本发明属于医药化工领域，具体涉及一种枸橼酸咖啡因的制备方法。
背景技术
枸橼酸咖啡因注射液目前临床主要用于治疗早产新生儿原发性呼吸暂停，其主要原料枸橼酸咖啡因一般是以咖啡因和枸橼酸在水溶液中混合反应而成，而其中主要活性成分之一的咖啡因在现有的制备工艺中主要是通过化学合成或者天然植物中提取分离纯化而来。化学合成法往往涉及到复杂的反应步骤以及有机溶剂甚至是毒性较大的溶剂的使用，在实际生产中运用较少，而分离纯化手段在现有研究资料中以升华法、超临界萃取法以及萃取法为主，但多数还运用到了二氯甲烷或者三氯甲烷等毒性较大的溶剂，对于设备条件和安全防护等提出了很严格的要求，且工艺复杂，不适合工业生产。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种枸橼酸咖啡因的制备方法，以解决现有技术存在的工艺复杂，试剂毒性大，对设备要求高的问题。
本发明所要解决的技术问题采用以下技术方案来实现。
一种枸橼酸咖啡因的制备方法，具体步骤如下：
s1)咖啡因的提取：称取绿茶叶，加入醇溶液多次提取，合并提取液，得到提取液a，将所述提取液a减压浓缩至无醇味后冷却至室温，即得咖啡因提取浓缩液b；
s2)脱色素与脱茶多酚：向步骤s1)所述咖啡因提取浓缩液b中逐渐加入金属离子溶液调节ph1.0～4.0，然后加入碱液继续调节ph4.5～7.0，静置沉淀，过滤，保留滤液，向所述滤液中加入枸橼酸溶液调节ph3.0～6.0，即得枸橼酸咖啡因溶液c；
s3)大孔树脂柱层析a：将步骤s2)所述枸橼酸咖啡因溶液c作为第一次柱层析上样液逐渐加入已经装有大孔吸附树脂的层析柱内，上样结束后先后使用水和醇溶液洗脱，并收集醇溶液洗脱树脂柱流出液d；
s4)大孔树脂柱层析b：将步骤s3)所述醇溶液洗脱树脂柱流出液d作为第二次柱层析上样液逐渐加入已经装有大孔吸附树脂的层析柱内，上样结束后分别以不同浓度的醇溶液洗脱两次，收集醇溶液洗脱树脂柱流出液e；
s5)萃取与浓缩：将步骤s4)所述醇溶液洗脱树脂柱流出液e减压浓缩至无醇味，加入枸橼酸，然后加入乙酸乙酯溶液萃取，静置分层充分后收集乙酸乙酯溶液部分得到枸橼酸咖啡因乙酸乙酯溶液f；
s6)浓缩、结晶与干燥：将步骤s5)所述枸橼酸咖啡因乙酸乙酯溶液f减压浓缩至呈膏状，加入醇溶液溶解完全后过滤，保留滤液，静置析晶，过滤，保留固体，固体干燥即得到枸橼酸咖啡因结晶体。
进一步的，步骤s2)所述的金属离子调节ph2.0～3.0；所述碱液调节ph4.5～5.5；所述枸橼酸调节ph值范围在4.0～5.5之间。
进一步的，步骤s1)中所述每次提取醇溶液体积体积用量以绿茶叶质量计为5～30ml/g，提取温为40～90℃，提取时间为15～90min，提取次数为1～3次；
步骤s2)中所述金属离子溶液为含铝或者含铁溶液；所述的碱液为氢氧化钠、氢氧化钾或氨水的溶液。
步骤s3)中所述水洗脱体积为0.5～2倍柱体积；所述醇溶液洗脱体积为2～12倍柱体积；洗脱时流速为每小时1～4倍柱体积；
步骤s4)中所述醇溶液洗脱时流速为每小时1～4倍柱体积；第一次洗脱时洗脱体积为0.5～2倍柱体积；第二次洗脱时洗脱体积为2～12倍柱体积。
