抗逆相关蛋白Z76在调控植物抗逆性中的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及抗逆相关蛋白z76在调控植物抗逆性中的应用。

背景技术

在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，可以利用生物技术改进植物生长特性，进而提高植物对逆境的适应能力。

在干旱和高盐等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害,增强对胁迫环境的抗性。

技术实现要素：

本发明的目的是提高植物的抗逆性。

本发明首先保护蛋白质z76在调控植物抗逆性中的应用；所述蛋白质z76可为a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物抗逆相关的蛋白质。

其中，序列表中序列2由267个氨基酸残基组成。

为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述蛋白质z76的核酸分子在调控植物抗逆性中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，编码所述蛋白质z76的核酸分子可为b1)或b2)或b3)或b4)所示的dna分子：

b1)编码区如序列表中序列1所示的dna分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的dna分子；

b3)与b1)或(b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质z76的dna分子；

b4)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质z76的dna分子。

其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

其中，序列表中序列1由804个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。

上述应用中，所述调控植物抗逆性可为增加植物抗逆性。

上述应用中，所述抗逆性可为抗盐性和/或抗旱性。

上述应用中，所述植物可为如下c1)至c8)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)十字花科植物；c5)玉米；c6)玉米合344自交系；c7)拟南芥；c8)野生型拟南芥columbia-0亚型。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，可包括如下步骤：提高出发植物中所述蛋白质z76表达量和/或活性，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的抗逆性增强。

上述方法中，所述“提高出发植物中所述蛋白质z76表达量和/或活性”可通过多拷贝、改变启动子、调控因子、转基因等本领域熟知的方法，达到增加植物中所述蛋白质z76表达量和/或活性的效果。

上述方法中，所述“提高出发植物中所述蛋白质z76表达量和/或活性”可通过向出发植物中导入提高所述蛋白质z76表达量和/或活性的物质实现。

所述“向出发植物中导入提高所述蛋白质z76表达量和/或活性的物质”具体可通过向出发植物中导入编码所述蛋白质z76的核酸分子实现。

上述方法中，所述编码蛋白质z76的核酸分子可为b1)或b2)或b3)或b4)所示的dna分子：

b1)编码区如序列表中序列1所示的dna分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的dna分子；

b3)与b1)或(b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质z76的dna分子；

b4)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质z76的dna分子。

其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

其中，序列表中序列1由804个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。

上述方法中，所述“向出发植物中导入编码所述蛋白质z76的核酸分子”可通过向出发植物中导入重组载体实现；所述重组载体可为向表达载体插入编码所述蛋白质z76的核酸分子，得到的重组质粒。所述重组载体具体可为实施例提及的重组质粒prokⅱ-z76。所述重组质粒prokⅱ-z76具体是将序列表中序列1所示的dna分子插入prokⅱ载体的限制性内切酶kpni和saci的酶切识别位点之间得到的。

本发明还保护一种植物育种方法，可包括如下步骤：增加植物中所述蛋白质z76的含量和/或活性，从而增加抗逆性。

上述任一所述方法中，所述抗逆性可为抗盐性和/或抗旱性。

上述任一所述方法中，所述植物可为如下c1)至c8)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)十字花科植物；c5)玉米；c6)玉米合344自交系；c7)拟南芥；c8)野生型拟南芥columbia-0亚型。

上述任一所述干旱可通过加入甘露醇模拟(在实验室条件下)。加入的甘露醇浓度越高，则环境的干旱程度越大。

实验证明，在野生型拟南芥中过表达z76基因，得到转z76基因拟南芥；与野生型拟南芥相比，转z76基因拟南芥的抗逆性增强。因此，蛋白质z76在培育抗逆性增强的植物中具有重要的理论意义和实用价值。

