基于Ngpiwi蛋白介导的禽多杀性巴氏杆菌基因敲除菌株及其构建方法和应用与流程

本发明涉及兽用生物制品
技术领域：
，具体涉及一种基于ngpiwi蛋白介导的禽禽多杀性巴氏杆菌基因敲除菌株及其构建方法和应用。
背景技术：
：禽霍乱是由多杀性巴氏杆菌感染家禽引起的一种出血性、败血性传染病，发病率和死亡率都很高，1-3天便出现死亡。禽霍乱在我国部分地区的养鸡场发病严重，常造成严重的经济损失，是对养禽业危害十分严重的传染病之一。2011年10月，于成接等从广西某鸡场产蛋鸡中分离出一株荚膜基因型为a型的多杀性巴氏杆菌，命名为gx-pm，动物回归实验表明，该菌株对鸡有很高的致病性，100cfu即能致使10周龄的鸡3天内全部死亡，并且药敏实验表明，该病原菌对多种抗生素耐药。胡东良等人对我国116株禽源多杀性巴氏杆菌的血清型研究结果显示，我国流行的禽巴氏杆菌的主要血清型是a:1型。目前大多数鸡场仍然使用抗生素作为禽霍乱的预防和治疗措施，长此以往，鸡场菌株容易产生耐药性，并且长时间给药还对禽体产生明显的毒副作用。随着对抗生素滥用危害的重视，对于该病的预防必然依赖于好的生物安全防控措施和有效疫苗作为工具。虽然目前已有一些疫苗采用以下几种：1)常规灭活疫苗，一般是采用流行的禽巴氏杆菌强毒株制备全菌灭活疫苗，还有将血清a:1、a:3和a:4型的禽多杀性巴氏杆菌制成三价油乳灭活疫苗，还有将禽巴氏杆菌和大肠杆菌制成蜂胶二联灭活疫苗，这类灭活疫苗安全性较好，不存在毒力返强等风险，但是也存在不能产生较好的交叉免疫保护，只对相同血清型的菌株感染具有免疫保护的效果。2)传统的禽巴氏杆菌弱毒活疫苗，主要有临床分离出的弱毒株及采用物理化学诱变方法致弱的弱毒菌株，该类疫苗具有产生免疫力快、免疫原性好、免疫谱较广及生产成本低等优点，但是由于致弱机制并不清楚，存在毒力返强的风险。3)亚单位疫苗，将荚膜、外膜蛋白、脂多糖等禽多杀性巴氏杆菌重要毒力因子作为抗原制成亚单位疫苗是当前研究的热点，有学者将禽巴氏杆菌的荚膜物质提取出来，研制出禽多杀性巴氏杆菌荚膜多糖菌苗，不仅保持了该病原菌的免疫原性，还排除了强毒株的安全隐患。也有学者表达及纯化了禽多杀性巴氏杆菌的omph蛋白，研究其免疫保护性结果显示，外膜蛋白h只对同型多杀性巴氏杆菌具有保护作用，并且能产生较好的免疫保护；有学者原核表达的禽多杀性巴氏杆菌脂蛋白plpe能为小鼠提供100％的免疫保护效力；脂多糖(lipopolysaccharide,lps)是多杀性巴氏杆菌主要的免疫原和毒力因子，有学者研究表明从a型禽多杀性巴氏杆菌中分离到的lps制备成单克隆抗体，能为小鼠提供部分保护力，而且由于血清型众多，lps的结构及对致病性的影响都不相同，致使其不利于作为疫苗研发的候选靶点。亚单位疫苗虽然成分单一，效果不尽相同，而且成本很高，生产工艺复杂。因此，研制一种新型的高效、安全、生产工艺简单、成本低廉的疫苗将具有重要价值和意义。随着对多杀性巴氏杆菌毒力基因的深入研究，开发基因工程弱毒疫苗将成为继灭活苗、传统的弱毒活疫苗、亚单位疫苗之后的重要选择。相比较其他疫苗，基因缺失疫苗具有多项优势，针对性地敲除靶基因后，毒力明显减弱并且不存在毒力返强的风险，但却可以刺激宿主产生较高的体液免疫应答、细胞免疫应答及粘膜免疫应答，产生更好的免疫保护效力，还可以作为递呈异源抗原的载体，构建出重组载体疫苗，用途更加广泛。正是意识到这一点，全球的相关学者均试图构建禽多杀性巴氏杆菌的基因工程弱毒疫苗菌株。但遗憾的是，由于多杀性巴氏杆菌基因组操作的困难，目前的基因组改造技术均采用的是抗性选择，即使毒力下降明显，也无法用作基因工程弱毒疫苗，这就限制了其开发为疫苗菌株的可能性。因此，构建多杀性巴氏杆菌基因敲除或敲入的无标记系统将是研制基因工程疫苗菌株的关键。有学者报道了一种新的基因编辑技术gdna/ngago系统，该系统能表现出对核酸进行高效的切割，还有低脱靶效应、对靶位点错配的低容忍度以及易于设计和操作等优点。虽然对于该系统在真核生物中的基因编辑效应尚存在争议，但在细菌中的效果并无研究。荚膜是细菌抗吞噬，抗溶菌酶，抗补体，进而实现免疫逃避的重要毒力因子。不仅如此，还有抗干燥及黏附作用，还具有作为营养物质被吸收的功能。它是细菌合成并转运分泌至菌体外，堆积的黏液性多糖或多肽类物质(harperetal2012)。有学者根据荚膜抗原的差异，将多杀性巴氏杆菌分为a、b、d、e和f五种血清型(carter1955)，不同血清型所产生的荚膜多糖是不相同的，a、d和f型的荚膜分别是由透明质酸(ha)(cifonellijaetal1970)、肝素或肝素硫酸盐和软骨素所组成(deangelispletal2002)。已有学者分析了荚膜生物合成，转运及附着细菌表面的相关基因，对于由透明质酸组成的a型多杀性巴氏杆菌的荚膜合成过程中，荚膜合成基因簇含有10个功能基因，其中phya和phyb基因编码荚膜多糖中的脂质，hyae,hyad,hyac和hyab基因编码荚膜合成所需蛋白，hexd,hexc,hexb和hexa基因编码转运荚膜多糖到细菌表面的蛋白(chungjyetal1998)。由此可见，hyae基因是编码荚膜合成所需蛋白，缺失该基因可能会对荚膜的合成产生影响，并将显著影响其致病力。溶解酶(lysozymes)是动物先天免疫系统的重要效应分子，能够水解肽聚糖而破坏细菌细胞壁，从而达到杀灭细菌的效应。溶菌酶抑制剂(lysozymeinhibitor)能够阻断溶解酶的裂解功能，从而有利于细菌的存活；浑浊相关蛋白(opa)对于病原黏附宿主具有重要的贡献；菌毛对细菌黏附宿主细胞的过程具有一定的贡献，ruffolocg等人对多杀性巴氏杆菌的菌毛进行了鉴定、纯化和分类，发现多杀性巴氏杆菌血清a、b和d型菌株的菌毛都属于ⅳ型菌毛，能帮助巴氏杆菌黏附到宿主粘膜上皮细胞，而致使巴氏杆菌病易于传播和感染，故菌毛与巴氏杆菌的毒力相关。由于多杀性巴氏杆菌基因组中的基因难于敲除，导致多杀性巴氏杆菌基因工程弱毒疫苗的研究滞后。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种基于ngpiwi蛋白介导的禽多杀性巴氏杆菌基因敲除菌株及其构建方法和应用。本发明采用ngpiwi蛋白构建了一套高效的、无分子标记的多杀性巴氏杆菌遗传操作系统。为实现上述目的，本发明所设计一种基于ngpiwi蛋白介导的禽多杀性巴氏杆菌基因敲除菌株，所述禽多杀性巴氏杆菌基因敲除菌株为在禽多杀性巴氏杆菌基因组上缺失潜在毒力相关序列的缺失菌株，所述潜在毒力相关序列为潜在毒力相关基因(putativevirulence-associatedgenes)的orf序列或orf的部分序列。进一步地，所述潜在毒力相关序列选自荚膜合成蛋白基因(hydrogenase-1operonprotein，hyae)orf序列或orf的部分序列、溶菌酶抑制剂基因(lysozymeinhibitor，lyi)orf序列或orf的部分序列、ⅳ型菌毛亚单位蛋白基因(typeivfimbrialsubunitprotein，pilia)orf序列或orf的部分序列和浑浊相关蛋白基因(opacity-associatedprotein，opa)orf序列或orf的部分序列，其中，荚膜合成蛋白基因(hydrogenase-1operonprotein，hyae)orf的核苷酸序列如seqidno.1所示，溶菌酶抑制剂基因(lysozymeinhibitor，lyi)orf序列如seqidno.2所示，ⅳ型菌毛亚单位蛋白基因(typeivfimbrialsubunitprotein，pilia)orf序列如seqidno.3所示，浑浊相关蛋白基因(opacity-associatedprotein，opa)orf序列如seqidno.4所示。