步骤s5)中所述枸橼酸加入量为浓缩后溶液总体积的0.1～5％(v/w)；所述乙酸乙酯溶液加入量为浓缩后溶液总体积的0.2～4倍(v/v)；所述萃取次数为1～4次；
步骤s6)中所述醇溶液加入量为浓缩后膏状物总重量的1～10倍(w/v)。
进一步的，步骤s1)中所述每次提取醇溶液体积体积用量以绿茶叶质量计为15～20ml/g，提取温度为70～80℃，提取时间为30～60min，提取次数为2～3次；
步骤s5)进一步的，所述乙酸乙酯溶液加入量为浓缩后溶液总体积的0.5～1倍之间(v/v)；所述的萃取次数可以为2～3次；
步骤s6)进一步的，所述醇溶液加入量为浓缩后膏状物总重量的2～5倍(w/v)。
进一步的，步骤s1)中所述醇溶液为甲醇与水或者乙醇与水以任意比例混合的混合溶液；
步骤s2)所述含铝溶液为三氯化铝或其含水合物溶液，所述含铁溶液为三氯化铁或其含水合物溶液。
步骤s3)中所述醇溶液为甲醇或者乙醇与水的混合溶液，混合后醇所占体积比为0～40％(v:v)；
步骤s4)中所述的醇溶液为甲醇或者乙醇与水的混合溶液，第一次醇所占体积比例为0～40％(v:v)，第二次醇所占体积比为50～100％(v:v)；
步骤s6)所述的醇溶液可以为甲醇或者乙醇与水的混合溶液，混合后醇所占体积比例为50～100％(v:v)。
进一步的，步骤s3)中所述的醇溶液为乙醇与水的混合溶液，混合后醇所占体积比例(v:v)为10～25％，洗脱体积为4～8倍柱体积；
步骤s4)第一步洗脱所述的醇溶液为乙醇与水的混合溶液，混合后醇所占体积比例为20～40％(v:v)，洗脱体积可以为约1～2倍柱体积；第二步洗脱所述的醇溶液为乙醇与水的混合溶液，混合后醇所占体积比例为75～100％(v:v)，洗脱体积可以为约6～10倍柱体积。
进一步的，步骤s3)与步骤s4中所述大孔吸附树脂上样时流速为每小时0.5～3倍柱体积。
进一步的，步骤s3)与步骤s4)中所述大孔吸附树脂型号为lx-1、lx-11、lx-17、lx-60、或lx-68。
进一步的，所述的大孔吸附树脂型号为lx-1、lx-17或lx-68。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
本发明率先以绿茶叶为原料，在分离纯化过程中同步完成咖啡因与枸橼酸的结合，经过离子沉淀技、大孔树脂柱、萃取以及结晶技术，分离制备出枸橼酸咖啡因；本发明中未使用毒性较大的溶剂，制备方法环保，简单、高效，重复性好，稳定性高，更适合于工业化生产。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步的详细说明。
实施例1：枸橼酸咖啡因的制备过程
s1)咖啡因的提取：称取绿茶叶10kg，加入150l的60％乙醇溶液在80℃提取45分钟，同法连续提取2次得到提取液a；将提取液a减压浓缩至无醇味后冷却至室温，即得咖啡因提取浓缩液b。s2)脱色素与茶多酚：向步骤s1)咖啡因提取浓缩液b中搅拌状态下逐渐向其中加入六水合三氯化铝溶液调节ph值至2.5，搅拌后逐渐加入稀氨水调节ph至4.8，静置使沉淀完全后过滤得到滤液，滤液加入枸橼酸溶液调节ph至4.5，即得枸橼酸咖啡因溶液c。