附图说明

图1为干旱胁迫和盐胁迫下，z76基因的表达模式分析。

图2为盐胁迫处理条件下，拟南芥的生长状态和萌发率统计结果。

图3为盐胁迫处理条件下，拟南芥的根长统计结果。

图4为盐胁迫处理条件下，拟南芥的根部生长状态。

图5为干旱胁迫处理条件下，拟南芥的生长状态和萌发率统计结果。

图6为干旱胁迫处理条件下，拟南芥的根长统计结果。

图7为干旱胁迫处理条件下，拟南芥的根部生长状态。

图8为生理指标测定结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

野生型拟南芥(arabidopsisthaliana)(columbia-0亚型)记载与如下文献中：kimh，hyuny，parkj，parkm，kimm，kimh，leem，moonj，leei，kimj.ageneticlinkbetweencoldresponsesandfloweringtimethroughfveinarabidopsisthaliana.naturegenetics.2004，36:167-171)。拟南芥(arabidopsisthaliana)(columbia-0亚型)在下文中简称野生型拟南芥。

prokⅱ载体记载与如下文献中：huiyanguo，yuchengwang，liuqiangwang，pinghu，yanminwang，yuanyuanjia，chunruizhang，yuzhang，yimingzhang，chaowangandchuanpingyang.expressionofthemybtranscriptionfactorgenebplmyb46affectsabioticstresstoleranceandsecondarycellwalldepositioninbetulaplatyphylla.plantbiotechnologyjournal(2017)15：107–121.

trizol试剂为invitrogen公司的产品。revertraaceqpcrrtmastermixwithgdnaremover为toyobo公司的产品。

下述实施例中，玉米合344自交系简称玉米。

下述实施例中，利用spss16.0(spssinc,chicago，il，usa)软件进行统计分析。单因素方差分析比较不同株系(wt、oe-3和oe-16)在同一处理条件下差异是否具有显著性(星号代表p<0.05,双星号代表p<0.01)。

下述实施例中，加入不同浓度的甘露醇用于模拟干旱环境。甘露醇浓度越高，则环境的干旱程度越大。

实施例1、抗逆相关蛋白z76编码基因的克隆

1、提取玉米根系的总rna，然后反转录，得到玉米根系的cdna。

2、以玉米根系的cdna为模板，采用引物z76-kpni-f：5’-cggggtaccatggacgacggggacctggat-3’和引物z76-saci-r：5’-ccgagctctcacttcttttcaacatttgg-3’组成的引物对进行pcr扩增，得到约819bp的pcr扩增产物。

3、取步骤2得到的pcr扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳，然后回收约819bp的片段。

4、采用pgm-t试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司的产品)将步骤3回收的片段和pgm-t(pgm-t试剂盒中的组件)进行连接，得到重组t载体。具体步骤如下：

(1)平末端目的片段加a

制备反应体系1。反应体系1为20μl，由15μl步骤3回收的片段、4μltailing-areactionbuffer(pgm-t试剂盒中的组件)和1μltaqdnapolymerase(pgm-t试剂盒中的组件)组成。

取反应体系1，72℃处理30min，得到目的片段。

(2)目的片段连入t载体

制备反应体系2。反应体系2为10μl，由1μl10×t4dnaligationbuffer(pgm-t试剂盒中的组件)、1μlt4dnaligase(浓度为3u/μl)、1μlpgm-t(浓度为50ng/μl)、4μl目的片段和3μlddh2o组成。

取反应体系2，22℃处理1h，得到连接产物。

(3)转化

(3-1)将16μliptg溶液(浓度为50mg/ml)和40μlx-gal溶液(浓度为20mg/ml)均匀涂布在含有amp的lb固体平板上，37℃避光1h；

(3-2)取装有100μl大肠杆菌dh5ɑ感受态的离心管，加入10μl连接产物，轻弹混匀，冰浴30min；

(3-3)完成步骤(3-2)后，42℃热激90s，将所述离心管立即冰浴3min，期间不要摇动离心管；

(3-4)完成步骤(3-3)后，向所述离心管中加入800μl37℃预热的lb液体培养基，37℃、130rpm振荡培养1h；

(3-5)完成步骤(3-4)后，取所述离心管，离心，弃上清，将菌液混匀，吸取100μl均匀涂在步骤(3-1)制作的lb固体平板上，倒置lb固体平板，37℃过夜培养。

