一株降解金霉素的鲍氏不动杆菌及其应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，特别涉及一株降解金霉素的鲍氏不动杆菌及其应用。

背景技术

目前禽畜产业广泛使用抗生素，四环素类抗生素是最常使用的抗生素种类之一。进入到禽畜体内的四环素类抗生素大部分以粪尿等形式排出体外，将这些含有四环素类的禽畜粪便作为肥料直接用于农田，那些粪尿中未降解的药物原形或生物活性代谢物就则会进入土壤体系或进一步进入地下水体系。据调查，粪肥中四环素类抗生素的残留量基本在0.03～563.8mg·kg^-1范围内，其中金霉素残留量可达563.8mg·kg^-1(chenetal.,2012；huetal.,2010；国彬等，2011；刘新程等，2008；张慧敏等，2008)。部分地区土壤中四环素类抗生素调查发现金霉素在土壤中的残留浓度最高。

利用微生物方法降解环境中的金霉素残留是一种具有广阔前景的方法。目前在金霉素降解菌株筛选方面已经有少量报道。但目前已经报道的金霉素降解菌株全部为霉菌类。本发明涉及的菌株为细菌鲍氏不动杆菌。国内外尚未见到报道。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株降解金霉素的鲍氏不动杆菌。

本发明的另一目的在于提供所述降解金霉素的鲍氏不动杆菌的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一株降解金霉素的鲍氏不动杆菌，名称为鲍氏不动杆菌(acinetobacterbaumannii)f3，保藏编号为gdmccno：60375，该菌株于2018年5月23日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心。

一种培养所述的降解金霉素的鲍氏不动杆菌的方法，具体步骤为：将降解金霉素的鲍氏不动杆菌接种于培养基中，于30℃～44℃条件下进行培养；

所述的培养基为lb培养基。

所述的培养的条件优选为：于30℃培养箱条件下培养20h。

所述的降解金霉素的鲍氏不动杆菌在解钾方面的应用。

所述的降解金霉素的鲍氏不动杆菌在提高土壤可利用钾元素含量中的应用，鲍氏不动杆菌具有解钾性能，因此能够提高土壤中营养元素含量，从而提高土壤肥力。

所述的降解金霉素的鲍氏不动杆菌在降解金霉素中的应用。

所述的降解金霉素的鲍氏不动杆菌在降解金霉素中的应用，是将上述降解金霉素的鲍氏不动杆菌加入到土壤或水体中。

所述的土壤为含有金霉素的土壤，水体为含有金霉素的水体；利用鲍氏不动杆菌具有降解金霉素的性能，可用于降解土壤和水体中低浓度的金霉素，从而降低金霉素在环境中的残留，达到治理环境污染的效果。

一种金霉素生物降解菌剂，含有上述降解金霉素的鲍氏不动杆菌。

本发明的金霉素降解菌株f3的16srdna序列如下(seqidno.1)：

agaatttccggggcgaccgtggtaccgccctctttgcagttaggctagctacttctggtgcaacaaactcccatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcattctgatccgcgattactagcgattccgacttcatggagtcgagttgcagactccaatccggactacgatcggctttttgagattagcatcacatcgctgtgtagcaaccctttgtaccgaccattgtagcacgtgtgtagccctggccgtaagggccatgatgacttgacgtcgtccccgccttcctccagtttgtcactggcagtatccttaaagttcccatccgaaatgctggcaagtaaggaaaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcagcacctgtatctagattcccgaaggcaccaatccatctctggaaagtttctagtatgtcaaggccaggtaaggttcttcgcgttgcatcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcatttgagttttagtcttgcgaccgtactccccaggcggtctacttatcgcgttagctgcgccactaaagcctcaaaggccccaacggctagtagacatcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccatgctttcgtacctcagcgtcagtattaggccagatggctgccttcgccatcggtattcctccagatctctacgcatttcaccgctacacctggaattctaccatcctctcccatactctagctcaccagtatcgaatgcaattcccaagttaagctcggggatttcacatccgacttaataagccgcctacgcacgctttacgcccagtaaatccgattaacgctcgcaccctctgtattaccgcggctgctggcacagagttagccggtgcttattctgcgagtaacgtccactatctctaggtattaactaaagtagcctcctcctcgcttaaagtgctttacaaccataaggccttcttcacacacgcggcatggctggatcagggttccccccattgtccaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggcggatcatcctctcagacccgctacagatcgtcgccttggtaggcctttaccccaccaactagctaatccgacttaggctcatctattagcgcaaggtccgaagatcccctgctttctcccgtaggacgtatgcggtattagcatccctttcgagatgttgtcccccactaataggcagattcctaagcattactcacccgtccgccgctaggtccggtagcaagctaccttcccccgctcgactgcaga。