再进一步地，所述禽多杀性巴氏杆菌基因敲除菌株为在禽多杀性巴氏杆菌基因组上缺失荚膜合成蛋白基因(hydrogenase-1operonprotein，hyae)orf部分序列的缺失菌株，命名为△hyae-gx-pm，其保藏编号为：cctccno：m2017272，其中，荚膜合成蛋白基因(hydrogenase-1operonprotein，hyae)orf部分序列如seqidno.5所示。该缺失菌株于2017年5月18日送交湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏，菌株中文名称为a型禽多杀性巴氏杆菌δhyae-gx-pm，拉丁文：pasteurellamultocidaδhyae-gx-pm，其保藏编号为cctccno：m2017272。再进一步地，所述禽多杀性巴氏杆菌基因敲除菌株为在禽多杀性巴氏杆菌基因组上缺失溶菌酶抑制剂的orf序列的缺失菌株，命名为△lyi-gx-pm，其中，溶菌酶抑制剂的orf序列如seqidno.2所示；或，所述禽多杀性巴氏杆菌基因敲除菌株为在禽多杀性巴氏杆菌基因组上缺失ⅳ型菌毛亚单位蛋白基因的orf序列的缺失菌株，命名为△pilia-gx-pm，其中，ⅳ型菌毛亚单位蛋白基因的orf序列如seqidno.3所示；或，所述禽多杀性巴氏杆菌基因敲除菌株为在禽多杀性巴氏杆菌基因组上缺失浑浊相关蛋白基因的orf序列的缺失菌株，命名为△opa-gx-pm，其中，浑浊相关蛋白基因的orf序列如seqidno.4所示。上述基于ngpiwi蛋白介导的禽多杀性巴氏杆菌基因敲除菌株的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：1)构建带有ngpiwi基因的温敏自杀基础质粒pshk5ts-ngpiwia.以natronobacteriumgregoryipiwi(ngpiwi)基因序列如seqidno.6所示和ribosomebindingsite(rbs)片段序列如seqidno.7所示为模板，设计引物对：ngpiwi的正反向扩增引物：ngpiwi-l：atgacagtgattgacctcgattcg，ngpiwi-rh-r：gcaagaaaaaatatcaattagaggaatccgacat；rbs的正反向扩增引物：rbs-rh-l：tgtcggattcctctaattgatattttttcttgc，rbs-r：tatgcactcctattatttaactaagttgac；分别扩增得到ngpiwi基因片段和rbs(核糖体结合位点)片段；b.然后将ngpiwi基因片段和rbs片段进行融合，得到融合产物ngpiwi-rbs，c.再将融合产物ngpiwi-rbs插入巴氏杆菌温敏自杀质粒pshk5ts的抗性基因kan的启动子和编码区之间；构建得到带有ngpiwi基因的温敏自杀基础质粒pshk5ts-ngpiwi；2)构建带有ngpiwi和带有左右同源臂的待缺失的潜在毒力相关序列rr的温敏自杀质粒pshk5ts-ngpiwi-rr-lr；a.以待缺失的潜在毒力相关序列rr对应基因的orf缺失部分序列及orf序列上下游各1000bp以内的序列为模板，设计引物；b.扩增得到待缺失的潜在毒力相关序列rr的左右同源臂即为rr-lr，通过融合pcr将左右同源臂串联成单序列，将其与温敏自杀基础质粒pshk5ts-ngpiwi进行酶切、酶连，pcr鉴定筛选出正确的转化子，提取转化子质粒后进行酶切和测序鉴定，获得带有ngpiwi基因的温敏自杀重组质粒pshk5ts-ngpiwi-rr-lr；3)禽多杀性巴氏杆菌基因敲除菌株将pshk5ts-ngpiwi-rr-lr电转入多杀性巴氏杆菌gx-pm，进行pcr鉴定，筛选得到携带目的质粒的菌株；并传代培养，利用ngpiwi介导的同源重组，获得潜在毒力相关序列rr的双交换菌株；最后利用质粒的温敏特性，将上述获得的潜在毒力相关序列rr的双交换菌株进行42℃、无抗生素条件下培养，诱导质粒丢失，从而获得禽多杀性巴氏杆菌rr基因敲除菌株，即为：rr基因序列敲除的菌株δrr-gx-pm。进一步地，所述待缺失的潜在毒力相关序列rr选自荚膜合成蛋白基因(hydrogenase-1operonprotein，hyae)orf序列或orf的部分序列、溶菌酶抑制剂(lysozymeinhibitor，lyi)orf序列或orf的部分序列、ⅳ型菌毛亚单位蛋白基因(typeivfimbrialsubunitprotein，pilia)orf序列或orf的部分序列和浑浊相关蛋白基因(opacity-associatedprotein，opa)orf序列或orf的部分序列。再进一步地，所述步骤2)中，a.待缺失的潜在毒力相关序列rr为荚膜合成蛋白基因(hydrogenase-1operonprotein，hyae)orf序列或orf的部分序列时，以荚膜合成蛋白基因(hydrogenase-1operonprotein，hyae)orf序列及上下游各300序列如seqidno.8所示为模板，设计引物对：左同源臂正反向引物hyae-kpni-l-1：catggtaccggttattatcattggac，hyae-l-2：aacagatgcagtgagatcttggtttacttcaataatttcc；右同源臂正反向引物hyae-r-3：tgaagtaaaccaagatctcactgcatctgttcaatc，hyae-saci-r-4：aaagagctcgagtaagccacttaaacgg；或，b.当待缺失的潜在毒力相关序列rr为溶菌酶抑制剂(lysozymeinhibitor，lyi)orf序列或orf的部分序列时；以溶菌酶抑制剂(lysozymeinhibitor，lyi)orf序列及上下游各1000bp序列(简称lyiorf及上下游各1000bp序列)如seqidno.9所示为模板，设计引物对：左同源臂正反向引物：lyi-saci-l1：aagagctcagatgttattgagtctgcg，lyi-rh-l2：tttaggagtttttatgtaagtcaatactgatc；右同源臂正反向引物：lyi-rh-r3：tgatcagtattgacttacataaaaactcctaaattc，lyi-bamhi-r4：ttggatcctgactttgtctttaacactgc；或，c.当待缺失的潜在毒力相关序列rr为ⅳ型菌毛亚单位蛋白基因(typeivfimbrialsubunitprotein，pilia)orf序列或orf的部分序列时；以ⅳ型菌毛亚单位蛋白基因(typeivfimbrialsubunitprotein，pilia)orf序列及上下游各1000bp序列(简称piliaorf及上下游各1000bp序列)如seqidno.10所示为模板，设计引物对：左同源臂正反向引物pilia-saci-l1：aagagctcgcaaaactgagatgaataggc，pilia-rh-l2：caaaaggagttttatatgtaatgtttcatgagaatcc；右同源臂正反向引物pilia-rh-r3：gattctcatgaaacattacatataaaactccttttgtc，pilia-bamhi-r4：ttggatcctctagataagtctgccagtc；或，d.