(4)酶切和测序

(4-1)挑取lb固体平板上的白色单菌落，采用引物z76-kpni-f和引物z76-saci-r进行菌落pcr。如果某单菌落的pcr扩增产物中含有约819bp的片段，则该单菌落为阳性单菌落。

(4-2)用牙签挑取阳性单菌落，接种于含有amp的lb液体培养基，37℃过夜培养，得到培养菌液。

(4-3)取所述培养菌液，提取质粒。

(4-4)取步骤(4-3)提取的质粒，用限制性内切酶kpni和saci进行酶切。

结果表明，酶切产物中含有约819bp的片段。

(4-5)将步骤(4-3)提取的质粒送至华大基因进行测序。测序引物为t7f和m13r。

测序结果表明，质粒(即重组t载体)中含有序列表中序列1所示的dna分子(即z76基因)，编码序列表中序列2所示的z76蛋白或蛋白质z76。

实施例2、表达模式分析

一、干旱胁迫下z76基因的表达模式

1、cdna的获得

(1)选取籽粒饱满、大小一致的玉米种子，先用自来水冲洗干净，再加入10％(v/v)次氯酸钠溶液消毒30min，蒸馏水洗净，浸种12h后催芽，将玉米种子置于培养箱中27℃暗培养24h，待长出约1.5cm的根，将玉米种子种在打好孔的泡沫板上，1/2hoagland培养液培养。待玉米生长至三叶一心，选取生长一致的玉米幼苗，用含10％(w/v)peg的1/2hoagland营养液处理12h。取实验材料(根系或叶片)，用锡箔纸包裹，液氮处理30s以上，-80℃保存。

(2)完成步骤(1)后，采用trizol试剂提取实验材料的总rna，得到peg处理12h的rna。

(3)完成步骤(2)后，取peg处理12h的rna，采用revertraaceqpcrrtmastermixwithgdnaremover反转录出第一链cdna，得到peg处理12h的cdna。

按照上述方法，将步骤(1)中的12h分别替换为24h和72h，其它步骤均不变，依次得到peg处理24h的cdna和peg处理72h的cdna。

按照上述方法，将步骤(1)中的12h替换为0h，其它步骤均不变，得到对照cdna。

2、以步骤1得到的各个cdna为模板，使用bio-radchromo4real-timepcr系统实时定量pcr检测玉米根中z76基因的相对表达量(以玉米actin1(grmzm2g126010_t01)为内参)。

反应体系为25μl，由12.5μl2×sybrgreenrealtimepcrmastermix(toyobo公司的产品)、上游引物、下游引物、2μlcdna模板(约100ng)和rnasefreeddh2o组成。上游引物和下游引物在该反应体系中浓度均为0.5μm。

反应程序：94℃30s；94℃12s，58℃30s，72℃30s，45个循环；80℃1s。

检测z76基因的引物为5’-cgtccgagaacaacagcaa-3’和5’-atacgggaacgcaccaatc-3’。

检测玉米actin1的引物为：5’-gatgatgcgccaagagctg-3’和5’-gcctcatcacctacgtaggcat-3’。

将对照cdna中z76基因的相对表达量作为1，其它cdna(peg处理12h的cdna、peg处理24h的cdna或peg处理72h的cdna)中z76基因的相对表达量见图1(左图为叶片，右图为根系)。结果表明，在干旱胁迫下，随着处理时间的延长，叶片中z76基因的相对表达量逐渐增加，根系中z76基因的相对表达量先缓慢上升后下降。

