒广谱中和抗体的制备方法。本发明所述制备方法利用不同口蹄疫毒株感染牛，筛选得到能中和三个谱系o型fmdv的中和抗体，能够获得的全牛源广谱中和单克隆抗体。

本发明提供了一种全牛源o型口蹄疫病毒广谱中和抗体的制备方法，包括以下步骤：

1)采用o型口蹄疫病毒，对牛进行第一次免疫，第一次免疫后30～60d内，进行第二次免疫，第一次免疫后第120～150d内，进行第三次免疫；所述o型口蹄疫病毒包括以下三个谱系：东南亚拓扑型毒株、中国拓扑型毒株和中东南亚拓扑型毒株；所述第一次免疫、第二次免疫、第三次免疫采用的o型口蹄疫病毒的谱系不同；

2)第三次免疫后，分离外周血单个核细胞，利用诱饵抗原筛选o型口蹄疫病毒抗原特异性单个b细胞；所述诱饵抗原包括生物素或荧光蛋白标记的o型口蹄疫病毒；

3)以步骤2)获得的o型口蹄疫病毒抗原特异性单个b细胞的cdna为模板，扩增牛抗体重链和轻链的可变区基因；

4)以牛外周血单个核细胞总cdna为模板，扩增牛抗体重链和轻链的全长序列，得到牛抗体重链和轻链的恒定区序列；

5)将步骤3)获得的牛抗体重链可变区基因与步骤4)获得的牛抗体重链恒定区序列构建入表达载体中，得到全牛源单抗的全长重链载体；将步骤3)获得的牛抗体轻链可变区基因与步骤4)获得的牛抗体轻链恒定区序列构建入表达载体中，得到全牛源单抗的全长轻链载体；

6)将步骤5)得到的全牛源单抗的全长重链载体和全牛源单抗的全长轻链载体以1：(1～3)的质量比混合，共转染细胞，取转染细胞培养后取上清，纯化得到全牛源o型口蹄疫病毒广谱中和抗体；

所述步骤3)和4)没有先后顺序的限定。

优选的是，步骤1)所述东南亚拓扑型毒株包括o/mya98/jx/2010、o/gz/cha2010、o/by/cha/2010。

优选的是，步骤1)所述中国拓扑型毒株包括o/hn/cha/93、o/gd/china/86、o/yun/taw/97、o/xj1/2003。

优选的是，步骤1)所述中东南亚拓扑型毒株包括o/tibet/99、o/ys/cha/2005、o/taw/2/99、o/cha/7/2011。

优选的是，步骤2)所述荧光蛋白包括apc、pe或fitc。

优选的是，步骤3)所述扩增包括巢式pcr扩增方法，所述巢式pcr扩增使用的引物包括：igg可变区外引物对、igg可变区内引物对、igm可变区外引物对、igm可变区内引物对、igd可变区外引物对、igd可变区内引物对、iglambda外引物对和iglambda内引物对；igg可变区外引物对、igm可变区外引物对和igd可变区外引物对的上游引物相同且如seqidno.1所示，igg可变区外引物对、igm可变区外引物对和igd可变区外引物对的下游引物分别如seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4所示；igg可变区内引物对、igm可变区内引物对和igd可变区内引物对的上游引物相同且如seqidno.5所示，igg可变区内引物对、igm可变区内引物对和igd可变区内引物对的下游引物分别如seqidno.6、seqidno.7和seqidno.8所示；iglambda外引物对的核苷酸序列如seqidno.9和seqidno.10所示；iglambda内引物对的核苷酸序列如seqidno.11和seqidno.12所示。

优选的是，步骤4)所述扩增包括cdna末端快速扩增方法，所述cdna末端快速扩增使用的引物包括：核苷酸序列如seqidno.13所示的igg重链5’race引物、核苷酸序列如seqidno.14所示的igg重链3’race引物、核苷酸序列如seqidno.15所示的igglambda轻链5’race引物、核苷酸序列如seqidno.16所示的igglambda轻链3’race引物、核苷酸序列如seqidno.17所示的iggkappa轻链5’race引物和核苷酸序列如seqidno.18所示的iggkappa轻链3’race引物。

优选的是，步骤3)和步骤4)所述牛抗体为igg抗体。

优选的是，步骤3)和步骤4)所述轻链为lambda轻链。

优选的是，步骤6)所述细胞包括cho-s细胞。

本发明提供了一种全牛源o型口蹄疫病毒广谱中和抗体的制备方法。本发明利用已有的牛抗体基因序列，通过同源比对分析，利用巢式pcr，从单个b淋巴细胞扩增出抗体可变区基因，从外周血单个核细胞中扩增出抗体恒定区基因，进而制备筛选出具有中和抗体活性的全牛源单克隆抗体。本发明首次建立了一种利用高通量单个b细胞技术生产全牛源单克隆抗体的方法，相较于传统的抗体制备技术具有效率高、全牛源、基因多样性好等优点，本发明方法的提出为研究o型口蹄疫病毒感染牛诱导产生广谱中和抗体提供了一种良好的方法，为研究牛的抗体免疫应答和分离治疗性抗体提供了一种新的技术手段。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的液相阻断elisa检测监测o型fmdv特异性抗体曲线；

图2为本发明实施例2提供的多色流式分析结果图；

图3为本发明实施例2提供的口蹄疫病毒特异b细胞分布结果图；

图4为本发明实施例3提供的igm的bcr基因电泳结果图；

图5为本发明实施例3提供的igg的bcr基因电泳结果图；

图6为本发明实施例3提供的igd的bcr基因电泳结果图；

图7为本发明实施例3提供的igg重链序列进化树分析图；

图8为本发明实施例3提供的kappa轻链序列进化树分析图；

图9为本发明实施例3提供的lambda轻链序列进化树分析图；

图10为本发明实施例4提供的表达的全牛源抗体分子还原性sds-page结果图；

图11为本发明实施例4提供的表达的全牛源抗体分子非还原性sds-page结果图；

图12为本发明实施例4提供的ifa结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种全牛源o型口蹄疫病毒广谱中和抗体的制备方法，包括以下步骤：