当待缺失的潜在毒力相关序列rr为浑浊相关蛋白基因(opacity-associatedprotein，opa)orf序列或orf的部分序列时；以浑浊相关蛋白基因(opacity-associatedprotein，opa)orf序列及上下游各1000bp序列(简称opaorf及上下游各1000bp序列)如seqidno.11所示为模板，设计引物对：左同源臂正反向引物opa-saci-l1：aagagctccaggacttaaataaccgttactcgg，opa-rh-l2：taggcaatctgcttacattgtcatgtcctctttag；右同源臂正反向引物opa-rh-r3：agaggacatgacaatgtaagcagattgcctaattaaac，opa-bamhi-r4：aaggatccaatatccgccacagaatactcac。上述禽多杀性巴氏杆菌荚膜合成蛋白基因敲除菌株δhyae-gx-pm的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：1)构建禽多杀性巴氏杆菌靶基因敲除的温敏自杀基础质粒pshk5ts-ngpiwi的具体方法，包括以下步骤：a.分别以seqidno.6和seqidno.7为模板设计ngpiwi片段和rbs片段扩增融合引物以及ngpiwi片段的鉴定引物；分别为：ngpiwi的正反向扩增引物：ngpiwi-l：atgacagtgattgacctcgattcg，ngpiwi-rh-r：gcaagaaaaaatatcaattagaggaatccgacat；rbs的正反向扩增引物：rbs-rh-l：tgtcggattcctctaattgatattttttcttgc，rbs-r：tatgcactcctattatttaactaagttgac；鉴定ngpiwi融合到质粒上的引物：ngpiwi-jd-f：caacccggtaagacacgacttatc，ngpiwi-jd-r：atctgtaacatcattggcaacgc；b.以巴氏杆菌温敏自杀质粒pshk5ts和ngpiwi-rbs片段为模板设计融合引物，分别为：扩增pshk5ts质粒融合片段的引物：pshk5ts-rbs-rh-f：aataataggagtgcataatgagccatattcaacggg，pshk5ts-ngpiwi-rh-r：aggtcaatcactgtcataacaccccttgtattactg；扩增ngpiwi-rbs融合片段的引物：ngpiwi-kan-rh-f：agtaatacaaggggtgttatgacagtgattgacctc，ngpiwi-kan-rh-r：ccgttgaatatggctcattatgcactcctattattta；c.用上述ngpiwi的正反向扩增引物(ngpiwi-l/ngpiwi-r)进行pcr扩增ngpiwi基因，纯化回收得到ngpiwi片段；以野生菌株gx-pm基因组为模板，用rbs扩增引物(rbs-l/rbs-r)进行pcr扩增，纯化回收得到rbs片段；将回收的ngpiwi片段与rbs片段进行串联pcr，得到融合产物ngpiwi-rbs；d.使用融合引物(ngpiwi-kan-rh-f/ngpiwi-kan-rh-r)、以ngpiwi-rbs作为模板，进行pcr扩增，使用融合引物(pshk5ts-rbs-rh-f/pshk5ts-ngpiwi-rh-r)，以温敏质粒载体pshk5ts作为模板，进行pcr扩增。再将两个pcr产物纯化回收后进行infusionpcr，并将5μlinfusionpcr产物转化至大肠杆菌dh5α，涂布卡那抗性的lb琼脂平板，挑取单菌落筛选鉴定，使用引物ngpiwi-jd-f/r进行pcr鉴定，筛选正确的转化子进行培养，并提取质粒，经过测序正确后，将基础质粒命名为pshk5ts-ngpiwi；2)以荚膜合成蛋白基因orf序列及上下游各300bp序列(简称hyae基因orf序列及上下游各300bp序列)如seqidno.8所示为模板，设计敲除hyaeorf部分序列的引物，分别为：左同源臂正反向引物：hyae-kpni-l-1：catggtaccggttattatcattggac，hyae-l-2：aacagatgcagtgagatcttggtttacttcaataatttcc；右同源臂正反向引物：hyae-r-3：tgaagtaaaccaagatctcactgcatctgttcaatc，hyae-saci-r-4：aaagagctcgagtaagccacttaaacgg；基因组上待缺失hyae基因orf序列左、右同源臂两侧的引物：hyae-id-f：cctagcgcaacgaataatcaaac，hyae-id-r：cagtttataagggagagtaagccac；3)以gx-pm基因组为模板，分别用hyae左同源臂正反向引物对(hyae-kpni-l-1/hyae-l-2)和右同源臂正反向引物对(hyae-r-3/hyae-saci-r-4)进行pcr扩增，纯化回收得到左同源臂pcr产物和右同源臂pcr产物，将左同源臂pcr产物和右同源臂pcr产物进行融合pcr，得到融合产物hyae-lr；4)用kpni和saci将融合产物hyae-lr和基础质粒载体pshk5ts-ngpiwi分别进行双酶切，并将酶切产物hyae-lr和线性化的载体片段pshk5ts-ngpiwi进行连接，然后将连接产物转化至大肠杆菌dh5α，涂布卡那抗性的lb琼脂平板，挑取单菌落溶于20μl的灭菌水中，取出3μl作为模板，采用引物pshk5ts-mcs-id-f/pshk5ts-mcs-id-r筛选鉴定，筛选正确的转化子进行培养，并提取质粒；5)采用酶切鉴定方法鉴定pshk5ts-ngpiwi-hyaelr重组质粒；选用kpni单酶切或kpni+saci双酶切方法进行鉴定，每管20μl体系中加质粒1μg，酶各10u，37℃酶切三小时后电泳观察结果，酶切鉴定正确后，进行测序，从而得到正确的重组质粒pshk5ts-ngpiwi-hyaelr；6)将禽多杀性巴氏杆菌gx-pm株制作电转感受态细胞，将重组质粒pshk5ts-ngpiwi-hyaelr加入到gx-pm感受态细胞中进行电转，复苏3h后涂布含有卡那霉素的tsa平板上培养，于28℃培养得到单菌落；利用基因组上待缺失hyae基因orf序列左、右游同源臂两侧的引物hyae-id-f/hyae-id-r引物进行pcr扩增鉴定，若条带大小是1966bp，则为wt株；若条带大小是1603bp，则为缺失突变株；若同时含有两条带，则为缺失菌株和野生菌株混合菌株。；7)将扩增为两条带的菌进行传代，并划线培养进行纯化，再次利用hyae-id-f/hyae-id-r引物进行pcr扩增鉴定，筛选出只能扩增出1603bp大小的菌，并于42℃传代，鉴定得到荚膜合成蛋白基因的orf部分序列的缺失菌株，命名为△hyae-gx-pm，其保藏编号为：cctccm2017272，其中，荚膜合成蛋白基因orf部分序列如seqidno.5所示。本发明还提供了一种利用基于ngpiwi蛋白介导的禽多杀性巴氏杆菌基因敲除菌株δrr-gx-pm在制备弱毒疫苗中应用。作为优选方案，所述禽多杀性巴氏杆菌基因敲除菌株δrr-gx-pm为△hyae-gx-pm。