二、高盐胁迫下z76基因的表达模式

1、cdna的获得

(1)选取籽粒饱满、大小一致的玉米种子，先用自来水冲洗干净，再加入10％(v/v)氯酸钠溶液消毒30min，蒸馏水洗净，浸种12h后催芽，将玉米种子置于培养箱中27℃暗培养24h，待长出约1.5cm的根，将玉米种子种在打好孔的泡沫板上，1/2hoagland培养液培养。待玉米生长至三叶一心，选取生长一致的玉米幼苗，用含200mmnacl的1/2hoagland营养液处理12h。取实验材料(根系或叶片)，用锡箔纸包裹，液氮处理30s以上，-80℃保存。

(2)完成步骤(1)后，采用trizol试剂提取实验材料的总rna，得到盐处理12h的rna。

(3)完成步骤(2)后，取盐处理12h的rna，采用revertraaceqpcrrtmastermixwithgdnaremover反转录出第一链cdna，得到盐处理12h的cdna。

按照上述方法，将步骤(1)中的12h分别替换为24h和72h，其它步骤均不变，依次得到盐处理24h的cdna和盐处理72h的cdna。

按照上述方法，将步骤(1)中的12h替换为0h，其它步骤均不变，得到对照cdna。

2、以步骤1得到的各个cdna为模板，使用bio-radchromo4real-timepcr系统实时定量pcr检测玉米根中z76基因的相对表达量(以玉米actin1(grmzm2g126010_t01)为内参)。

反应体系、反应程序、检测z76基因的引物和检测玉米actin1的引物均同步骤一中2。

将对照cdna中z76基因的相对表达量作为1，其它cdna(盐处理12h的cdna、盐处理24h的cdna或盐处理72h的cdna)中z76基因的相对表达量见图1(左图为叶片，右图为根系)。结果表明，在盐胁迫下，随着处理时间的延长，叶片和根系中z76基因的相对表达量先上升后下降。

上述结果表明，在玉米根中z76基因能够被盐和干旱诱导表达。z76基因是玉米根部适应非生物逆境过程中一个重要的调节因子。

实施例3、转z76基因拟南芥的获得及其抗逆性鉴定

一、重组质粒的构建

1、取实施例1构建的重组t载体，用限制性内切酶kpni和saci进行酶切，回收约819bp的酶切片段。

2、取prokⅱ载体，用限制性内切酶kpni和saci进行酶切，回收约11kb的载体骨架。

3、将酶切片段和载体骨架进行连接，得到重组质粒prokⅱ-z76。

二、重组农杆菌的获得

1、将步骤一制备的重组质粒prokⅱ-z76导入根癌农杆菌eha105，得到重组农杆菌，命名为eha105/prokⅱ-z76。

2、将prokⅱ导入根癌农杆菌eha105，得到重组农杆菌，命名为eha105/prokⅱ。

三、转z76基因拟南芥的获得

1、采用拟南芥花序浸花转化法(cloughsj,bentaf(1998)floraldip:asimplifiedmethodforagrobacterium-mediatedtransformationofarabidopsisthaliana.plantj16:735–743.)，将步骤二中1制备的eha105/prokⅱ-z76转至野生型拟南芥中，获得t1代拟转z76基因拟南芥的种子。

2、将t1代拟转z76基因拟南芥的种子种植于含50mg/l卡那霉素的ms固体培养基，能够正常生长的拟南芥(抗性苗)即为t1代转z76基因阳性苗。t1代转z76基因阳性苗收到的种子即为t2代转z76基因拟南芥的种子。

3、将步骤2筛选出的不同株系的t2代转z76基因拟南芥的种子播种于含50mg/l卡那霉素的ms固体培养基上进行筛选，如果某株系中能够正常生长的拟南芥(抗性苗)的数目与不能够正常生长的拟南芥(非抗性苗)的数目比例为3：1，则该株系为z76基因插入一个拷贝的株系，该株系中的抗性苗收到的种子即为t3代转z76基因拟南芥的种子。

