一类新型灭绦灵衍生物的制备方法以及在肿瘤治疗上的应用与流程

本发明涉及一类新型灭绦灵衍生物的制备方法以及在肿瘤治疗上的应用。

背景技术

恶性肿瘤是威胁人类健康的“头号杀手”，全球肿瘤的发病率正在呈现迅猛增长趋势。世界卫生组织预计，未来20年全球新发病例数将增加70％，由2012年1400万人，逐年递增至2025年1900万人、2035年2400万人。药物治疗对癌症治疗一直具有很重要的意义。按照药物种类来看，过去10年全球抗肿瘤领域的用药结构从激素转向了靶向治疗：70年代金属铂类和抗生素类抗癌药物，使临床化疗技术向根治性目的迈进了一大步；90年代，植物提取物如紫杉醇、喜树碱类应用于临床，使得肿瘤细胞免疫和抑癌基因的研究进入白热化阶段；直至21世纪，真正开启了肿瘤靶向治疗的时代。靶向药物的一大特点是针对特定靶点产生作用，每个病人的情况各不相同，可以选用的靶向药物也各有不同，一定程度上实现对肿瘤的个体化治疗(1)。从药品的需求趋势来看，疗效明显、副作用小是未来产品发展的主要需求方向，在这种市场需求驱动下，靶向抗肿瘤药物的研发与临床应用将是抗肿瘤药物行业未来主要发展方向之一。

灭绦灵是一种已上市的药物，临床上主要用于寄生虫的治疗。根据大量文献报道，发现它是一种潜在的治疗肿瘤的药物，国内外围绕其进行了大量的相关研究，对其进行相关结构改造得到的化合物部分具有良好的抗肿瘤生物活性。根据文献报道，其可能的信号通路方式有：wnt/β-catenin、mtorc1、stat3、nf-κb、notch(2)。这些大量的研究报道为我们开发这类药物提供了丰富的数据，也为我们开发靶向性药物提供了借鉴。stat3(signaltransducerandactivatoroftranscriptiontype-3)是重要的细胞生长繁殖的调节因子，上世纪90年代逐渐认识到stat3信号传导参与肿瘤细胞的繁殖和分化，是维持肿瘤生存的重要原因之一。stat3蛋白作为抗癌靶点以及stat3抑制剂作为新一代潜在的抗癌靶向药物近几年成为制药领域的热点(3)。

灭绦灵的主体结构为苯甲酰苯胺的结构，依据其结构特点，我们对苯环上的取代基进行结构改造，得到了10多个化合物，其中部分化合物具有良好的抗肿瘤生物活性，而且对不同肿瘤细胞显示出了巨大的活性差异，具有一定的靶向性。

技术实现要素：

本发明主要解决的技术问题是提供了一类类新型含取代基吡啶并嘧啶化合物的制备方法。

为实现上述发明目的，本发明提供了下列通式的化合物在制备方法上的应用。

式i

其中，

r1选自氢，羟基，c1-6烷氧基；

r2选自氢，卤素，c1-6烷基，c1-6烷氧基；

r3、r4、r5选自氢，卤素，硝基

本发明中使用的术语“烷基”是指饱和的直链或支链一价烃基，具有1-6个碳原子(即c1-6烷基)，1-4碳原子(即c1-4烷基)或1-3个碳原子(即c1-3烷基)。“烷基”的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙级、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、新戊基、正己基、2-甲基戊基、2，2-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基等。

本发明所用的术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘，优选的卤素基团为氟、氯或溴。

本发明上述化合物的制备方法，包括如下步骤：

化合物的制备方法：化合物a与b，氯化亚砜在溶剂甲苯中于110摄氏度下反应6-12h得到中间体化合物。中间体化合物经氢氧化锂水解得到目标化合物c。

其中，r1、r2、r3、r4、r5如前所述。

下面对本发明作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本发明，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

在本发明合成化合物的方法中，反应所用的各种原材料是本领域技术人员根据已有知识可以制备得到的，或者是可以通过文献公知的方法制得的，或者是可以通过商业购得的。以上反应方案中所用的中间体、原材料、试剂、反应条件等均可以根据本领域技术人员已有知识可以做适当改变的。

附图说明

图1是stat3(signaltransducerandactivatoroftranscriptiontype-3)信号传导系统示意图；细胞因子(cytokine)与受体结合触发受体的二聚体化(dimerization)或多聚体化(oligomerization)，并使jaks磷酸化(phosphorylation)从而激活stat3信号，通过受体细胞膜内c终端区的特定酪氨酸的磷酸化使stat附集于受体上；自磷酸后，stat形成双向交叉相互作用的双体平行构象；穿膜转运到细胞核内，并与特定的dna启动子结合，诱导相关抗细胞凋亡基因bcl-2、survivin、bcl-xl和jun等的表达。