s3)大孔树脂柱层析a：将枸橼酸咖啡因溶液c作为第一次柱层析上样液逐渐加入已经装有型号为lx-68大孔吸附树脂层析柱内，控制上样液流速为每小时1.5～2倍柱体积；上样结束后调节并控制流速在每小时3～4倍柱体积，先以水洗脱约2倍柱体积，最后以30％乙醇溶液洗脱约8倍柱体积，收集30％乙醇溶液洗脱树脂柱流出液d。s4)大孔树脂柱层析b：将30％乙醇溶液洗脱树脂柱流出液d作为第二步柱层析上样液逐渐加入已经装有型号为lx-17大孔吸附树脂层析柱内，控制上样液流速为每小时1.5～2倍柱体积；上样结束后调节并控制流速在每小时约3～4倍柱体积，先以30％乙醇溶液洗脱约1倍柱体积，最后以100％乙醇溶液洗脱约8倍柱体积，收集100％乙醇溶液洗脱树脂柱流出液e。s5)萃取与浓缩：将100％乙醇溶液洗脱树脂柱流出液e减压浓缩至无醇味，加入浓缩后体积1％枸橼酸后逐渐向其中加入约0.5倍体积乙酸乙酯萃取2次，静置分层充分后收集乙酸乙酯部分得到枸橼酸咖啡因乙酸乙酯溶液f。s6)浓缩与结晶：将枸橼酸咖啡因乙酸乙酯溶液f减压浓缩至呈膏状，加入称重量4倍体积的85％乙醇溶液溶解完全后过滤得到滤液，转移到冷藏室(4～10℃)静置析晶24小时，过滤并干燥即得到白色枸橼酸咖啡因结晶体1.86kg。
实施例2：枸橼酸咖啡因的制备过程
s1)咖啡因的提取：称取绿茶叶10kg，加入50l的40％甲醇溶液在40℃提取15分钟，同法连续提取3次得到提取液a；将提取液a减压浓缩至无醇味后冷却至室温，即得咖啡因提取浓缩液b。s2)脱色素与茶多酚：取咖啡因提取浓缩液b，搅拌状态下逐渐向其中加入六水合三氯化铝溶液调节ph值至1.0，搅拌后逐渐加入稀氢氧化钠溶液调节ph至4.5，静置使沉淀完全后过滤得到滤液，滤液加入枸橼酸溶液调节ph至3.0，即得枸橼酸咖啡因溶液c。s3)大孔树脂柱层析a：将枸橼酸咖啡因溶液c作为第一步柱层析上样液逐渐加入已经装有型号为lx-60大孔吸附树脂层析柱内，控制上样液流速为每小时1.5～2倍柱体积；上样结束后调节并控制流速在每小时约2～3倍柱体积，先以水洗脱约1倍柱体积，最后以40％甲醇溶液洗脱约12倍柱体积，收集30％甲醇溶液洗脱树脂柱流出液d。s4)大孔树脂柱层析b：将40％甲醇溶液洗脱树脂柱流出液d作为第二步柱层析上样液逐渐加入已经装有型号为lx-1大孔吸附树脂层析柱内，控制上样液流速为每小时1.5～2倍柱体积；上样结束后调节并控制流速在每小时约2～3倍柱体积，先以30％乙醇溶液洗脱约2倍柱体积，最后以100％乙醇溶液洗脱约8倍柱体积，收集100％乙醇溶液洗脱树脂柱流出液e。s5)萃取与浓缩：将100％乙醇溶液洗脱树脂柱流出液e减压浓缩至无醇味，加入浓缩后体积0.1％枸橼酸后逐渐向其中加入约0.2倍体积乙酸乙酯萃取4次，静置分层充分后收集乙酸乙酯部分得到枸橼酸咖啡因乙酸乙酯溶液f。s6)浓缩与结晶：将枸橼酸咖啡因乙酸乙酯溶液f减压浓缩至呈膏状，加入称重量1倍体积的50％乙醇溶液溶解完全后过滤得到滤液，转移到冷藏室(4～10℃)静置析晶24小时，过滤并干燥即得到白色枸橼酸咖啡因结晶体1.62kg。
实施例3：枸橼酸咖啡因的制备过程