4、将步骤3筛选出的t3代转z76基因拟南芥的种子再次播种于含50mg/l卡那霉素的ms固体培养基上进行筛选，均为抗性苗的即为t3代纯合转z76基因拟南芥。

随机选择两个t3代纯合转z76基因拟南芥的株系(分别命名为oe-3和oe-16)，并进行后续实验。

按照上述方法，将eha105/prokⅱ-z76替换为eha105/prokⅱ，其它步骤均相同，得到t3代纯合转空载体拟南芥的植株，简称转空载体拟南芥。

四、耐盐性鉴定

正常培养的条件为：22±2℃。光暗交替培养的周期具体为：16h光照培养/8h黑暗培养。光照培养时的光照强度为80-100μmol·m^-2·s^-1。

待测拟南芥种子为野生型拟南芥种子、转空载体拟南芥种子、oe-3的t3代种子或oe-16的t3代种子。

1、萌发率实验

实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：

(1)向ep管中加入待测拟南芥种子，先用75％(v/v)乙醇水溶液浸泡1min、超纯水清洗3-5次，再用10％(v/v)naclo消毒10min、超纯水清洗8-10次，最后在无菌滤纸上晾干，得到无菌的待测拟南芥种子。

(2)完成步骤(1)后，将100粒无菌的待测拟南芥种子播种于待测培养基(1/2ms固体培养基、含50mmnacl的1/2ms固体培养基、含100mmnacl的1/2ms固体培养基或含150mmnacl的1/2ms固体培养基)上，正常培养3d，统计萌发率(萌发率＝已萌发的待测拟南芥种子的粒数/100粒×100％)；正常培养5d观察生长状态。

部分拟南芥种子在固体培养基上的生长状态见图2中左图(wt为野生型拟南芥种子)。部分拟南芥种子正常培养3d的萌发率统计结果见图2中右图(wt为野生型拟南芥种子)：正常培养3d，在1/2ms固体培养基上，待测拟南芥种子的长势基本一致，萌发率也无显著差异(说明非胁迫条件下z76基因的过表达对植物的萌发并无影响)；正常培养3d，在含50mmnacl的1/2ms固体培养基、含100mmnacl的1/2ms固体培养基或含150mmnacl的1/2ms固体培养基上，oe-3和oe-16的萌发率均显著高于野生型拟南芥，野生型拟南芥和转空载体拟南芥的萌发率没有显著差异；正常培养5d，在含50mmnacl的1/2ms固体培养基上、100mmnacl的1/2ms固体培养基或含150mmnacl的1/2ms固体培养基上，oe-3和oe-16的长势均显著优于野生型拟南芥，野生型拟南芥和转空载体拟南芥的萌发率没有显著差异。

结果表明，z76基因的过表达提高了拟南芥在萌发阶段对盐的耐受性。

2、根长实验

实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：

(1)向ep管中加入待测拟南芥种子，先用75％(v/v)乙醇水溶液浸泡1min、超纯水清洗3-5次，再用10％(v/v)naclo消毒10min、超纯水清洗8-10次，最后在无菌滤纸上晾干，得到无菌的待测拟南芥种子。

(2)完成步骤(1)后，将无菌的待测拟南芥种子播种于1/2ms固体培养基，正常培养7d，得到待测拟南芥幼苗。

(3)完成步骤(2)后，将50株长势一致的待测拟南芥幼苗转移至待测培养基(1/2ms固体培养基、含50mmnacl的1/2ms固体培养基或含100mmnacl的1/2ms固体培养基)上，正常培养(竖直)6d观察生长状态并测量根长。

部分拟南芥种子在固体培养基上的生长状态见图4(wt为野生型拟南芥种子)。根长统计结果见图3(wt为野生型拟南芥种子)：在1/2ms固体培养基上，待测拟南芥种子的长势基本一致，根长也无显著差异(说明非胁迫条件下z76基因的过表达对植物的根长并无影响)；在含50mmnacl的1/2ms固体培养基或含100mmnacl的1/2ms固体培养基上，oe-3和oe-16的根长均显著高于野生型拟南芥，野生型拟南芥和转空载体拟南芥的根长没有显著差异。