图2是实施例1中化合物niclosamide与stat3蛋白sh2功能域虚拟分子对接的实验结果，化合物niclosamide呈现在功能域作用界面上，不参与氢键相互作用的非极性氢原子(h)均无标记，在stat3蛋白sh2区间上面，参与niclosamide分子相互作用的关键氨基酸有：赖氨酸591和精氨酸609和丝氨酸611、613、636和精氨酸595分别用lys591、arg609、ser611、glu612、ser613和arg595标记；stat3蛋白sh2区间的β折叠，α螺旋和无规则卷曲分别用缓直带，螺旋带和细管表示。虚拟对接的结果显示，化合物niclosamide与stat3蛋白sh2功能域的磷酸化作用位点arg609+lys591和二区精氨酸595均有强相互作用，推断该化合物为作用在stat3磷酸化作用位点的stat3信号传导抑制剂。

图3是niclosamide、nc008、nc009、nc010、nc012、nc019诱导乳腺癌癌细胞、结肠癌癌细胞和肺癌癌细胞凋亡mtt实验，图中mtt细胞实验的结果以ic50(mmol/l)值进行表征。该实验结果表明，化合物nc008、nc009、nc010、nc012、nc019能有效诱导乳腺癌mba-md-231、mcf-7，结肠癌ct-26等细胞株的凋亡。

图4是化合物niclosamide蛋白免疫印迹的结果。蛋白免疫印迹实验的结果以将电泳分离后的细胞总蛋白质从凝胶转移到固相支持物膜上，根据抗原抗体特异原理，分别通过stat3、p-stat3、β-actin抗体检测相应蛋白表达量。结果如图，可以看到在不同药物作用下，随药物深度增加，mda-mb-231表达stat3、β-actin蛋白量不变，而p-stat3表达量呈下降趋势，化合物niclosamide明显抑制了p-stat3的表达。

具体实施方式

化合物合成方法以化合物5-氯-n-(4-硝基苯)-2-羟基苯甲酰胺为例：

实施例1：5-氯-n-(4-硝基苯)-2-羟基苯甲酰胺的制备

5-氯水杨酸1.73g，4-硝基苯胺1.38g，加入到100ml圆底烧瓶中，再加入30ml甲苯，然后搅拌下加入2ml的氯化亚砜，110摄氏度下回流8h。反应完毕，冷却至室温，减压去除溶剂，得到黄色固体混合物。

将得到的黄色固体混合物加入20ml乙醇，30ml水，再加入一水合氢氧化锂2g，室温下搅拌反应12h。反应完毕，减压除去乙醇，向反应液中加入水40ml，调ph至4左右，搅拌1h。将处理后的反应液过滤，滤饼用30ml水洗涤，得到黄色固体化合物。所得的黄色固体干燥处理后加入30ml乙醇打浆处理，过滤，得到淡黄色产物，干燥后称重大约1.08g。1h-nmr(6d-dmso)：611.48(s，1h)，10.87(s，1h)，8.30-8.27(d，2h)，8.01-7.98(d，2h)，7.83-7.82(d，1h)，7.50-7.46(dd，1h)，7.06-7.03(d，1h)。

试验例1：虚拟分子对接(docking)实验

方法：为了提供一组合理的计算机预测的选择性靶标攻击stat3的化学探针，发明人用stat3sh2区的磷酸化络氨酸(py-705)结合区域作为计算机配位模拟(docking)位点，主要包括磷酸化酪氨酸作用位点arg609和疏水作用位点glu638。stat3sh2的结构坐标取于蛋白质结构数据库(pdbdatabank，id：1bg1)。分子对接(docking)的方法：所有的计算机配位模拟(docking)的实验均在sybylx2.1.1的操作平台上完成，所用的计算机配位模拟(docking)的工具为sueflexdock。依据所选的位点(主要包括磷酸化酪氨酸作用位点arg609和疏水作用位点glu638)计算，确定势能面(potentialgradient)并作计算机配位模拟(docking)的实验(4、5)。依据模拟(docking)的分数(score)和构象及相互作用分析。

试验例2：诱导乳腺癌、肺癌和结肠癌癌细胞凋亡mtt的实验

方法：收集对数生长期mda-mb-231或pc9细胞，计数，调整细胞悬液浓度为50000个/ml，每孔加入100μl细胞悬液即每孔5000个细胞；mda-mb-231或pc9细胞加化合物药物处理，加药终浓度为0.1、0.3、1、3、10、30、100、300(μm/l)几个梯度，并继续培养48h；药物处理后，每孔加入噻唑蓝试剂50μl(1mg/ml)，37度孵育4小时，甩板弃去孔中液体，沥干水份，用滤纸吸净残留液，然后加入100μl二甲基亚砜，在水平震荡器上反应7-8分钟，至蓝紫色结晶完全溶解，上酶标仪读值，吸收波长为570nm，记录结果。

试验例3：stat3蛋白免疫印迹(westernblot)实验

1、细胞培养及加药：

(1)取对数生长期mda-mb-231细胞，以胰酶消化后，用含10％胎牛血清的rpmi-1640培养基制成密度为300000个/ml的单细胞悬液，以每孔加入2ml细胞悬液接种至6孔平底板中。

(2)37℃、5％co2培养箱孵育，待细胞贴壁后，实验组加入含不同浓度的药物，1小时后加入浓度为1mg/ml白介素6(il-6)30ul刺激细胞，白介素6(il-6)终浓度为30ng/ml。