1)采用o型口蹄疫病毒，对牛进行第一次免疫，第一次免疫后30～60d内，进行第二次免疫，第一次免疫后第120～150d内，进行第三次免疫；所述o型口蹄疫病毒包括以下三个谱系：东南亚拓扑型毒株、中国拓扑型毒株和中东南亚拓扑型毒株；所述第一次免疫、第二次免疫、第三次免疫采用的o型口蹄疫病毒的谱系不同；

2)第三次免疫后，分离外周血单个核细胞，利用诱饵抗原筛选o型口蹄疫病毒抗原特异性单个b细胞；所述诱饵抗原包括生物素或荧光蛋白标记的o型口蹄疫病毒；

3)以步骤2)获得的o型口蹄疫病毒抗原特异性单个b细胞的cdna为模板，扩增牛抗体重链和轻链的可变区基因；

4)以牛外周血单个核细胞总cdna为模板，扩增牛抗体重链和轻链的全长序列，得到牛抗体重链和轻链的恒定区序列；

5)将步骤3)获得的牛抗体重链可变区基因与步骤4)获得的牛抗体重链恒定区序列构建入表达载体中，得到全牛源单抗的全长重链载体；将步骤3)获得的牛抗体轻链可变区基因与步骤4)获得的牛抗体轻链恒定区序列构建入表达载体中，得到全牛源单抗的全长轻链载体；

6)将步骤5)得到的全牛源单抗的全长重链载体和全牛源单抗的全长轻链载体以1：(1～3)的质量比混合，共转染细胞，取转染细胞培养后取上清，纯化得到全牛源o型口蹄疫病毒广谱中和抗体；

所述步骤3)和4)没有先后顺序的限定。

本发明采用o型口蹄疫病毒，对牛进行第一次免疫，第一次免疫后30～60d内，进行第二次免疫，第一次免疫后第120～150d内，进行第三次免疫；所述o型口蹄疫病毒包括以下三个谱系：东南亚拓扑型毒株、中国拓扑型毒株和中东南亚拓扑型毒株；所述第一次免疫、第二次免疫、第三次免疫采用的o型口蹄疫病毒的谱系不同。本发明更优选在第一次免疫后第35d进行第二次免疫，更优选在第一次免疫后第132d进行第三次免疫。本发明对所述第一次免疫、第二次免疫和第三次免疫的接种方式和剂量没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规免疫方式和剂量即可。如本发明第一次免疫优选采用在牛舌面皮下接种的方式，更优选接种2ml10000bid50的抗原；第二次免疫和第三次免疫优选采用颈部肌肉注射方式，更优选接种5ml经isa201佐剂乳化的抗原。在本发明中，所述东南亚拓扑型毒株包括o/mya98/jx/2010、o/gz/cha2010、o/by/cha/2010，更优选为o/mya98/jx/2010。在本发明中，所述中国拓扑型毒株包括o/hn/cha/93、o/gd/china/86、o/yun/taw/97、o/xj1/2003，更优选为o/hn/cha/93。在本发明中，所述中东南亚拓扑型毒株包括o/tibet/99、o/ys/cha/2005、o/taw/2/99、o/cha/7/2011，更优选为o/tibet/99。第三次免疫后，本发明分离外周血单个核细胞，利用诱饵抗原筛选o型口蹄疫病毒抗原特异性单个b细胞；所述诱饵抗原包括生物素或荧光蛋白标记的o型口蹄疫病毒。本发明对所述诱饵抗原对应的o型口蹄疫病毒种类没有特殊的限定，采用常规o型口蹄疫病毒即可，优选为中东南亚拓扑型毒株，更优选为o/mya98/jx/2010毒株。本发明优选在第三次免疫后第3～5d分离外周血单个核细胞，优选利用流式细胞仪筛选o型口蹄疫病毒抗原特异性单个b细胞，更优选利用型号为bdfacsariaii的流式分选仪。在本发明中，所述诱饵抗原更优选为生物素标记的o型口蹄疫病毒。本发明对所述生物素没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规生物素即可，如长链生物素ez-link^tmsulfo-nhs-lc-biotin，lifetechnology，usa。本发明对所述生物素标记的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规生物素标记方法即可。进行完生物素标记后，在利用流式细胞仪进行筛选前，优选对细胞进行染色，本发明对所述染色的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规细胞染色方法即可。在本发明中，所述荧光蛋白包括apc、pe或fitc。

得到o型口蹄疫病毒抗原特异性单个b细胞后，本发明以o型口蹄疫病毒抗原特异性单个b细胞的cdna为模板，扩增牛抗体重链和轻链的可变区基因。本发明优选采用巢式pcr方法对可变区基因进行扩增。本发明对o型口蹄疫病毒抗原特异性单个b细胞的cdna的制备方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的cdna常规提取合成方法即可，本发明优选先进行总rna的提取，随后反转录得到cdna，本发明对具体的反应条件参数没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的cdna合成过程中的常规操作参数即可。本发明优选根据牛抗体重链、轻链的可变区基因进行引物的设计，本发明优选根据序列差异在引物中引入兼并碱基，本发明牛抗体重链和轻链的上游引物(外引物)优选位于信号肽区域，下游引物(内引物和外引物)优选位于ch1区域。本发明所述巢式pcr扩增使用的引物包括：igg可变区外引物对、igg可变区内引物对、igm可变区外引物对、igm可变区内引物对、igd可变区外引物对、igd可变区内引物对、iglambda外引物对和iglambda内引物对；igg可变区外引物对、igm可变区外引物对和igd可变区外引物对的上游引物相同且如seqidno.1所示，igg可变区外引物对、igm可变区外引物对和igd可变区外引物对的下游引物分别如seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4所示；igg可变区内引物对、igm可变区内引物对和igd可变区内引物对的上游引物相同且如seqidno.5所示，igg可变区内引物对、igm可变区内引物对和igd可变区内引物对的下游引物分别如seqidno.6、seqidno.7和seqidno.8所示；iglambda外引物对的核苷酸序列如seqidno.9和seqidno.10所示；iglambda内引物对的核苷酸序列如seqidno.11和seqidno.12所示。在本发明中，所述牛抗体优选包括igg、igm和igd，更优选包括igg。在本发明中，所述牛抗体的轻链优选为iglambda轻链。当所述牛抗体选择igg时，得到的中和抗体更具亲和力，中和活性更高。