结果表明，z76基因参与调控盐胁迫下植物根的生长。z76基因的过表达提高了拟南芥对盐的耐受性。

上述结果表明，与野生型拟南芥相比，oe-3和oe-16的抗盐性显著增强。

五、耐旱性鉴定

正常培养的条件为：22±2℃。光暗交替培养的周期具体为：16h光照培养/8h黑暗培养。光照培养时的光照强度为80-100μmol·m^-2·s^-1。

待测拟南芥种子为野生型拟南芥种子、转空载体拟南芥种子、oe-3的t3代种子或oe-16的t3代种子。

1、萌发率实验

实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：

(1)向ep管中加入待测拟南芥种子，先用75％(v/v)乙醇水溶液浸泡1min、超纯水清洗3-5次，再用10％(v/v)naclo消毒10min、超纯水清洗8-10次，最后在无菌滤纸上晾干，得到无菌的待测拟南芥种子。

(2)完成步骤(1)后，将100粒无菌的待测拟南芥种子播种于待测培养基(1/2ms固体培养基、含100mm甘露醇的1/2ms固体培养基、含200mm甘露醇的1/2ms固体培养基或含300mm甘露醇的1/2ms固体培养基)上，正常培养4d，观察生长状态并统计萌发率(萌发率＝已萌发的待测拟南芥种子的粒数/100粒×100％)。

部分拟南芥种子在固体培养基上的生长状态见图5中左图(wt为野生型拟南芥种子)。部分拟南芥种子的萌发率统计结果见图5中右图(wt为野生型拟南芥种子)：在1/2ms固体培养基上，待测拟南芥种子的长势基本一致，萌发率也无显著差异(说明非胁迫条件下z76基因的过表达对植物的萌发并无影响)；在含100mm甘露醇的1/2ms固体培养基上，oe-16的萌发率显著高于野生型拟南芥，oe-3和野生型拟南芥的萌发率差异不显著，野生型拟南芥和转空载体拟南芥的萌发率没有显著差异；在含200mm甘露醇的1/2ms固体培养基或含300mm甘露醇的1/2ms固体培养基上，oe-3和oe-16的萌发率均显著高于野生型拟南芥，野生型拟南芥和转空载体拟南芥的萌发率没有显著差异。

结果表明，z76基因的过表达提高了拟南芥在萌发阶段对干旱的耐受性。

2、根长实验

实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：

(1)向ep管中加入待测拟南芥种子，先用75％(v/v)乙醇水溶液浸泡1min、超纯水清洗3-5次，再用10％(m/v)naclo消毒10min、超纯水清洗8-10次，最后在无菌滤纸上晾干，得到无菌的待测拟南芥种子。

(2)完成步骤(1)后，将无菌的待测拟南芥种子播种于1/2ms固体培养基，正常培养7d，得到待测拟南芥幼苗。

(3)完成步骤(2)后，将50株长势一致的待测拟南芥幼苗转移至待测培养基(1/2ms固体培养基、含200mm甘露醇的1/2ms固体培养基或含300mm甘露醇的1/2ms固体培养基)上，正常培养(竖直)6d观察生长状态并测量根长。

部分拟南芥种子在固体培养基上的生长状态见图7(wt为野生型拟南芥种子)。部分根长统计结果见图6(wt为野生型拟南芥种子)：在1/2ms固体培养基上，待测拟南芥种子的长势基本一致，根长也无显著差异(说明非胁迫条件下，z76基因的过表达对植物的根长并无影响)；在含200mm甘露醇的1/2ms固体培养基或含300mm甘露醇的1/2ms固体培养基上，oe-3和oe-16的根长均显著高于野生型拟南芥，野生型拟南芥和转空载体拟南芥的根长没有显著差异。