上述序列由1427碱基(bp)组成。

本发明中的鲍氏不动杆菌株f3在lb平板上生长时，其菌落为乳白色、圆形、体积较小，表面向外凸起、光滑、有光泽。可在30℃和44℃生长。通过电镜观察发现f3为短杆状。可在金霉素浓度为10mg/l的含有蛋白胨的无机盐液体培养基中生长良好。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明中的菌株f3可通过共代谢方式对金霉素进行降解，将菌株f3接种于金霉素浓度为10mg/l的含有蛋白胨的无机盐液体培养基中，30℃，150r/min震荡培养20h，金霉素降解率即达到95.57％，加菌后35小时达到99.04％的降解率，跟不加菌对照相比f3降解金霉素速率显著提高。说明菌株f3具有降解金霉素的性能，可应用于土壤和水体中低浓度金霉素的降解，菌株f3对低浓度金霉素的降解作用可以降低金霉素在环境中的残留。菌株f3同时还具有解钾性能，有助于增加土壤肥力。因此该菌株f3可应用于液体和土壤中的残留金霉素去除，同时应用于土壤时，还具有增加土壤钾营养元素，增强土壤肥力的作用。

附图说明

图1是菌株f3的菌落形态图。

图2是菌株f3的的系统发育树图。

图3是菌株f3的革兰氏染色图。

图4是菌株f3在含钾长石的培养基上生长情况图(菌落周围出现的水解圈)。

图5菌株f3在10-pmsm培养基中对金霉素的降解率以及细菌的生长情况图(ck代表不加菌对照)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。以下实施例中除特别说明外，均为本领域内的常规实验方法和操作步骤。

实施例1菌株f3的筛选、分离纯化以及鉴定

一、一株金霉素降解菌株f3的筛选方法

1.材料准备

筛菌的污泥来源，取自广东省云浮市新兴县东城镇温氏罗陈猪场一级、二级、三级氧化塘的淤泥，取回后用自封袋分装，于-20℃保存备用。

lb培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母提取粉5.0g，nacl10.0g，蒸馏水1000ml，ph7.0～7.2，固体培养基另加18g琼脂粉。121℃灭菌15min。

无机盐培养基(msm)：将5ml磷酸缓冲溶液(kh2po48.5g·l^-1、k2hpo4·h2o21.75g·l^-1、na2hpo4·12h2o33.4g·l^-1、nh4cl5.0g·l^-1)，3.0ml22.5g·l^-1的mgso4溶液(mgso4·7h2o46.125g·l^-1)，1.0ml0.25g·l^-1的fecl3溶液(fecl3·6h2o0.42g·l^-1)，1.0ml36.4g·l^-1的cacl2溶液(cacl2·2h2o48.22g·l^-1)，1.0ml微量元素溶液(mnso4·h2o39.9mg·l^-1；znso4·h2o42.8mg·l^-1；(nh4)6mo7o24·4h2o34.7mg·l^-1)，均匀后用纯水定容到1l，置于4℃保存备用。

10-pmsm培养基：将10g胰蛋白胨加入1000ml的msm培养基溶液中配制成含10g·l^-1胰蛋白胨的无机盐培养基。

0.2mol·l^-1的磷酸氢二钠溶液：称取含磷酸氢二钠(含12个结晶水)71.6g，溶解后定容至1l。

0.1mol·l^-1柠檬酸溶液：称取21.01g柠檬酸，溶解后定容至1l。

mcllvaine缓冲液：将1000ml0.1mol·l^-1柠檬酸与625ml0.2mol·l^-1磷酸氢二钠混合，用naoh或hcl调ph＝4.0±0.05。