本发明以牛外周血单个核细胞总cdna为模板，扩增牛抗体重链和轻链的全长序列，得到牛抗体重链和轻链的恒定区序列。在本发明中，所述牛抗体优选为igg抗体，当所述牛抗体选择igg时，得到的中和抗体更具亲和力，中和活性更高。在本发明中，所述扩增优选包括cdna末端快速扩增方法，所述cdna末端快速扩增使用的引物包括：核苷酸序列如seqidno.13所示的igg重链5’race引物、核苷酸序列如seqidno.14所示的igg重链3’race引物、核苷酸序列如seqidno.15所示的igglambda轻链5’race引物、核苷酸序列如seqidno.16所示的igglambda轻链3’race引物、核苷酸序列如seqidno.17所示的iggkappa轻链5’race引物和核苷酸序列如seqidno.18所示的iggkappa轻链3’race引物。本发明所述引物优选是根据genbank公布的牛igg重链、iglambda轻链以及igkappa轻链序列设计的。本发明采用cdna末端快速扩增方法能够扩增得到cdna5’端和3’端片段，然后根据两个片段重叠区部分进行拼接，最终得到全长的igg重链、iglambda轻链以及igkappa轻链序列。在本发明中，所述轻链优选为lambda轻链。具体在本发明实施例中，本发明得到多条全长的igg重链、lambda轻链和igkappa轻链分子，本发明最后选择使用igg重链克隆h5-17以及iglambda轻链克隆l1-7序列的恒定区作为牛抗体重链和轻链的恒定区序列，用于后续表达载体的构建。本发明对所述cdna末端快速扩增方法的具体操作条件参数没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的cdna末端快速扩增常规操作条件即可。

得到牛抗体重链可变区和恒定区序列、牛抗体轻链可变区和恒定区序列后，本发明将牛抗体重链可变区基因与牛抗体重链恒定区序列构建入表达载体中，得到全牛源单抗的全长重链载体；将牛抗体轻链可变区基因与牛抗体轻链恒定区序列构建入表达载体中，得到全牛源单抗的全长轻链载体。本发明对所述载体的构建方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的合成抗体过程中常规重链、轻链表达载体构建方法即可，如本发明在表达载体构建过程中，优选先将重链恒定区和轻链恒定区扩增至表达载体上，然后根据重链和轻链可变区序列，在可变区序列的起始密码子前引入kozak序列(gccacc)，经密码子优化后，分别插入含重链恒定区和轻链恒定区的表达载体上。在本发明中，所述表达载体优选包括pcdna3.1或pcdna3.4。

得到全牛源单抗的全长重链载体和全牛源单抗的全长轻链载体后，本发明将全牛源单抗的全长重链载体和全牛源单抗的全长轻链载体以1：(1～3)的质量比混合，共转染细胞，取细胞培养上清，纯化得到全牛源o型口蹄疫病毒广谱中和抗体。在本发明中，所述细胞优选包括cho-s细胞。在本发明中，全牛源单抗的全长重链载体和全牛源单抗的全长轻链载体的总质量与转染用细胞的个数比优选为30μg：(1×10⁸～2×10⁸)个。本发明得到全牛源单抗的全长重链载体和全牛源单抗的全长轻链载体后，优选先将全牛源单抗的全长重链载体和全牛源单抗的全长轻链载体分别转入大肠杆菌感受态细胞中，采用无内毒素质粒提取试剂盒得到无内毒素的质粒，再将无内毒素的质粒转染细胞。本发明对所述转染的条件没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规载体转染细胞的条件即可。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种全牛源o型口蹄疫病毒广谱中和抗体的制备方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

动物免疫

选取健康的1周岁秦川牛用于全牛源单克隆抗体的制备，共3头，编号分别为#2334、#1217和#0005。试验用牛均饲养于中国农业科学院兰州兽医研究生物安全三级(p3)实验室。第一次免疫，采取牛舌面皮下接种方式接种2ml含有10000bid50牛适应的o/mya98/jx/2010fmdv(东南亚拓扑型)；第一次免疫后第35天，采取颈部肌肉注射方式接种5ml经isa201佐剂乳化的o/hn/cha/93fmdv(中国拓扑型)进行第二次免疫；然后在第一次免疫后的第132天，采取相同方式接种5ml经isa201佐剂乳化的o/tibet/99fmdv(中东南亚拓扑型)进行第三次免疫。定期隔周采血，分离血清，使用o型液相阻断elsia检测病毒感染后抗体滴度变化规律。在第三次免疫后3～5天分离外周血单个核细胞，然后利用流式细胞仪(bdariaⅱ，biosciences)分选o/mya98/jx/2010fmdv146s抗原特异性单个b细胞，用于o型fmdv广谱中和抗体的筛选和制备。