结果表明，z76基因参与调控干旱胁迫下植物根的生长。z76基因的过表达提高了拟南芥对干旱的耐受性。

六、生理指标测定

将待测拟南芥种子(野生型拟南芥种子、oe-3的t3代种子或oe-16的t3代种子)消毒后，播种于1/2ms培养基上，待种子萌发8-10d后，移栽至营养土中继续生长3-4周，得到待测拟南芥幼苗。

在温度为22±2℃，光照强度为400μmol·m^-2·s^-1，光周期为16h光照/8h黑暗，相对湿度为65-75％的人工气候室，分别将含200mmnacl的ms液体培养基、含400mmmanntiol的ms液体培养基或水(对照)加入营养土处理待测拟南芥幼苗72h，然后取叶片，进行各种生理生化指标的测定分析。

1、失水率的测定

按照文献(huiyanguo，yuchengwang，liuqiangwang，pinghu，yanminwang，yuanyuanjia，chunruizhang，yuzhang，yimingzhang，chaowangandchuanpingyang.expressionofthemybtranscriptionfactorgenebplmyb46affectsabioticstresstoleranceandsecondarycellwalldepositioninbetulaplatyphylla.plantbiotechnologyjournal(2017)15：107–121)中的记载的方法检测待测拟南芥幼苗叶片的失水率。具体步骤如下：取待测拟南芥幼苗叶片(用水处理的对照)100-200mg，立刻称取鲜重fw；然后放入培养皿中，室温放置0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h或5h后，称取待测拟南芥幼苗叶片的鲜重fw(h)。最后将待测拟南芥幼苗叶片放入80℃的烘箱中烘干至恒重，称重dw。计算每个时间段叶片的失水率：

总含水量＝fw-dw；

每个时间点的含水量＝fw(h)-dw；

每个时间点的失水率＝1-(fw(h)-dw)/(fw-dw)。

检测结果见图8中a(wt为野生型拟南芥种子)。结果表明，与野生型拟南芥相比，oe-3和oe-16的失水率显著降低。

2、脯氨酸含量的测定

按照文献(bates，l.s.，waldren，r.p.，andteare，i.d.(1973).rapiddeterminationoffreeprolineforwater-stressstudies.plantsoil39，205-207.)中的记载的方法检测待测拟南芥幼苗叶片的脯氨酸含量。具体步骤如下：

(1)准确称取待测拟南芥幼苗的叶片0.1g，加入1ml3％(w/v)磺基水杨酸溶液研磨，匀浆转移到离心管中，在沸水浴中提取10min，冷却，3000r/min离心10min，上清液即为脯氨酸的提取液。

(2)标准曲线制作

(2-1)按照下表加试剂

(2-2)完成步骤(2-1)后，摇匀，在沸水浴中显色30min(时间要严格控制，否则会引起沉淀)，冷却至室温，加入2ml甲苯充分震荡，萃取红色产物，萃取后静止一段时间(10-30min)使其分层(红色物质进入到甲苯层)。用注射器或者滴管轻轻吸取上层红色物质于比色皿中，在分光光度计520mn处测定吸光值。

以脯氨酸含量为横坐标，相应的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

(3)样品测定

将步骤(2)中的标准脯氨酸替换为2ml步骤(1)得到的脯氨酸的提取液，其它步骤均不变，得到吸光值。根据步骤(2)绘制的标准曲线，得到脯氨酸的提取液中脯氨酸的含量。进一步，根据下述公式得到待测拟南芥幼苗的叶片中的脯氨酸含量；

c为脯氨酸的提取液中脯氨酸的含量(μg)；v：提取液总体积，即5ml；vt：测定时液体体积，即2ml；w：样品质量。

部分检测结果见图8中b(wt为野生型拟南芥种子)。结果表明，在干旱胁迫或盐胁迫条件下，与野生型拟南芥相比，oe-3和oe-16的脯氨酸含量显著增加。

3、相对电导率的测定

按照文献(luttss，kinetjm，bouharmontj.1996.nacl-inducedsenescenceinleavesofrice(oryzasatival.)cultivarsdifferinginsalinityresistance.annalsofbotany，78，389-398.)中的记载的方法检测待测拟南芥幼苗叶片的相对电导率。具体步骤如下：