(3)继续培养0.5小时后，用ripa裂解液裂解细胞收集蛋白。

2、细胞收集和裂解

(1)去除上层培养基，六孔板中细胞用磷酸盐缓冲液(pbs)洗两次。加入预冷的ripa细胞裂解液(蛋白酶抑制剂和苯甲基磺酰氟与裂解液均以1∶100的比例提前加入混匀)160μl。用提前洗净的细胞刮子将细胞裂解液刮下来，收集到一个干净的1.5ml离心管中。

(2)在冰上放置，裂解30分钟，每隔一定的时间(6分钟)涡旋一次。

(3)4℃，12000rpm，离心12分钟。

(4)将细胞上清液移入到一个干净的离心管中。细胞上清分两部分：取5μl加入到1.5ml的离心管中用于bca测蛋白含量，再加入45μl的1×磷酸盐缓冲液(pbs)混匀备用；剩余的细胞上清定量取140μl，加入5×sds上样缓冲液(loadingbuffer)35μl，混匀后在沸水中煮沸8分钟，离心后-20℃冰箱中保存。

(5)蛋白浓度测定步骤：

a、1×磷酸盐缓冲液(pbs)稀释蛋白标准品：

b、bca工作液配制：根据标准品和待测样品的个数，计算出总共所需a与b混合工作液的量。按bca试剂a与b体积比50∶1的比例，配制好工作液，涡旋振荡混匀备用。

c、将蛋白标准液和用磷酸盐缓冲液(pbs)稀释好的样品上清液(10倍稀释)各取25μl加入到新的96孔板中。然后再分别加入200μl的提前配好的bca工作液充分混匀。切记不要吹打产生气泡，盖紧96孔板板盖，在37℃恒温箱中反应30分钟。

d、取出96孔板恢复至室温3至5分钟，在酶标仪上测定在562nm波长的吸光度值，并作出标准曲线并计算出每个样品的1μl/protein含量以备蛋白上样。

3、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)

(1)固定制胶板，配制10％的sds-page分离胶。

按照下表配制分离胶：10ml

(2)将混好的分离胶分别加入到2块胶板中，加到离顶部1.0厘米的位置，用无水乙醇填满胶板，静置30至45分钟。

(3)分离胶凝好后，倒出剩余的无水乙醇，并用滤纸将剩余无水乙醇吸干净。

(4)按照下表配制5％浓缩胶5ml

(5)将配制好的浓缩胶缓慢地加入胶板中，避免产生气泡，插入样品梳，静置30至45分钟。

(6)取出蛋白样品，100℃水浴加热5分钟，转速10000rpm，离心10分钟。

(7)将胶板固定到电泳槽中，加入sds-page电泳缓冲液，拔出样品梳，按照顺序将处理好的蛋白样品加入到样品槽中。

(8)80v电泳40分钟。

(9)换电压120v电泳大约1.5小时直至溴酚蓝跑出胶体；

4、western-blot转膜

(1)将电泳完毕的sds-page胶放入tbst缓冲液中漂洗一次，蛋白胶放到转膜缓冲液中浸泡。

(2)将一层海绵垫在膜转移缓冲液中浸湿，用镊子夹到转膜仪上，按照海绵垫，三层滤纸，蛋白胶，聚偏氟乙烯(pvdf)膜，三层滤纸，海绵垫，顺序放好，对齐，夹起放到转膜仪上，操作时，滤纸、海绵垫均要在转膜缓冲液中浸湿。每层之间若有气泡应用玻璃试管轻轻滚动将其赶出。

(3)打开转膜仪，300ma转膜75分钟。

(4)将膜取出，放入tbst缓冲液中，60rpm水平震荡仪漂洗3次，每次8分钟。

(5)用5％牛血清白蛋白(bsa)封闭液20ml，60rpm水平震荡仪室温封闭2小时。

(6)用加有3μl一抗(stat3和p-stat31∶1000)的3ml抗体孵育液，4℃60rpm水平震荡仪过夜孵育。

(7)用10mltbst，常温60rpm水平震荡仪洗涤pvdf膜三次，每次10分钟。

(8)用加有2μl二抗的20ml抗体孵育液，常温60rpm水平震荡仪孵育pvdf膜2小时。

(9)用10mltbst，常温60rpm水平震荡仪洗涤pvdf膜三次，每次10分钟。

(10)取化学发光底物试剂溶液a和溶液b各1ml，室温显色5分钟。

(11)用滤纸将膜上的液体吸干，机器曝片。

与实施例1、试验例2类似的方法，可以得到如下表所示化合物以及相关数据：。

引用文献

1.lippmansm.j，hongwk.oralcancerpreventionandtheevolutionofmolecular-targeteddrugdevelopment[j].journalofclinicaloncology，2005，23(2)：346-356.

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3.shil，zhengh，huw，etal.niclosamideinhibitionofstat3synergizeswitherlotinibinhumancoloncancer[j].oncotargets&therapy，2017，10：1767。