本发明的有益效果：1、本发明提供的一种基于ngpiwi的无筛选标记的细菌基因敲除构建工程菌株的方法，为禽多杀性巴氏杆菌遗传操作提供了高效的、无分子标记、定点敲除靶基因的优良工具。相比于cas9系统，该系统质粒较小，转化较容易，不需要grna或gdna牵引，所以不存在潜在的脱靶效应；并且该系统应用广泛，还可应用于兔多杀性巴氏杆菌和致病性大肠杆菌的遗传操作，没有菌株物种局限性。2、本发明通过该系统成功构建了禽多杀性巴氏杆菌荚膜相关基因orf部分序列缺失的菌株δhyae-gx-pm，溶菌酶抑制剂相关基因orf序列缺失菌株δlyi-gx-pm，ⅳ型菌毛亚单位蛋白基因orf序列缺失菌株δpilia-gx-pm以及浑浊相关蛋白基因orf序列缺失菌株δopa-gx-pm等。缺失突变株是缺失了潜在毒力基因的orf部分或全部序列，相比于抗性基因介导负向筛选系统，该系统定点敲除靶基因，且没有抗性分子标记，更适合应用于基因工程疫苗的开发；并且筛选效率较高，能达到80％以上。3、通过鸡只感染实验发现了hyae基因缺失菌株相比野生菌株毒力下降显著，具有开发为基因工程疫苗的潜力，开发出的减毒疫苗的免疫保护效率都较好，并且在此基础上开发成为基因工程二联苗或多联苗，为更多禽病的防控提供良好疫苗载体。附图说明图1为本发明所采用或构建的重组质粒；图中，图1a为基础质粒pshk5ts质粒图谱，图1b为重组质粒pshk5ts-ngpiwi质粒图谱；图2为δxx-gx-pm构建的原理模式图(以hyae基因orf部分序列缺失为例)；图3为ngpiwi-rbs扩增结果图；图中，泳道1是rbs(140bp)的pcr扩增产物；泳道2是ngpiwi(2664bp)的pcr扩增产物；泳道3是ngpiwi-rbs融合片段(2804bp)；m是dl5000dnamarker；图4为pcr鉴定重组质粒pshk5ts-ngpiwi转化子鉴定结果图；图中，泳道1-7号是鉴定pshk5ts-ngpiwi转化子的pcr扩增产物，泳道8号是阴性对照水的pcr扩增产物；m是dl5000dnamarker；图5为pcr扩增hyae基因上下游同源臂及融合产物结果图；图中，l是hyae左臂片段(706bp)；r是hyae右臂片段(744bp)；lr是hyae左右臂融合片段(1451bp)；m是dl2000dnamarker；图6为pcr扩增鉴定重组质粒pshk5ts-ngpiwi-hyaelr转化子图中，泳道1-8是鉴定质粒转化子的pcr扩增产物，泳道9是阴性对照h2o的pcr扩增产物；m是dl2000dnamarker；图7为酶切重组质粒pshk5ts-ngpiwi-hyaelr的鉴定图；图中，h1：kpni单酶切产物(6851bp)；h2：kpni和saci双酶切产物(1524bp+5327bp)；m1：trans15kdnamarker；m2：trans2kplusdnamarker；图8为pcr鉴定筛选hyae双交换菌株的扩增结果；图中，泳道1-20：以待鉴定菌株为模板的的pcr扩增产物；若条带大小是1966bp，则为wt株；若条带大小是1600bp，则为缺失突变株；泳道21：以np-hyaelr为模板的pcr扩增产物；泳道22：以gx-pm基因组为模板的pcr扩增产物；泳道23：阴性对照h2o的pcr扩增产物；m：dl5000dnamarker；图9为pcr鉴定纯化后hyae基因缺失菌株；a：基因组上待缺失hyae基因orf部分序列左右臂两端引物鉴定hyae基因orf部分序列缺失；b：待缺失hyae基因orf部分序列内部引物鉴定hyae基因orf部分序列缺失；c：引物ngpiwil/r引物鉴定质粒丢弃干净；其中泳道1/2/3/4/5/6：以筛选无质粒hyae突变株基因组为模板的pcr产物；泳道7：以质粒电转菌为模板的pcr产物；泳道8：以gx-pm基因组为模板的pcr扩增产物；泳道9：以np-hyaelr为模板的pcr扩增产物；泳道10：阴性对照h2o的pcr扩增产物；m：dl5000dnamarker或dl2000dnamarker；图10为pcr扩增lyi基因上下游同源臂及融合产物结果图；图中，1是lyi左臂片段(633bp)；2是lyi右臂片段(666bp)；3是lyi左右臂融合片段(1300bp)；m是dl2000dnamarker；图11为pcr扩增鉴定重组质粒pshk5ts-ngpiwi-lyilr转化子图；图中，泳道1-6是鉴定质粒转化子的pcr扩增产物，泳道7是阴性对照h2o的pcr扩增产物；m是dl2000dnamarker；图12为酶切重组质粒pshk5ts-ngpiwi-lyilr的鉴定图；图中，l1：saci单酶切产物(6698bp)；l2：bamhi和ncoi双酶切产物(1309bp+5389bp)；l3：bamhi和saci双酶切产物(2016bp+4682bp)；l4：mlui和saci双酶切产物(2088bp+4610bp)；m1：trans15kdnamarker；m2：trans5kdnamarker；图13为pcr鉴定筛选lyi双交换菌株的扩增结果图；图中，泳道1-20：以待鉴定菌株为模板的的pcr扩增产物；泳道21：以np-lyilr为模板的pcr扩增产物；泳道22：以gx-pm基因组为模板的pcr扩增产物；泳道23：阴性对照h2o的pcr扩增产物；m：dl5000dnamarker；图14为pcr鉴定纯化后lyi基因缺失菌株图；图中，图14a：基因组上待缺失lyi基因orf序列左右臂两端引物鉴定lyi基因orf序列缺失；图14b：待缺失lyi基因orf序列内部引物鉴定lyi基因orf序列缺失；图14c：引物ngpiwil/r鉴定质粒丢弃干净；其中泳道1/2/3/4/5/6：以筛选无质粒lyi突变株基因组为模板的pcr产物；泳道7：以质粒电转菌为模板的pcr产物；泳道8：以gx-pm基因组为模板的pcr扩增产物；泳道9：以np-lyilr为模板的pcr扩增产物；泳道10：阴性对照h2o的pcr扩增产物；m：dl5000dnamarker或dl2000dnamarker；图15为pcr扩增pilia基因上下游同源臂及融合产物结果图；图中，l是pilia左臂片段(709bp)；r是pilia右臂片段(711bp)；lr是pilia左右臂融合片段(1420bp)；m是dl2000dnamarker；图16为pcr扩增鉴定重组质粒pshk5ts-ngpiwi-pilialr转化子图；图中，泳道1-6是鉴定质粒转化子的pcr扩增产物，泳道7是阴性对照h2o的pcr扩增产物；m是dl2000dnamarker；图17为酶切重组质粒pshk5ts-ngpiwi-pilialr的鉴定图；图中，p1：ecorv单酶切产物(6819bp)；p2：ecorv和ncoi双酶切产物(2160bp+4659bp)；p3：bamhi和saci双酶切产物(1430bp+5389bp)；m1：trans2kplusdnamarker；m2：trans15kdnamarker；图18为pcr鉴定筛选pilia双交换菌株的扩增结果；图中，泳道1-20：以待鉴定菌株为模板的的pcr扩增产物；泳道21：以np-pilialr为模板的pcr扩增产物；泳道22：以gx-pm基因组为模板的pcr扩增产物；泳道23：阴性对照h2o的pcr扩增产物；m：dl5000dnamarker；图19为pcr鉴定pilia基因缺失菌株图；图中，图19a：基因组上待缺失pilia基因orf序列左右臂两端引物鉴定pilia基因orf序列缺失；图19b：待缺失pilia基因orf序列内部引物鉴定pilia基因orf序列缺失；图19c：引物ngpiwil/r鉴定质粒丢弃干净；其中泳道1/2/3/4/5/6：以筛选无质粒pilia突变株基因组为模板的pcr产物；泳道7：以质粒电转菌为模板的pcr产物；泳道8：以gx-pm基因组为模板的pcr扩增产物；泳道9：以np-pilialr为模板的pcr扩增产物；泳道10：阴性对照h2o的pcr扩增产物；m：dl5000dnamarker或dl2000dnamarker；图20为pcr扩增opa基因上下游同源臂及融合产物结果图；图中，l是opa左臂片段(709bp)；r是opa右臂片段(711bp)；lr是opa左右臂融合片段(1420bp)；m是dl2000dnamarker；图21为pcr扩增鉴定重组质粒pshk5ts-ngpiwi-opalr转化子图；图中，泳道1-7是鉴定质粒转化子的pcr扩增产物，泳道8是阴性对照h2o的pcr扩增产物；m是trans2kplusdnamarker；图22为酶切重组质粒pshk5ts-ngpiwi-opalr的鉴定图；图中，o1：ecorv单酶切产物(6719bp)；o2：ecorv和ncoi双酶切产物(2060bp+4659bp)；o3：bamhi和saci双酶切产物(1330bp+5389bp)；m1：trans2kplusdnamarker；m2：trans15kdnamarker；图23为pcr鉴定筛选opa双交换菌株的扩增结果图；图中，泳道1-20：以待鉴定菌株为模板的的pcr扩增产物；泳道21：以np-opalr为模板的pcr扩增产物；泳道22：以gx-pm基因组为模板的pcr扩增产物；泳道23：阴性对照h2o的pcr扩增产物；m：dl5000dnamarker；图24为pcr鉴定opa基因缺失菌株图；图中，图24a：基因组上待缺失opa基因orf序列左右臂两端引物鉴定opa基因orf序列缺失；图24b：待缺失opa基因orf序列内部引物鉴定opa基因orf序列缺失；图24c：引物ngpiwil/r鉴定质粒丢弃干净；其中，泳道1/2/3/4/5/6：以筛选无质粒opa突变株基因组为模板的pcr产物；泳道7：以质粒电转菌为模板的pcr产物；泳道8：以gx-pm基因组为模板的pcr扩增产物；泳道9：以np-opalr为模板的pcr扩增产物；泳道10：阴性对照h2o的pcr扩增产物；m：dl5000dnamarker或dl2000dnamarker；图25为δhyae-gx-pm及亲本株瑞氏染色结果图；图中，图25a为gx-pm瑞氏染色结果图，图25b为δhyae-gx-pm瑞氏染色结果图；图26为δhyae-gx-pm及亲本株的生长曲线测定结果图；图27为δhyae-gx-pm和亲本株感染鸡的存活率结果图；图28为鸡感染δhyae-gx-pm和亲本株死亡后的病理解剖结果图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。实施例1构建禽多杀性巴氏杆菌靶基因敲除的温敏自杀基础质粒pshk5ts-ngpiwi的具体方法，包括以下步骤：1)分别以seqidno.6和seqidno.7为模板设计ngpiwi片段和rbs片段扩增融合引物以及ngpiwi片段的鉴定引物；分别为：ngpiwi的正反向扩增引物：ngpiwi-l：atgacagtgattgacctcgattcg，ngpiwi-rh-r：gcaagaaaaaatatcaattagaggaatccgacat；rbs的正反向扩增引物：rbs-rh-l：tgtcggattcctctaattgatattttttcttgc，rbs-r：tatgcactcctattatttaactaagttgac；鉴定ngpiwi融合到质粒上的引物：ngpiwi-jd-f：caacccggtaagacacgacttatc，ngpiwi-jd-r：atctgtaacatcattggcaacgc；2)以多杀性巴氏杆菌温敏自杀质粒pshk5ts和ngpiwi-rbs片段为模板设计融合引物，分别为扩增pshk5ts质粒融合片段的引物：pshk5ts-rbs-rh-f：aataataggagtgcataatgagccatattcaacggg，pshk5ts-ngpiwi-rh-r：aggtcaatcactgtcataacaccccttgtattactg；扩增ngpiwi-rbs融合片段的引物：ngpiwi-kan-rh-f：agtaatacaaggggtgttatgacagtgattgacctc，ngpiwi-kan-rh-r：ccgttgaatatggctcattatgcactcctattattta；3)用上述ngpiwi的正反向扩增引物(ngpiwi-l/ngpiwi-r)进行pcr扩增ngpiwi基因，纯化回收得到ngpiwi片段；以野生菌株gx-pm基因组为模板，用rbs扩增引物(rbs-l/rbs-r)进行pcr扩增，纯化回收得到rbs片段；将回收的ngpiwi片段与rbs片段进行串联pcr，得到融合产物ngpiwi-rbs，结果如图3所示；pcr扩增ngpiwi片段反应体系：pcr反应条件：pcr扩增rbs片段反应体系：pcr反应条件：ngpiwi和rbs的串联pcr体系1：ngpiwi和rbs的串联pcr反应条件1：ngpiwi和rbs的串联pcr体系2：ngpiwi和rbs的串联pcr反应条件2：4)使用融合引物(ngpiwi-kan-rh-f/ngpiwi-kan-rh-r)、以ngpiwi-rbs作为模板，进行pcr扩增，使用融合引物(pshk5ts-rbs-rh-f/pshk5ts-ngpiwi-rh-r)，以温敏质粒载体pshk5ts作为模板，进行pcr扩增。再将两个pcr产物纯化回收后进行infusionpcr，并将5μlinfusionpcr产物转化至大肠杆菌dh5α，涂布卡那抗性的lb琼脂平板，挑取单菌落筛选鉴定，使用引物ngpiwi-jd-f/r进行pcr鉴定，结果如图4所示，筛选正确的转化子进行培养，并提取质粒，经过测序正确后，将基础质粒命名为pshk5ts-ngpiwi；pcr扩增载体pshk5ts反应体系：pcr扩增载体pshk5ts反应条件：pcr扩增ngpiwi-rbs反应体系：pcr扩增ngpiwi-rbs反应条件：infusionpcr反应体系：infusionpcr反应条件：pcr扩增鉴定pshk5ts-ngpiwi质粒转化子的反应体系：pcr扩增鉴定pshk5ts-ngpiwi质粒转化子的反应条件：实施例2禽多杀性巴氏杆菌hyae基因orf部分序列缺失菌株△hyae-gx-pm的获得，包括以下步骤：1)以荚膜合成蛋白基因orf序列+上下游各300bp序列(简称hyae基因orf序列及上下游各300bp序列)如seqidno.8所示为模板，设计敲除hyae基因orf部分序列的引物，分别为：左同源臂正反向引物：hyae-kpni-l-1：catggtaccggttattatcattggac，hyae-l-2：aacagatgcagtgagatcttggtttacttcaataatttcc；右同源臂正反向引物：hyae-r-3：tgaagtaaaccaagatctcactgcatctgttcaatc，hyae-saci-r-4：aaagagctcgagtaagccacttaaacgg；基因组上待缺失hyae基因orf部分序列左、右同源臂两侧的引物：hyae-id-f：cctagcgcaacgaataatcaaac，hyae-id-r：cagtttataagggagagtaagccac；待缺失hyae基因orf部分序列的内部鉴定引物，hyae-inner-id-f：atctcaccaagaagaatgtccac，hyae-inner-id-r：gttgattgaacagatgcagtgag；2)以gx-pm基因组为模板，分别用hyae左同源臂正反向引物对(hyae-kpni-l-1/hyae-l-2)和右同源臂正反向引物对(hyae-r-3/hyae-saci-r-4)进行pcr扩增，纯化回收得到左同源臂pcr产物和右同源臂pcr产物，将左同源臂pcr产物和右同源臂pcr产物进行融合pcr，得到融合产物hyae-lr，pcr结果如图5所示；上游同源臂pcr反应体系：pcr反应条件：下游同源臂pcr反应体系：pcr反应条件：hyae-l和hyae-r的串联pcr体系1：hyae-l和hyae-r的串联pcr反应条件1：hyae-l和hyae-r的串联pcr体系2：hyae-l和hyae-r的串联pcr反应条件2：3)用kpni和saci将融合产物hyae-lr和基础质粒载体pshk5ts-ngpiwi(实施例1所构建)分别进行双酶切，并将酶切产物hyae-lr和线性化的载体片段pshk5ts-ngpiwi进行连接，然后将连接产物转化至大肠杆菌dh5α，涂布卡那抗性的lb琼脂平板，挑取单菌落溶于20μl的灭菌水中，取出3μl作为模板，采用引物pshk5ts-mcs-id-f/pshk5ts-mcs-id-r筛选鉴定，pcr结果如图6所示，筛选正确转化子进行培养，并提取质粒。酶连体系：酶切条件是37℃，水浴3h。酶连体系：酶连条件是16℃，水浴8h或过夜。采用mcs两端引物鉴定np-hyaelr质粒转化子的pcr反应体系：采用mcs两端引物鉴定np-hyaelr质粒转化子的pcr反应条件：4)采用酶切鉴定方法鉴定pshk5ts-ngpiwi-hyaelr重组质粒；选用kpni单酶切或kpni+saci双酶切方法进行鉴定，每管20μl体系中加质粒1μg，酶各10u，37℃酶切三小时后电泳观察结果，结果如图7所示，酶切鉴定正确，进行测序正确后，从而得到正确的重组质粒pshk5ts-ngpiwi-hyaelr。5)将禽多杀性巴氏杆菌gx-pm株制作电转感受态细胞，将重组质粒pshk5ts-ngpiwi-hyaelr加入到gx-pm感受态细胞中进行电转，复苏3h后涂布含有卡那霉素的tsa平板上培养，于28℃培养得到单菌落；利用基因组上左、右游同源臂两侧的引物hyae-id-f/hyae-id-r引物进行pcr扩增鉴定，若条带大小是1966bp，则为wt株；若条带大小是1603bp，则为缺失突变株；若同时含有两条带，则为缺失菌株和野生菌株混合菌株。pcr鉴定结果如图8所示，1966bp大带和1603bp小带同时存在。6)将扩增为两条带的菌进行传代，并划线培养进行纯化，再次利用hyae-id-f/hyae-id-r引物进行pcr扩增鉴定，筛选出只能扩增出1603bp大小的菌，并于42℃传代，利用质粒的温敏特性，诱导质粒丢失，将质粒丢失的菌提取其基因组做模板，分别使用基因组上左、右游同源臂两端的引物hyae-id-f/hyae-id-r；待缺失hyae基因orf部分序列内部鉴定引物hyae-inner-id-f/hyae-inner-id-r；ngpiwi的鉴定引物ngpiwi-l/ngpiwi-r同时进行pcr鉴定，结果如图9a所示hyae-id-f/hyae-id-r引物扩增出大小为1603bp的带，如图9b所示hyae-inner-id-f/hyae-inner-id-r引物扩增无带，如图9c所示ngpiwi-l/ngpiwi-r引物扩增无带，说明我们成功构建出hyae基因orf部分序列缺失菌株，命名为△hyae-gx-pm，其保藏编号为：cctccm2017272，其中，荚膜合成蛋白基因orf部分缺失核苷酸序列如seqidno.5所示。利用基因组上待缺失hyae基因orf部分序列左、右游同源臂两侧的引物进行pcr鉴定缺失株的反应体系：利用基因组上待缺失hyae基因orf部分序列左、右游同源臂两侧的引物进行pcr鉴定缺失株的反应体件：该pcr扩增的目的片段大小若为1603bp的条带，则表明hyae基因orf部分序列缺失成功。利用待缺失hyae基因orf部分序列内部鉴定引物进行pcr鉴定缺失株的反应体系：利用待缺失hyae基因orf部分序列内部鉴定引物进行pcr鉴定缺失株的反应条件若pcr扩增条带为阴性，则说明hyae基因缺失成功。ngpiwi鉴定引物ngpiwi-l/ngpiwi-r验证质粒是否丢失的pcr反应体系：ngpiwi鉴定引物ngpiwi-l/ngpiwi-r验证质粒是否丢失的pcr反应条件：若pcr扩增条带为阴性，则说明质粒已经丢失。实施例3禽多杀性巴氏杆菌lyi基因orf序列缺失菌株δlyi-gx-pm的获得，主要步骤与实施例2相同，不同之处包括以下步骤：1)以lyiorf序列及上下游各1000bp序列，如seqidno.9所示为模板，设计敲除lyi基因orf序列引物，分别为：左同源臂正反向引物：lyi-saci-l1：aagagctcagatgttattgagtctgcg，lyi-rh-l2：tttaggagtttttatgtaagtcaatactgatc；右同源臂正反向引物：lyi-rh-r3：tgatcagtattgacttacataaaaactcctaaattc，lyi-bamhi-r4：ttggatcctgactttgtctttaacactgc；基因组上待缺失lyi基因orf序列左、右同源臂两侧的引物：lyi-id1f：tggtggcgttgactcttctgtcac，lyi-id1r：aaattacgagcgatggcctcg；待缺失lyi基因orf序列内部鉴定引物：lyi-inner-id-f：aaccgccaataatcacttgccc，lyi-inner-id-r：agtgcaatttctgcacaagcaacc；2)以gx-pm基因组为模板，分别用lyi左同源臂正反向引物对(lyi-saci-l1/lyi-rh-l2)和右同源臂正反向引物对(lyi-rh-r3/lyi-bamhi-r4)进行pcr扩增，纯化回收得到左同源臂pcr产物和右同源臂pcr产物，将左同源臂pcr产物和右同源臂pcr产物进行融合pcr，得到融合产物lyi-lr，pcr结果如图10所示；pcr扩增体系及程序同实施例2。3)用saci和bamhi将融合产物lyi-lr和基础质粒载体pshk5ts-ngpiwi分别进行双酶切，并将酶切产物lyi-lr和线性化的载体片段pshk5ts-ngpiwi连接，然后将连接产物转化至大肠杆菌dh5α，涂布卡那抗性的lb琼脂平板，挑取单菌落溶于20μl的灭菌水中，取出3μl作为模板，采用引物pshk5ts-mcs-id-f/pshk5ts-mcs-id-r筛选鉴定，pcr鉴定结果如图11所示，筛选正确的转化子进行培养，并提取质粒。酶切、酶连及pcr的体系和程序同实施例2。4)采用酶切鉴定方法鉴定pshk5ts-ngpiwi-lyilr重组质粒；选用saci单酶切及bamhi+saci、bamhi+ncoi、mlui+saci双酶切方法进行鉴定，每管20μl体系中加质粒1μg，各酶10u，37℃酶切三小时后电泳观察结果，结果如图12所示，酶切正确，进行测序后，从而得到重组质粒pshk5ts-ngpiwi-lyilr。