抗体应答特征

使用o型液相阻断elisa(lpb-elisa)试剂盒(兰州兽医研究所，中国)检测免疫后不同时间点血清中总的抗fmdv的igg抗体，具体操作参考该试剂盒说明书进行。液相阻断elisa检测监测o型fmdv特异性抗体曲线如图1所示。三头牛在感染后第4天均开始产生了fmdv特异性抗体，在第14天达到高峰；第35天进行第二次免疫后，抗体水平明显迅速升高，在第56天到达最高峰；在132天进行第三次免疫，随后抗体稍微上升，并一直维持在第三次免疫时的滴度。

实施例2

牛抗原特异性igg⁺、igm⁺、igd⁺单个b细胞的分离

牛外周血单个核细胞分离

使用淋巴细胞分离液(ρ＝1.083，histopaque，sigma-aldrich)从牛外周血中分离外周血单个核细胞(pbmcs)，具体方法如下：

a)取淋巴细胞分离液放置室温平衡，每15ml离心管内加入6ml淋巴细胞分离液。

b)使用pbs液按1:1比例稀释牛edta抗凝血，然后移液枪吸取8ml稀释后全血，缓慢加入到淋巴分离液上层，注意避免血液混入淋巴分离液中。

c)离心管放至装有水平转子的离心机中，设置离心机升速为6，降速为1，温度25℃。1200×g，离心30min。

d)轻轻取出离心管，巴氏吸管弃去上层液体，乳白色层即为外周血单个核细胞。吸取乳白色层细胞加入含有1/2体积细胞分选液的离心管中。600×g，离心5min。

e)一次性倒去上层液体，加入2-3ml红细胞裂解液，室温裂解1-2min，然后迅速加入大于10倍体积细胞分选液。250×g，离心10min。

f)一次性倒去上层液体，底层细胞用细胞分选液洗两遍，400×g，离心5min。

g)一次性倒去上层液体，用枪吹散至单个细胞，使用gecytell^tmcellimagingsystem(ge，healthcare，usa)自动计数。

o/mya98/jx/2010fmdv146s抗原的生物素标记

使用长链生物素(ez-link^tmsulfo-nhs-lc-biotin，lifetechnology，usa)标记o/mya98/jx/2010fmdv146s抗原。具体操作如下：

a)首先使用截留量100kda超滤管把o/mya98/jx/2010fmdv146s抗原置换至pbs缓冲液中。4000rpm离心10min。

b)取180μl超纯水加入到1mg生物素中，稀释至10mm。分别按1：32、1：64和1：128比例加入生物素,即分别添加1μl、2μl和4μl。

c)4℃冰上作用2h。

d)用超滤管置换至抗原存储缓冲液中。

e)加入等体积100％甘油，-70℃保存。

细胞染色

a)取5×10⁶个富集的b细胞重悬于200μl液体，加入生物素(biotin)标记o/mya98/jx/2010fmdv146s抗原(0.5μg)、3μl鼠抗牛cd21-rpe(bio-rad，usa)和1μl鼠抗牛igm-fitc(bio-rad，usa)，4℃作用20min。取相同细胞设置减一对照样本(不加入生物素标记的fmdv146s抗原)。同时设置单阳管，调节fitc、pe和apc之间补偿。

b)细胞分选液洗细胞两次(400×g，4℃离心5min。)

c)重悬于200μl液体，加入1μl鼠抗biotin-apc二抗(miltenyi-biotec，german)，4℃作用20min。

d)细胞分选液洗细胞一次(400×g，4℃离心5min。)

e)重悬细胞成单个于500μl液体，置于冰上，避光，准备上机分选细胞。

流式分选o/mya98/jx/2010fmdv146s特异性单个b细胞

使用bdfacsariaⅱ流式分选仪分选o/mya98/jx/2010fmdv146s特异性单个b细胞。仪器设置参数为，喷嘴大小：100μm；分选模式：单细胞模式；分选速度：8000细胞/秒；振幅：20psi；震荡频率：30khz。以上参数设置调节后关闭sweat按钮，使用accudrop(cat：642412，bd，usa)延迟微球执行计算液体延迟时间。然后调节分选舱中96-pcr孔板位置，直至分选细胞准确落入板孔正中央(可通过使用粘有封口膜的96孔板，设置每孔分选60个细胞模式进行调节)。以上设置均完成后，把含有10μl裂解液的全裙边96-pcr板放入分选舱，开始上样。

抗原特异性b细胞在外周血单个核细胞(pbmcs)中分布特征

多色流式分析结果显示如图2所示，fmdv特异b细胞存在于igm^-b细胞和igm⁺b细胞群体。首先划门圈出pbmcs(图2-1)，根据fsc-a与fsa-h设置排除粘连细胞，圈出对角线单一细胞(图2-2)。收集100万个pbmcs进行分析，在igm⁺细胞(图2-4)群体中，与减一对照样本(图2-6)(不加入生物素标记的fmdv146s抗原)相比，其中igm⁺fmdv⁺b细胞在pbmcs中所占比例约为0.83±0.2‰(n＝6，图2-8)；在igm^-b细胞(图2-3)群体中，包括igg⁺和igd⁺b细胞，与减一对照样本(图2-5)(不加入生物素标记的fmdv146s抗原)相比，其中igm^-fmdv⁺b细胞在外周血单个核细胞中所占比例约0.30±0.15‰(n＝6，图2-7)(口蹄疫病毒特异b细胞分布结果图如图3所示，其中图3-1为fmdv特异b细胞在igm^-b细胞各群体中分布情况，图3-2为fmdv特异b细胞在igm⁺b细胞各群体中分布情况)。cd21是成熟b细胞的标志分子，根据cd21的分布特点(图2-7和图2-8)，可以看出这些fmdv特异b细胞包括成熟b细胞和非成熟b细胞。因此，最终选择分选cd21⁺igm⁺fmdv⁺细胞以及cd21⁺igm^-fmdv⁺细胞，用于后续单个b细胞pcr扩增。