(1)取规格为50ml的小烧杯，用去离子水反复冲洗三遍后，再用去离子水平衡24h。

(2)取待测拟南芥幼苗的叶片100mg，用去离子水冲洗三遍，剪碎放入完成步骤(1)的小烧杯中，加入50mlddh2o。

(3)完成步骤(2)后，将所述小烧杯放入真空泵中，真空渗透15min至叶片呈半透明状。

(4)完成步骤(3)后，取所述烧杯，用电导仪测定伸入烧杯，测定各溶液的电导值s1。

(5)完成步骤(4)后，将所述烧杯置于90℃的水浴锅中，水浴20min，待其冷却至室温后，再次测定此时的电导值s2。

(6)计算相对电导率。相对电导率＝(s1/s2)×100％。

部分检测结果见图8中c(wt为野生型拟南芥种子)。结果表明，在干旱胁迫或盐胁迫条件下，与野生型拟南芥相比，oe-3和oe-16的相对电导率下降。

四、超氧化物歧化酶(sod)活性测定

按照文献(wang，y.c.，gao，c.q.，liang，y.n.，wang，c.，yang，c.p.，andliu，g.f.(2010).anovelbzipgenefromtamarixhispidamediatesphysiologicalresponsestosaltstressintobaccoplants.j.plantphysiol.)中的记载的方法检测待测拟南芥幼苗叶片的sod活性。

部分检测结果见图8中d(wt为野生型拟南芥种子)。结果表明，在干旱胁迫或盐胁迫条件下，与野生型拟南芥相比，oe-3和oe-16的sod活性显著提高。

五、叶绿素含量测定

参照专著(李合生.植物生理生化实验原理和技术[m].北京：高等教育出版社)中的记载方法检测待测拟南芥幼苗叶片中总叶绿素含量。

部分检测结果见图8中e(wt为野生型拟南芥种子)。结果表明，在干旱胁迫或盐胁迫条件下，与野生型拟南芥相比，oe-3和oe-16的体内总叶绿素含量显著提高。

六、h2o2含量测定

按照文献(velikova，v.，yordanov，i.，andedreva，a.(2000).oxidativestressandsomeantioxidantsystemsinacidrain-treatedbeanplants:protectiveroleofexogenouspolyamines.plantscience151，59-66.)中的记载的方法检测待测拟南芥幼苗叶片的h2o2含量。

部分检测结果见图8中f(wt为野生型拟南芥种子)。结果表明，在干旱胁迫或盐胁迫条件下，与野生型拟南芥相比，oe-3和oe-16的h2o2含量显著降低。

七、超氧阴离子含量测定

按照文献(ableaj，guestdi，sutherlandmw.1998.useofanewtetrazolium-basedassaytostudytheproductionofsuperoxideradicalsbytobaccocellcultureschallengedwithavirulentzoosporesofphytophthoraparasiticavarnicotianae.journalofplantphysiology，117，491-499.)中的记载的方法检测待测拟南芥幼苗叶片的超氧阴离子含量。

部分检测结果见图8中g(wt为野生型拟南芥种子)。结果表明，在干旱胁迫或盐胁迫条件下，与野生型拟南芥相比，oe-3和oe-16的超氧阴离子含量显著降低。

上述结果表明，与野生型拟南芥相比，oe-3和oe-16的抗逆性显著增强。

<110>黑龙江八一农垦大学黑龙江省农业科学院经济作物研究所

<120>抗逆相关蛋白z76在调控植物抗逆性中的应用

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