5)将禽多杀性巴氏杆菌gx-pm株制作电转感受态细胞，将重组质粒pshk5ts-ngpiwi-lyilr加入到gx-pm感受态细胞中进行电转，复苏3h后涂布含有卡那霉素的tsa平板上培养，于28℃培养得到单菌落；利用基因组上待缺失lyi基因orf序列左、右同源臂两侧的引物lyi-id1f/lyi-id1r引物进行pcr扩增鉴定，其中若条带大小是2135bp，则为wt株；若条带大小是1781bp，则为缺失突变株；若同时含有两条带，则为缺失菌株和野生菌株混合株；pcr鉴定结果如图13所示，2135bp大带和1781bp小带同时存在。pcr扩增体系及程序同实施例2。6)将扩增为两条带的菌进行传代，并划线培养进行纯化，再次利用lyi-id1f/lyi-id1r引物进行pcr扩增鉴定，筛选出只能扩增出1781bp大小的菌，并于42℃传代，利用质粒的温敏特性，诱导质粒丢失，将质粒丢失的菌提取其基因组做模板，分别使用基因组上待缺失lyi基因orf序列左、右游同源臂两端的引物lyi-id1f/r；待缺失lyi基因orf序列内部鉴定引物lyi-inner-id-f/r；ngpiwi的鉴定引物ngpiwi-l/ngpiwi-r同时进行pcr鉴定，结果如图14a所示lyi-id-f/r引物扩增出大小为1781bp的带，如图14b所示lyi-inner-id-f/r引物扩增无带，如图14c所示ngpiwi-l/r引物扩增无带，说明我们成功构建出lyi基因orf序列缺失菌株，命名为δlyi-gx-pm。溶菌酶抑制剂的orf序列如seqidno.2所示；pcr扩增体系及程序同实施例2。实施例4：禽多杀性巴氏杆菌pilia基因orf序列缺失菌株δpilia-gx-pm的获得，主要步骤与实施例2相同，不同之处包括以下步骤：1)以piliaorf序列及上下游各1000bp以内序列如seqidno.10所示为模板，设计敲除piliaorf序列引物，分别为：左同源臂正反向引物：pilia-saci-l1：aagagctcgcaaaactgagatgaataggc，pilia-rh-l2：caaaaggagttttatatgtaatgtttcatgagaatcc；右同源臂正反向引物：pilia-rh-r3：gattctcatgaaacattacatataaaactccttttgtc，pilia-bamhi-r4：ttggatcctctagataagtctgccagtc；基因组上待缺失pilia基因orf序列左、右同源臂两侧的引物：pilia-id1f：agtccttgaggctgacttaacgc，pilia-id1r：ctttgacaacgtgtagtcgtgctg；待缺失pilia基因orf序列内部鉴定引物：pilia-inner-id-f：tcctgctgggaaaacttcactacc，pilia-inner-id-r：aatgccagttcactcgttgtggc；2)以gx-pm基因组为模板，分别用pilia左同源臂正反向引物对(pilia-saci-l1/pilia-rh-l2)和右同源臂正反向引物对(pilia-rh-r3/pilia-bamhi-r4)进行pcr扩增，纯化回收得到左同源臂pcr产物和右同源臂pcr产物，将左同源臂pcr产物和右同源臂pcr产物进行融合pcr，得到融合产物pilia-lr，pcr结果如图15所示；pcr扩增体系及程序同实施例2。3)用saci和bamhi将融合产物pilia-lr和基础质粒载体pshk5ts-ngpiwi分别进行双酶切，并将酶切产物pilia-lr和线性化的载体片段pshk5ts-ngpiwi连接，然后将连接产物转化至大肠杆菌dh5α，涂布卡那抗性的lb琼脂平板，挑取单菌落溶于20μl的灭菌水中，取出3μl作为模板，采用引物pshk5ts-mcs-id-f/pshk5ts-mcs-id-r筛选鉴定，pcr鉴定结果如图16所示，筛选正确转化子进行培养，并提取质粒；pcr扩增体系及程序同实施例2。4)采用酶切鉴定方法鉴定pshk5ts-ngpiwi-pilialr重组质粒：选用ecorv单酶切及ecorv+ncoi、bamhi+saci双酶切方法进行鉴定，每管20μl体系中加质粒1μg，酶各10u，37℃酶切三小时后电泳观察结果，结果如图17所示，酶切鉴定正确，送去测序正确后，从而得到重组质粒pshk5ts-ngpiwi-pilialr。酶切、酶连及pcr的体系和程序同实施例2。5)将禽多杀性巴氏杆菌gx-pm株制作电转感受态细胞，将重组质粒pshk5ts-ngpiwi-pilialr加入到gx-pm感受态细胞中进行电转，复苏3h后涂布含有卡那霉素的tsa平板上培养，于28℃培养得到单菌落；利用基因组上待缺失pilia基因orf序列左、右同源臂两侧的引物pilia-id1f/pilia-id1r引物进行pcr扩增鉴定，若条带大小是2158bp，则为wt株；若条带大小是1729bp，则为缺失突变株；若同时含有两条带，则为缺失株和野生株的混合株；pcr鉴定结果如图18所示，能扩增同时得到2158bp大带和1729bp小带。pcr扩增体系及程序同实施例2。6)将扩增为两条带的菌进行传代，并划线培养进行纯化，再次利用pilia-id1f/pilia-id1r引物进行pcr扩增鉴定，筛选出只能扩增出1781bp大小的菌，并于42℃传代，利用质粒的温敏特性，诱导质粒丢失，将质粒丢失的菌提取其基因组做模板，分别使用基因组上待缺失pilia基因orf序列左、右同源臂两端的引物pilia-id1f/r；待缺失pilia基因orf序列内部鉴定引物pilia-inner-id-f/r；ngpiwi的鉴定引物ngpiwi-l/ngpiwi-r同时进行pcr鉴定，结果如图19a所示pilia-id-f/r引物扩增出大小为1729bp的带，如图19b所示pilia-inner-id-f/r引物扩增无带，如图19c所示ngpiwi-l/r引物扩增无带，说明我们成功构建出pilia基因orf序列缺失菌株，命名为δpilia-gx-pm。ⅳ型菌毛亚单位蛋白基因的orf序列如seqidno.3所示；pcr扩增体系及程序同实施例2。实施例5：禽多杀性巴氏杆菌opa基因orf缺失菌株δopa-gx-pm的获得，主要步骤与实施例2相同，不同之处包括以下步骤：1)以opaorf序列及上下游各1000bp以内序列如seqidno.11所示为模板，设计敲除opaorf序列引物，分别为：左同源臂正反向引物：opa-saci-l1：aagagctccaggacttaaataaccgttactcgg，opa-rh-l2：taggcaatctgcttacattgtcatgtcctctttag；右同源臂正反向引物：opa-rh-r3：agaggacatgacaatgtaagcagattgcctaattaaac，opa-bamhi-r4：aaggatccaatatccgccacagaatactcac；基因组上待缺失opa基因orf序列左、右同源臂两侧的引物：opa-id1f：tttcgtatgcgattggggttg，opa-id1r：tgtcaatatccgccacagaatactc；待缺失opa基因orf序列内部鉴定引物：opa-inner-id-f：agcgttaggcacattatgtgcag，opa-inner-id-r：atattcgatacccgcgttcagag；2)以gx-pm基因组为模板，分别用opa左同源臂正反向引物对(opa-saci-l1/opa-rh-l2)和右同源臂正反向引物对(opa-rh-r3/opa-bamhi-r4)进行pcr扩增，纯化回收得到左同源臂pcr产物和右同源臂pcr产物，将左同源臂pcr产物和右同源臂pcr产物进行融合pcr，得到融合产物opa-lr，pcr结果如图20所示；pcr扩增体系及程序同实施例2。