实施例3

牛单个b细胞抗体制备

牛igg⁺、igm⁺、igd⁺单个b细胞bcr可变区基因扩增

bcr可变区引物设计

参考genbank公布的牛igg重链、igm重链、igd重链序列以及iglambda轻链序列，进行多重序列比对，利用primer5.0引物设计软件设计引物。本发明设计引物为巢式扩增引物，并根据序列差异在引物中引入兼并碱基。其中上游引物位于信号肽区域，下游引物位于ch1区域。引物序列见表1。

表1牛igg/igm/igdbcr可变区基因巢式扩增引物

单细胞cdna分子制备

分选完成后，每孔10μl裂解液中加入1μl终止液，室温作用5min，终止反应。然后每孔加入4μlsuperscrioptvivomix溶液(lifetechnology，usa)和6μldnase/rnase-freewater，混匀。1500rpm，4℃离心5min。放入96孔pcr仪进行反转录扩增，设置反应条件：25℃10min；42℃120min；85℃5min；4℃60min。-20℃存储o/mya98/jx/2010fmdv146s特异性单个b细胞的cdna，用于后续pcr扩增。

单细胞pcr扩增

使用表1中所示引物，采取巢式pcr方法对o/mya98/jx/2010fmdv146s特异性单个b细胞bcr基因进行扩增，包括牛igg、igm、igd的重链可变区基因，以及iglambda轻链可变区基因。第一轮反应体系为25μl，包括0.25μllataq酶(qiagen，german)、2.5μl10×lataqbufferii、4μldntpmixture、0.5μl(10μm)上/下游引物、14.75μl水、2.5μlcdna模板。反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃/或58℃/或60℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃再延伸10min。然后取第一轮产物2.5μl为模板，参考上述反应体系，按表1中退火温度条件进行第二轮扩增反应。

pcr产物测序

取第二轮扩增pcr产物5μl，以1.5％琼脂糖凝胶电泳，观察扩增结果。然后使用巢式内部扩增引物对电泳阳性样本进行dna测序，使用dnastar软件分析、比对测序结果。

bcr扩增结果

使用扩增igm可变区的引物，对通过流式分选获得的单个igm⁺cd21^±b细胞进行巢式pcr扩增，扩增产物经电泳和测序分析，成功获得表达igm的bcr基因(图4，其中，图4-1为igm重链可变区扩增结果，图4-2为igm轻链可变区扩增结果)，其重链可变区片段约380bp和轻链可变区片段约350bp。成功扩增到多对igm的bcr基因，经测序验证和imgt数据库比对，证实扩增得到序列为igm的bcr基因。

使用扩增igg和igd可变区的引物，对通过流式分选获得的单个igm^-cd21^±b细胞进行巢式pcr扩增，产物经电泳和测序分析，成功扩增到igg的bcr基因(图5，其中，图5-1为igg重链可变区扩增结果，图5-2为igg轻链可变区扩增结果)，其重链可变区片段约380bp(330-510所有序列信息)，轻链可变区片段约350bp；经测序验证和imgt数据库比对，证实扩增得到序列为igg的bcr基因。成功扩增到igd的bcr基因(图6，其中，图6-1为igd重链可变区扩增结果，图6-2为igd轻链可变区扩增结果)，其重链可变区片段在350～500之间；经测序验证和imgt数据库比对，证实扩增得到序列为igd的bcr基因。

牛igg分子重链和轻链全长基因扩增

igg分子是在fmdv免疫应答中主导的抗体类型，是高亲和力fdmv中和抗体的来源。igm和igd是免疫应答初期(初次免疫后3～7天)产生的抗体分子，该类分子亲和力较弱，不能抵抗fmdv感染，在加强(第二)免疫后，机体内免疫球蛋白会发生同型转换，由igm和igd转换为igg，从而能抵抗fmdv感染。本发明试图表达了牛fmdv特异性igm和igd类型的抗体分子，但这些抗体分子对fmdv亲和力较差，且无中和活性，鉴于此，选择igg类型抗体分子用于全牛源抗体制备。

race引物设计

参考genbank公布的牛igg重链、iglambda轻链以及igkappa轻链序列，使用mega软件进行多重序列比对，找出恒定区保守区域，然后在此区域利用primer5.0引物设计软件设计扩增牛igg重链、lambda轻链和igkappa轻链race引物。引物序列见表2。

表2牛igg分子重链和轻链全长基因race扩增引物

总rna提取

使用rna提取试剂盒(qiagen，german)公司提取牛外周血单个核细胞总rna，具体操作步骤如下：

a)取1×10⁶个新鲜分离的细胞沉淀，加入350μlrlt，涡旋，静置作用3min。

b)加入350μl75％乙醇，混匀，转移至rneasyminispin柱，8000×g，室温离心15s，弃去流穿液。

c)加入350μlrw1于柱上，8000×g，室温离心15s，弃去流穿液。

d)加入80μldnaseⅰ工作液(10μldnaseⅰ存储液和70μlrdd)于柱底膜，20℃-30℃静止作用15min。

e)重复步骤3。

f)加入500μlrpe于柱上，8000×g，室温离心15s，弃去流穿液。

g)加入500μlrpe于柱上，8000×g，室温离心2min，弃去流穿液。

h)换一新2ml收集管，8000×g，室温空离1min。

i)离心柱移至到新1.5ml收集管，加入35μl无rna酶水于柱底，静置1min。

j)8000×g，室温离心1min。收集洗脱液，进行rna定量，可立即转录成cdna或-70℃保存。

smartrace扩增

用race方法扩增牛igg重链及轻链5’端和3’端基因序列。具体方法参考试剂盒(race5’/3’kit，takara，japan)说明，先获得5’-race、3’-racecdna模板，然后使用基因特异性引物(gsp)，进行race扩增。具体方法如下：