0.1mol·l^-1na2edta-mcllvaine缓冲液：称取60.0g乙二胺四乙酸二钠放入1625mlmcllvaine缓冲液中，超声溶解后摇匀。

2.实验仪器与设备

立式压力蒸汽灭菌锅(bl-50a，上海静科实业有限公司)、便携式ph计(phb-4，上海精密科学有限公司)、离心机(centrifuge5810r)、电热烘箱(dgg-9070a，上海森信实验仪器有限公司)、数显恒温水浴锅(hh系列，常州国宇仪器制造有限公司)、冰箱(rcd-205ag7，海信电器)、生化培养箱(pyx-208s-a，科力仪器)、超净工作台(sw-cj-1f，苏净安泰空气技术有限公司)、涡旋混合器(xw-80a，上海精科实业有限公司)、mycyclerpcr(美国bio-rad公司)、电泳仪(dyy-6c，北京六一仪器厂)、nanodrop核酸蛋白定量检测仪(德国thermo)、凝胶成像系统(美国bio-rad公司)、落地恒温振荡器(hzq-211c)。

3.金霉素降解菌株富集筛选及分离纯化

(1)菌株的分离与纯化

将采集自广东省云浮市新兴县东城镇温氏罗陈猪场一级、二级、三级氧化塘的淤泥制备成土壤悬浊液后，加至5、10、20mg·l^-1的金霉素浓度逐步升高的msm无机盐培养基中驯化培养。驯化筛选后，取1ml培养液加至9ml无菌水中稀释，直至稀释至10^-7为止，从稀释液中取0.1ml菌液涂布至营养琼脂培养基上恒温培养20h后肉眼观察其菌落的形态特征。

(2)菌株筛选

将步骤(1)分离纯化得到的单菌落接种到lb培养基中进行活化培养。活化后按2％(v/v)的比例加至含有金霉素(浓度为10mg·l^-1)的10-pmsm培养基培养上，150r·min^-1摇床(恒温30℃)避光培养，24小时后，用高效液相色谱方法(hplc)对溶液中的金霉素浓度进行测定，计算菌株对金霉素的降解速率。得到高效降解金霉素的菌株f3。

金霉素测定方法：首先将样品0.1mol·l^-1的na2edta-mcllvaine缓冲液等体积混匀后，振荡5min，超声萃取30min，在10000r·min^-1下离心10min，收集上清液。然后过hlb小柱，过柱前，预先用5.0ml甲醇，5.0ml0.1mol·l^-1的na2edta-mcllvaine缓冲液活化hlb小柱。过柱后，用6ml超纯水冲洗柱子，室温干燥15min，样品1/5体积甲醇洗脱。待测液用色谱柱为eclipsexdbc18(4.6×250mm，5μm)，a相为0.1％(v/v)甲酸水溶液，b相为v(甲醇):v(乙腈)＝2:3，v(a):v(b)＝2:1，流速为1ml·min^-1，柱温为35℃；进样量为10μl；通过紫外检测器在检测波长为375nm的的条件下，可以使得金霉素与其他物质的峰完全分离，金霉素的保留时间为4.9～5.0min。

二、菌落形态特征观察及革兰氏染色鉴定

菌株f3在lb培养基上生长较快，可在30℃和44℃生长。其菌落为乳白色、圆形、体积较小，表面向外凸起、光滑、有光泽(图1)；革兰氏染色的结果表明f3为革兰氏阴性菌(图3)。

三、菌株f3的分子生物学鉴定

1.dna提取

采用细菌基因组dna提取试剂盒(离心柱型，天根生化科技公司)提取菌体总dna提取。

2.16srdna扩增

以提取的细菌总dna为模板，采用细菌16srdna通用引物扩增，正向引物为27f：5'-agagtttgatcctggctcag-3'，反向引物为1492r：5'-ggttaccttgttacgactt-3'(stackebrandtetal.,1991)扩增16srrna基因序列。

pcr反应总体系为50μl；上、下引物各2μl；模板dna2μl；2×taqpcrmastermix25μl；灭菌高纯水21μl。

pcr反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，72℃延伸90s，30个循环。72℃补充延伸10min。1.0％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，选择dl2000marker。凝胶成像系统下观察marker的1000bp与2000bp条带中间的范围内出现了明显的条带。