3)用saci和bamhi将融合产物opa-lr和基础质粒载体pshk5ts-ngpiwi分别进行双酶切，并将酶切产物opa-lr和线性化的载体片段pshk5ts-ngpiwi连接，然后将连接产物转化至大肠杆菌dh5α，涂布卡那抗性的lb琼脂平板，挑取单菌落溶于20μl的灭菌水中，取出3μl作为模板，采用引物pshk5ts-mcs-id-f/pshk5ts-mcs-id-r筛选鉴定，pcr鉴定结果如图21所示，筛选正确的转化子进行培养，并提取质粒。pcr扩增体系及程序同实施例2。4)采用酶切鉴定方法鉴定pshk5ts-ngpiwi-opalr重组质粒；选用ecorv单酶切及ecorv+ncoi、bamhi+saci双酶切方法进行鉴定，每管20μl体系中加质粒1μg，酶各10u，37℃酶切三小时后电泳观察结果，如图22所示，酶切鉴定正确，送测序正确后，从而得到重组质粒pshk5ts-ngpiwi-opalr。酶切、酶连及pcr的体系和程序同实施例2。5)将禽多杀性巴氏杆菌gx-pm株制作电转感受态细胞，将重组质粒pshk5ts-ngpiwi-opalr加入到gx-pm感受态细胞中进行电转，复苏3h后涂布含有卡那霉素的tsa平板上培养，于28℃培养得到单菌落；利用基因组上待缺失opa基因orf序列左、右游同源臂两侧的引物opa-id1f/opa-id1r引物进行pcr扩增鉴定，若条带大小是2157bp，则为wt株；若条带大小是1569bp，则为缺失突变株；若同时含有两条带，则为缺失株和野生株的混合株；pcr鉴定结果如图23所示，能扩增同时得到2157bp大带和1569bp小带。pcr扩增体系及程序同实施例2。6)将扩增为两条带的菌进行传代，并划线培养进行纯化，再次利用opa-id1f/opa-id1r引物进行pcr扩增鉴定，筛选出只能扩增出1781bp大小的菌，并于42℃传代，利用质粒的温敏特性，诱导质粒丢失，将质粒丢失的菌提取其基因组做模板，分别使用基因组上待缺失opa基因orf序列左、右同源臂两端的引物opa-id1f/r；待缺失opa基因orf序列内部鉴定引物opa-inner-id-f/r；ngpiwi的鉴定引物ngpiwi-l/ngpiwi-r同时进行pcr鉴定，结果如图24a所示opa-id-f/r引物扩增出大小为1569bp的带，如图24b所示opa-inner-id-f/r引物扩增无带，如图24c所示ngpiwi-l/r引物扩增无带，说明我们成功构建出opa基因orf序列缺失菌株，命名为δopa-gx-pm；浑浊相关蛋白基因的orf序列如seqidno.4所示。pcr扩增体系及程序同实施例2。实施例6禽多杀性巴氏杆菌hyae基因敲除菌株δhyae-gx-pm与野生菌株gx-pm进行生长特性及致病力方面的实验，具体方案如下：1)参照瑞氏染色试剂盒说明书，对该hyae基因缺失突变株及wt株进行瑞氏染色，油镜下观察，发现缺失突变株和wt株均呈典型的两极浓染，结果如图25所示，说明靶基因缺失突变株的生长形态特性没有明显变化。2)将缺失突变株与wt株分别划线接种于tsa平皿(含10％新生牛血清)，于37℃恒温培养箱培养12-16h，待菌落长出后，挑取单菌落到tsb(含10％新生牛血清)液体培养基，37℃160r/min摇床震荡培养过夜。第二天将摇好的新鲜菌液按1:1000接种于10mltsb(含10％新生牛血清)液体培养基中，37℃160r/min摇床震荡培养。每隔1h吸取200μl菌液进行od600的测定并记录，在第3h-第11h期间每隔半小时测定一次，共测定至15小时，待菌生长至稳定期后终止。结果如图26表明，在营养充分的条件下，靶基因缺失突变株与亲本株生长特性差异不明显。3)采取胸部肌肉注射的方法对鸡只进行细菌的接种，接种剂量为200μl/只。分组及攻毒剂量情况见表1，胸部肌肉接种后，给予充足的饲料和饮水，每隔12h观察并记录鸡只的精神状态，采食和饮水及死亡个数等情况。结果如图27表明，wt株对鸡的致病性非常强，102cfu菌量即可导致鸡在2-3天内全部死亡，δhyae-gx-pm菌株对鸡的致病力有明显的降低，102cfu感染菌量组鸡只全部存活，与wt组相比较差异显著，且感染菌量增加1000倍后，60％的感染鸡仍可存活。进一步说明该基因敲除后菌株的致病力显著降低，说明该菌株具有开发为弱毒疫苗的潜力。表1分组每组鸡只数攻毒剂量/cfugx-pm(102)5102gx-pm(103)5103δhyae(102)5102δhyae(103)5103δhyae(104)5104δhyae(105)51054)按照家禽解剖技术方法对感染死亡的鸡只进行剖检，观察其病理变化，结果如图28所示，gx-pm菌株感染鸡只的病理变化主要是心包变厚及变大，心包内积有大量淡黄色透明液体；肝呈棕色或黄棕色，肿大且质脆，整个肝表面散布有许多针尖大小的灰白色坏死点；十二指肠病变很明显，可见充血、出血，肠内容物含有坏死物，呈卡他性和出血性肠炎。而δhyae-gx-pm感染鸡只病理变化不明显，心脏及肝脏均未见到典型的病理变化，说明该基因敲除后的菌株致病力显著降低，具有开发为弱毒疫苗的潜力，也可以开发成二联疫苗或多联疫苗的疫苗载体。实施例7δhyae-gx-pm减毒菌株制备弱毒活疫苗，将该菌株培养稀释至2*102cfu/ml，与弗氏完全佐剂按体积比1:1进行乳化，制备油乳剂弱毒活疫苗，用该疫苗胸部肌肉注射接种1月龄鸡，首次免疫后每周次采血检测抗体水平，二免后第2周检测抗体水平，若抗体水平较高，则采用102cfu/只接种剂量进行禽多杀性巴氏杆菌gx-pm的攻毒试验，同时攻毒pbs或弗氏完全佐剂免疫鸡作为对照组，记录攻毒后各组的鸡死亡情况。其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。序列表<110>华中农业大学<120>基于ngpiwi蛋白介导的禽禽多杀性巴氏杆菌基因敲除菌株及其构建方法和应用<160>11<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1869<212>dna<213>禽多杀性巴氏杆菌(pasteurellamultocida)<400>1atgaaaaaggttattatcattggacataaacagtctaactatcaagatgttgaaaaggtt60tttcaatgttatgggatgaatcccccgcttccatcaaaacgtgaaaaaatgtcccccatc120gaaattggccatgtacttaataaagtattaccaagtcttgagcacacacctaaaaatgta180tctttactttctaataagaaaagcaaaataaaaaaagggaattc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