a)制备5’-race、3’-racecdna模板：首先制备混合物a(包括5×first-strandbuffer5μl、100mmdtt0.5μl和dntps1μl，可按比例放大反应体系)，混合后瞬离，置于室温放置；然后制备5’-racereadycdna(包括总rna10μl和5’-cdsprimera1μl)和3’-racereadycdna(包括总rna11μl和3’-cdsprimera1μl)混合物，分别混匀后72℃作用3min，42℃作用2min，冷却后瞬离，并于5’-racereadycdna样本中加入1μlsmarteriiaoligonucleotide，补至12μl，混匀备用；同时制备混合物b(包括混合物a5.5μl、40u/μl的rnaseinhibitor0.5μl和100usmartscribereversetranscriptase2μl，可按比例放大反应体系)，混合后瞬离；最后取制备的混合物b8μl分别加入到制备的5’-racereadycdna和3’-racereadycdna，混匀，瞬离后42℃作用90min，然后70℃灭活10min。对获得cdna模板置于-20℃存储。

b)race扩增:使用上述制备的5’-race、3’-racecdna为模板，使用相应表格2中引物进行pcr扩增。反应体系包括：seqampdnapolymerase1μl、模板2.5μl、引物1μl、2×seqampbuffer25μl、10×upm5μl、h2o15.5μl，共50μl。反应条件：94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环。反应产物置于-20℃存储。

基因克隆及测序

首先对上述pcr产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，然后使用参照dna凝胶回收试剂盒说明书，纯化回收特异的dna条带。参照cloningkit(北京全式金公司，中国)说明书操作步骤，取胶回收片段4μl，加入1μlcloningvector，轻轻混合，室温(20℃-37℃)反应5min，反应结束后，将离心管置于冰上。参照takaradh5αcompetentcells转化操作说明，进行连接产物的转化。首先取5μl连接产物加到50μldh5α感受态细胞中，轻柔混合均匀后冰浴30min；42℃放置90s，再立即冰浴1-2min；然后加入950μl无抗生素lb液体培养基，37℃温和震荡(150-210rpm)1h；400×g离心5min；无菌弃上清，用100μllb液体培养基重新悬浮；先向含amp(100μg/ml)的lb固体培养平板上均匀涂布加入42μlx-gal(20mg/ml)和42μliptg(20mg/ml)，37℃静止吸附30min，然后再加入重悬液，均匀涂布；将涂好的平皿静止放置37℃培养箱中正放培养30min，然后再倒置培养12-16h。

随机挑取生长于lb固体培养基平板上的数个白色菌落，分别接种于含amp的lb液体培养基中，37℃震荡培养16h。取5ml菌液，提取质粒，使用m13通用引物进行dna测序。

igg分子重链和轻链全长分子拼接

使用dnastar软件对测序结果进行分析，首先通过megalign程序中clustalw方法分别对igg重链或轻链的5’端和3’端序列进行同源比对，然后分别建立进化树。根据进化树结果，位于同一分支上的5’端、3’端序列即为同一条重链或轻链序列。然后使用dnaman分子软件，对同一分支上的5’端、3’端序列进行拼接，从而获得完整的igg重链、igkappa轻链、iglambda轻链完整cdna序列。

牛igg分子重链和轻链全长基因获取

从牛外周血单个核细胞中提取总的rna，使用表2中igg重链5’race引物和igg重链3’race引物，进行race扩增，测序，与imgt数据库比对，获得13条igg重链5端序列(5-bh-11、5-bh-19、5-bh-14、5-bh-18、5-bh-16、5-bh-4、5-bh-7、5-bh-8、5-bh-17、5-bh-5、5-bh-15、5-bh-20、5-bh-3)，和12条igg重链3端序列(3-bh-18、3-bh-13、3-bh-4、3-bh-7、3-bh-1、3-bh-15、3-bh-19、3-bh-3、3-bh-17、3-bh-5、3-bh-6、3-bh-14)。以上序列经进化树分析(如图7所示)，拼接，获得12条igg重链全长序列，分别为h11-18、h19-19、h14-1、h18-15、h7-7、h4-4、h6-13、h17-5、h5-17、h15-3、h20-6、h3-14。

使用表2中kappa轻链5’race引物和3’race引物，进行race扩增，测序，与imgt数据库比对，成功获得18条kappa轻链5端序列(5-bk-14、5-bk-2、5-bk-19、5-bk-5、5-bk-18、5-bk-20、5-bk-3、5-bk-10、5-bk-16、5-bk-7、5-bk-1、5-bk-8、5-bk-17、5-bk-13、5-bk-15、5-bk-4、5-bk-11、5-bk-12)，以及12条kappa轻链3端序列(3-bk-17、3-bk-12、3-bk-3、3-bk-10、3-bk-4、3-bk-18、3-bk-1、3-bk-7、3-bk-16、3-bk-20、3-bk-14、3-bk-15)。以上序列经进化树分析(如图8所示)，拼接，获得多条kappa轻链全长序列，分别为k5-17、k7-4、k8-18、k16-10、k17-1、k18-12、k20-3。

使用表2中lambda轻链5’race引物和3’race引物，进行race扩增，测序，与imgt数据库比对，获得16条lambda轻链5端序列(5-bl-19、5-bl-4、5-bl-3、5-bl-1、5-bl-2、5-bl-10、5-bl-17、5-bl-15、5-bl-9、5-bl-14、5-bl-18、5-bl-20、5-bl-11、5-bl-6、5-bl-5、5-bl-16)，以及16条lambda轻链3端序列(3-bl-11、3-bl-9、3-bl-7、3-bl-20、3-bl-13、3-bl-15、3-bl-16、3-bl-1、3-bl-18、3-bl-3、3-bl-4、3-bl-10、3-bl-14、3-bl-19、3-bl-6、3-bl-17)。以上序列通过建立进化树(如图9所示)，拼接，最终获得多条lambda轻链全长序列，分别为l1-7、l2-13、l3-9、l10-15。