3.16srdna序列的测定

pcr扩增后产物送华大基因生物科技公司(广州)测序。得到菌株的16srdna基因序列如下：agaatttccggggcgaccgtggtaccgccctctttgcagttaggctagctacttctggtgcaacaaactcccatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcattctgatccgcgattactagcgattccgacttcatggagtcgagttgcagactccaatccggactacgatcggctttttgagattagcatcacatcgctgtgtagcaaccctttgtaccgaccattgtagcacgtgtgtagccctggccgtaagggccatgatgacttgacgtcgtccccgccttcctccagtttgtcactggcagtatccttaaagttcccatccgaaatgctggcaagtaaggaaaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcagcacctgtatctagattcccgaaggcaccaatccatctctggaaagtttctagtatgtcaaggccaggtaaggttcttcgcgttgcatcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcatttgagttttagtcttgcgaccgtactccccaggcggtctacttatcgcgttagctgcgccactaaagcctcaaaggccccaacggctagtagacatcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccatgctttcgtacctcagcgtcagtattaggccagatggctgccttcgccatcggtattcctccagatctctacgcatttcaccgctacacctggaattctaccatcctctcccatactctagctcaccagtatcgaatgcaattcccaagttaagctcggggatttcacatccgacttaataagccgcctacgcacgctttacgcccagtaaatccgattaacgctcgcaccctctgtattaccgcggctgctggcacagagttagccggtgcttattctgcgagtaacgtccactatctctaggtattaactaaagtagcctcctcctcgcttaaagtgctttacaaccataaggccttcttcacacacgcggcatggctggatcagggttccccccattgtccaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggcggatcatcctctcagacccgctacagatcgtcgccttggtaggcctttaccccaccaactagctaatccgacttaggctcatctattagcgcaaggtccgaagatcccctgctttctcccgtaggacgtatgcggtattagcatccctttcgagatgttgtcccccactaataggcagattcctaagcattactcacccgtccgccgctaggtccggtagcaagctaccttcccccgctcgactgcaga。

上述序列由1427碱基(bp)组成。

将获得的16srdna基因序列的测序结果在美国国立生物信息中心(ncbi)网页进行blast对比，与lpsn数据库(http://www.bacterio.net/index.html)中相关模式菌株的16srdna基因进行同源性比对分析，下载同源性较高的模式菌株序列在美国国立生物信息中心(ncbi)网站上对扩增产物序列进行blast比对和同源性分析，采用mega6.0软件，以neighbour-joining法构建系统发育树。经16srdna序列进行比较发现，菌株f3与不动杆菌属acinetobacterbaumanniii有99％的同源性(图2)。

四、菌株f3鉴定为一种新功能菌株

根据菌株f3菌落形态特征和分子生物学鉴定结果，将菌株f3鉴定为鲍氏不动杆菌(acinetobacterbaumanniii)，并命名为鲍氏不动杆菌f3(acinetobacterbaumanniiif3)。该菌株已保存于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏号为gdmccno:60375，保藏日期为2018年5月23日。保藏单位地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

目前，国内外尚无文献报道鲍氏不动杆菌具有降解金霉素的功能。因此，鲍氏不动杆菌为一株具有降解金霉素功能的新菌株。

实施例2菌株f3的溶磷和解钾能力测定

1.菌株溶磷功能定性试验：将菌株通过划线法接种至lb培养基中，于37℃培养箱条件下培养24h，然后挑取单菌落点接于pko固体培养基上，设3个重复试验，置于37℃培养箱中5～7天，观察培养基中菌落周围有无溶磷水解形成的透明圈，并观察其透明圈大小，用直尺测量水解圈和菌落圈的直径，并拍照。根据水解圈与菌落圈直径比值来判断菌株是否有溶磷作用及溶磷能力的相对大小。其中，

pko培养基配方：葡萄糖10g·l^-1，(nh4)2so40.5g·l^-1，nacl0.2g·l^-1，mgso4·7h2o0.1g·l^-1，kcl0.3g·l^-1，mnso4·4h2o0.03g·l^-1，feso40.003g·l^-1，ca3(po4)25.0g·l^-1，酵母粉0.5g·l^-1，琼脂粉20.0g·l^-1，ph6.8～7.0。