根据以上获得的全长序列，选取牛igg重链h5-17恒定区为框架模板，构建全牛源igg重链表达载体，选取lambda轻链l1-7恒定区为框架模板，构建全牛源igg轻链表达载体。通过与imgt数据库参考igg序列比对，构建进化树，指示利用以上框架模板构建表达的全牛源igg分子为igg2亚型。

全牛源单克隆igg抗体的表达

载体构建

首先利用牛igg重链克隆h5-17的恒定区(ch1+ch2+ch3)基因序列，并在c端引入myc和his标签，序列经cho密码子优化后插入到pcdna3.4载体，获得ch-pcdna3.4；利用牛iglambda轻链克隆l1-7的恒定区(ch1)基因序列，同样在c端引入myc和his标签，序列经cho密码子优化后插入到pcdna3.4载体，获得cl-pcdna3.4。

然后根据单个b细胞pcr获得的重链可变区和轻链可变区基因，并在起始密码子前引入kozak序列(gccacc)，经cho密码子优化后，分别通过not1/nhe1酶切位点和nhe1/ale1酶切位点，插入到ch-pcdna3.4和cl-pcdna3.4载体，最终获得用于表达全牛源igg分子的全长重链载体和轻链载体。

无内毒素质粒制备

按常规方法，把上述获得的全牛源igg分子的全长重链载体和轻链载体转入dh5a感受态细胞，挑取单克隆菌落至5mllb培养基，37℃过夜培养，然后按1:50比例转接至200mllb培养基，继续培养16h。8228×g离心3min收集菌体，参考无内毒素质粒大提试剂盒(北京天根公司)说明书进行无内毒素质粒提取，具体操作步骤如下。

a)离心收集菌体，尽量吸干残余液体，然后加入8ml溶液p1(已加入rnasea)，涡旋、振荡彻底细菌细胞沉淀。

b)向离心管中加入8mlp2，立即温和地上下翻转6-8次，室温作用5min。

c)向离心管中加入8mlp4，立即温和翻转6-8次，至溶液出现白色絮状沉淀。然后室温作用10min。室温8228×g离心10min，使白色沉淀离至管底，将全部溶液小心倒入过滤器cs1中，慢慢推动推柄过滤，滤液收集在干净的50ml离心管中。

d)向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀后转移到吸附柱cp6中，室温8228×g离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cp6重新放回收集管中。

e)向吸附柱cp6中加入10ml漂洗液pw(已加入无水乙醇)，8228×g离心2min，弃去收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中。

f)重复步骤e。

g)向吸附柱cp6中加入3ml无水乙醇，室温8228×g离心2min，弃去废液。

h)将吸附柱cp6重新放回收集管中，8228×g离心5min，以去除残存的漂洗液。

i)将吸附柱cp6置于一个干净的50ml离心管中，向吸附膜中间加入1mlddh2o，室温放置5min，然后室温8228×g离心2min。收集洗脱液，测定质粒浓度，-20℃保存备用。

抗体重链和轻链载体共转染cho-s悬浮细胞

悬浮细胞cho-s培养于含8％co2的37℃恒温培养箱，摇动振幅直径为50mm，转速设置为225转/分钟。转染前一天，调整cho-s细胞密度至3×10⁶个/ml，继续培养18h，然后更换预热新鲜培养基并调整细胞至6×10⁶个/ml。转染时，首先取重链质粒与轻链质粒混合物30μg(重轻链比1:2)，以及转染试剂expifectamine^tmcho80μl分别放入1.5mlep管，然后均加入optipro^tmsfm稀释至1000μl，上下轻轻颠倒4-5次，静置2min。然后把制备的质粒和转染试剂二者混合，上下轻轻颠倒4-5次，形成复合物，然后把该复合物缓慢加入至约1.5×10⁸个cho-s细胞，边加边搅拌，确保在5min内把混合物加入完毕。转染后cho-s细胞放37℃恒温培养箱入，悬浮培养18h，然后补加150μlexpicho^tmenhancer和6mlexpicho^tmfeed，37℃继续培养9天。按5000×g，离心30min，收取细胞培养上清，用于后续纯化抗体。

抗体纯化

表达抗体的细胞上清样本，在纯化之前先经0.22μm滤器过滤，然后使用proteing柱子(proteinghp，gebioscience)在akta蛋白纯化系统上纯化抗体，具体操作步骤如下。

a)首先依次使用5个柱体积的ddh2o、结合缓冲液(20mm磷酸钠盐缓冲液，ph＝7.0)平衡proteing柱子。

b)调整流速至0.5ml/min，开始上样。

c)上样结束后，调整流速至2ml/min，用5个柱体积的结合缓冲液冲洗。

d)使用洗脱缓冲液(0.1m甘氨酸，ph＝2.7)洗脱目的蛋白，用2mlep管收取洗脱蛋白，且在收样前每管加入60μltris-hcl(ph＝9.0)，用于调节洗脱蛋白的ph值。

e)洗脱蛋白透析置换至pbs缓冲液中。-20℃保存备用。

实施例4

抗体鉴定和筛选

sds-page电泳

使用sds-page电泳对表达出的牛igg抗体进行分析，具体操作步骤如下：

a)把待检抗体样本分成两等份，分别加入还原性5×sds-loadingbuffer(含dtt)以及非还原性5×sds-loadingbuffer(不含dtt)，95℃加热5min。

b)取一块12％预制胶，撕去下方封膜，装入蛋白电泳槽，加入mops缓冲液至指定刻度。

c)上样30μl/孔，100v恒压电泳1h。

d)电泳结束后，取出胶块，放入考马斯亮蓝染色液中，轻摇作用30min。

e)使用脱色液进行脱色，摇晃作用15min。

f)更换脱色液至胶块背景清晰，成像。

通过proteing柱子纯化抗体。纯化产物经还原性sds-page分析，表达的全牛源抗体分子还原性sds-page结果图如图10所示，成功表达出了全牛源igg分子，其中重链分子大小约63kda，轻链分子约32kda；非还原性sds-page结果(表达的全牛源抗体分子非还原性sds-page结果图)如图11所示，全长igg分子约190kda，在该条带下方出现多条大于150kda的条带，推测该igg在cho-s表达过程中经受不同程度糖基化修饰。

间接免疫荧光试验(ifa)

本研究借助fmdv(o/mya98/jx/2010毒株)感染的bhk21细胞，通过ifa评价表达的全牛源单克隆抗体与fmdv抗原的反应性，具体操作步骤如下：

a)实验前一天，把bhk21细胞接入到34孔板，待细胞长至单层时接入o型fmdv，放入37℃细胞培养箱，吸附2h后弃去上清病毒液。

b)然后用预冷的甲醇：丙酮(1:1)液固定细胞，室温作用20min。

c)用pbs洗细胞3次，按1-10μg/ml浓度加入待检待全牛源单克隆抗体，37℃孵育1hmin。

d)用pbs洗细胞3次，加入鼠抗his-tagfitc荧光抗体(1：1000稀释)，37℃孵育30min。

e)用pbs洗细胞3次，放入荧光显微镜下观察成像。

ifa结果如图12所示，其中，图12-1为全牛源单抗1与o/mya98/jx/2010毒株感染bhk21细胞实验结果，图12-2为全牛源单抗2与o/mya98/jx/2010毒株感染bhk21细胞实验结果，图12-3为全牛源单抗3与o/mya98/jx/2010毒株感染bhk21细胞实验结果，图12-4为全牛源单抗4与o/mya98/jx/2010毒株感染bhk21细胞实验结果，图12-5为全牛源单抗5与o/mya98/jx/2010毒株感染bhk21细胞实验结果，图12-6为全牛源单抗6与o/mya98/jx/2010毒株感染bhk21细胞实验结果，图12-7为全牛源单抗7与o/mya98/jx/2010毒株感染bhk21细胞实验结果，图12-8为全牛源单抗8与o/mya98/jx/2010毒株感染bhk21细胞实验结果，图12-9为全牛源单抗9与o/mya98/jx/2010毒株感染bhk21细胞实验结果，图12-10为全牛源单抗10与o/mya98/jx/2010毒株感染bhk21细胞实验结果，图12-11为全牛源单抗11与o/mya98/jx/2010毒株感染bhk21细胞实验结果，图12-12为全牛源单抗12与o/mya98/jx/2010毒株感染bhk21细胞实验结果，图12-13为全牛源单抗13与o/mya98/jx/2010毒株感染bhk21细胞实验结果，图12-14为全牛源单抗14与o/mya98/jx/2010毒株感染bhk21细胞实验结果，阴性对照为正常bhk21细胞。结果显示，表达的全牛源igg分子经筛选有多株能够与o型fmdv特异结合。

病毒微量中和试验

使用三个谱系的o型fmdv(o/mya98/jx/2010、o/hn/cha/93和o/tibet/99毒株)对免疫后的血清样本进行病毒交叉中和实验。具体实验步骤如下：

a)每孔加入50μl待检区抗体，在96孔板内进行倍比稀释。然后，每孔加入100μl含100tcid50的fmdv，37℃作用1h。同时设置含有10、100以及1000个tcid50的对照孔(不加血清样本)。

b)每孔加入100μl含5×10⁴个bhk21细胞的完全培养基，放入37℃含5％co2的培养箱作用72h。

c)弃去上清细胞液，加入预冷的固定液(甲醇:丙酮＝1:1)，-20℃固定20min。

d)弃去固定液，每孔加入100μl结晶紫溶液进行染色。30min后，冲洗96孔板，观察50％细胞未病变的血清最大稀释度。以血清最大稀释度倒数的log10来代表病毒中和抗体(vna)滴度值。

病毒中和活性

病毒中和试验结果显示(表3)，表达的igg分子中，序号8、10、11、12、13和14能够中和o型fmdv三个谱系的病毒(o/mya98/jx/2010毒株、o/hn/cha/93毒株和o/tibet/99毒株)；序号2和5能够中和两个谱系病毒(o/mya98/jx/2010毒株、o/hn/cha/93毒株)；序号7对mya98谱系病毒(o/mya98/jx/2010毒株)具有中和作用

表3全牛源单抗对o型三个谱系fmdv的中和效价

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>一种全牛源o型口蹄疫病毒广谱中和抗体的制备方法

<160>18

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ccctcctctttgtgctstcagccc24

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gtcaccatgctgctgagaga20

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ggaccacctgagaggaggccgac23

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gtccagaatctctcgctgctgac23

<210>5

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

agaggrgtybtgtcccagg19

<210>6

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

ctttcggggctgtggtggaggc22

<210>7

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

ggggaaggtccagaatctctcgc23

<210>8

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

acgcaggacaccagggggaagac23

<210>9

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

caccatggcctggtcccctctg22

<210>10

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

aagtcgctgatgagacacacc21

<210>11

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

tgggcccaggctgtrctg18

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

gcgggaacagggtgaccgag20

<210>13

<211>42

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

gattacgccaagcttcaggacatacacctgcggctcccgggc42

<210>14

<211>43

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

gattacgccaagcttcgagccggtgaccgtgacctggaactcg43

<210>15

<211>43

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>15

gattacgccaagcttgctcccctcgtgcgtgacctcgcagctg43

<210>16

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>16

gattacgccaagcttcagcaagtacgyggccagcagctac40

<210>17

<211>42

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>17

gattacgccaagcttcgagggtggtagtcaggctcttgtggc42

<210>18

<211>43

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>18

gattacgccaagcttgagcagctgaagaccggaactgtctctg43