2.菌株解钾能力定性试验：将菌株用平板划线法接种于lb培养基上，置于37℃培养箱培养24h，然后挑取单菌落点接至溶钾固体培养基上，设3个重复试验，置于37℃培养箱中5～7天，观察培养基中菌落周围有解钾水解形成的透明圈，并观察其透明圈大小，用直尺测量水解圈和菌落圈的直径，并拍照。根据水解圈与菌落圈直径比值来判断菌株是否有解钾作用及解钾能力的相对大小。其中，

溶钾培养基配方：钾长石2.5g·l^-1，na2hpo40.2g·l^-1，mgso4·7h2o0.02g·l^-1，nacl0.2g·l^-1，caco35.0g·l^-1，caso4·2h2o0.1g·l^-1，葡萄糖10g·l^-1，琼脂粉20.0g·l^-1，ph6.8～7.0。

结果表明，菌株f3不具有溶磷性能，但具有解钾能力(图4)，解钾水解圈与菌落圈的直径比为8.16。

实施例3菌株f3在含有金霉素和蛋白胨的无机盐培养基中的生长情况及其对金霉素的降解

将冻存的菌株f3在lb平板上活化20h，挑单菌落在lb培养基中在150r·min-1，30℃的摇床中培养20h后按2％(v/v)的比例分别接种至金霉素含量为10mg·l^-1的含10g·l^-1胰蛋白胨的msm培养基(即10-pmsm培养基)培养35h，每隔5取一次样测其od600；以不添加菌株f3为对照，溶液萃取后用hplc测其金霉素的残留量(金霉素测定方法同实施例1)。

结果表明，未加菌的对照金霉素发生水解，加菌f3后，金霉素降解作用明显加快加强。在20h已达到95.57％，而此时对照仅水解了30.47％，加菌后35小时达到99.04％的降解率，而此时通过水解仅降解了57.52％。从od600值的变化情况能看出菌株f3生长迅速，5h已经达到生长最大密度，之后细菌密度保持稳定，但生物降解仍持续进行(图5)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华南农业大学

<120>一株降解金霉素的鲍氏不动杆菌及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1427

<212>dna

<213>鲍氏不动杆菌(acinetobacterbaumannii)

<220>

<223>鲍氏不动杆菌（acinetobacterbaumannii）f3

<400>1

agaatttccggggcgaccgtggtaccgccctctttgcagttaggctagctacttctggtg60

caacaaactcccatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcg120

gcattctgatccgcgattactagcgattccgacttcatggagtcgagttgcagactccaa180

tccggactacgatcggctttttgagattagcatcacatcgctgtgtagcaaccctttgta240

ccgaccattgtagcacgtgtgtagccctggccgtaagggccatgatgacttgacgtcgtc300

cccgccttcctccagtttgtcactggcagtatccttaaagttcccatccgaaatgctggc360

aagtaaggaaaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagct420

gacgacagccatgcagcacctgtatctagattcccgaaggcaccaatccatctctggaaa480

gtttctagtatgtcaaggccaggtaaggttcttcgcgttgcatcgaattaaaccacatgc540

tccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcatttgagttttagtcttgcgaccgtactcc600

ccaggcggtctacttatcgcgttagctgcgccactaaagcctcaaaggccccaacggcta660

gtagacatcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccatgctt720

tcgtacctcagcgtcagtattaggccagatggctgccttcgccatcggtattcctccaga780

tctctacgcatttcaccgctacacctggaattctaccatcctctcccatactctagctca840

ccagtatcgaatgcaattcccaagttaagctcggggatttcacatccgacttaataagcc900

gcctacgcacgctttacgcccagtaaatccgattaacgctcgcaccctctgtattaccgc960

ggctgctggcacagagttagccggtgcttattctgcgagtaacgtccactatctctaggt1020

attaactaaagtagcctcctcctcgcttaaagtgctttacaaccataaggccttcttcac1080

acacgcggcatggctggatcagggttccccccattgtccaatattccccactgctgcctc1140

ccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggcggatcatcctctcagacccgct1200

acagatcgtcgccttggtaggcctttaccccaccaactagctaatccgacttaggctcat1260

ctattagcgcaaggtccgaagatcccctgctttctcccgtaggacgtatgcggtattagc1320

atccctttcgagatgttgtcccccactaataggcagattcctaagcattactcacccgtc1380

cgccgctaggtccggtagcaagctaccttcccccgctcgactgcaga1427