s1)咖啡因的提取：称取绿茶叶10kg，加入300l的40％甲醇溶液在90℃提取15分钟得到提取液a；将提取液a减压浓缩至无醇味后冷却至室温，即得咖啡因提取浓缩液b。s2)脱色素与茶多酚：取咖啡因提取浓缩液b，搅拌状态下逐渐向其中加入六水合三氯化铝溶液调节ph值至2.5，搅拌后逐渐加入稀氢氧化钠溶液调节ph至5.3，静置使沉淀完全后过滤得到滤液，滤液加入枸橼酸溶液调节ph至4.3，即得枸橼酸咖啡因溶液c。s3)大孔树脂柱层析a：将枸橼酸咖啡因溶液c作为第一步柱层析上样液逐渐加入已经装有型号为lx-60大孔吸附树脂层析柱内，控制上样液流速为每小时1.5～2倍柱体积；上样结束后调节并控制流速在每小时约2～3倍柱体积，先以水洗脱约1倍柱体积，最后以25％乙醇溶液洗脱约8倍柱体积，收集25％乙醇溶液洗脱树脂柱流出液d。s4)大孔树脂柱层析b：将25％乙醇溶液洗脱树脂柱流出液d作为第二步柱层析上样液逐渐加入已经装有型号为lx-17大孔吸附树脂层析柱内，控制上样液流速为每小时1.5～2倍柱体积；上样结束后调节并控制流速在每小时约3～4倍柱体积，先以40％乙醇溶液洗脱约2倍柱体积，最后以80％乙醇溶液洗脱约10倍柱体积，收集80％乙醇溶液洗脱树脂柱流出液e。s5)萃取与浓缩：将80％乙醇溶液洗脱树脂柱流出液e减压浓缩至无醇味，加入浓缩后体积5％枸橼酸后逐渐向其中加入约1倍体积乙酸乙酯萃取2次，静置分层充分后收集乙酸乙酯部分得到枸橼酸咖啡因乙酸乙酯溶液f。s6)浓缩与结晶：将枸橼酸咖啡因乙酸乙酯溶液f减压浓缩至呈膏状，加入称重量2倍体积的80％乙醇溶液溶解完全后过滤得到滤液，转移到冷藏室(4～10℃)静置析晶24小时，过滤并干燥即得到白色枸橼酸咖啡因结晶体2.03kg。
实施例4：枸橼酸咖啡因的制备过程
s1)咖啡因的提取：称取绿茶叶10kg，加入300l的40％甲醇溶液在90℃提取90分钟得到提取液a；将提取液a减压浓缩至无醇味后冷却至室温，即得咖啡因提取浓缩液b。s2)脱色素与茶多酚：取咖啡因提取浓缩液b，搅拌状态下逐渐向其中加入三氯化铁溶液调节ph值至4.0，搅拌后逐渐加入稀氢氧化钠溶液调节ph至7.0，静置使沉淀完全后过滤得到滤液，滤液加入枸橼酸溶液调节ph至6.0，即得枸橼酸咖啡因溶液c。s3)大孔树脂柱层析a：将枸橼酸咖啡因溶液c作为第一步柱层析上样液逐渐加入已经装有型号为lx-60大孔吸附树脂层析柱内，控制上样液流速为每小时0.5～2倍柱体积；上样结束后调节并控制流速在每小时约1～3倍柱体积，先以水洗脱约0.5倍柱体积，最后以5％乙醇溶液洗脱约2倍柱体积，收集25％乙醇溶液洗脱树脂柱流出液d。s4)大孔树脂柱层析b：将5％乙醇溶液洗脱树脂柱流出液d作为第二步柱层析上样液逐渐加入已经装有型号为lx-17大孔吸附树脂层析柱内，控制上样液流速为每小时1.5～2倍柱体积；上样结束后调节并控制流速在每小时约3～4倍柱体积，先以5％乙醇溶液洗脱约2倍柱体积，最后以50％乙醇溶液洗脱约10倍柱体积，收集80％乙醇溶液洗脱树脂柱流出液e。s5)萃取与浓缩：将80％乙醇溶液洗脱树脂柱流出液e减压浓缩至无醇味，加入浓缩后体积5％枸橼酸后逐渐向其中加入约4倍体积乙酸乙酯萃取1次，静置分层充分后收集乙酸乙酯部分得到枸橼酸咖啡因乙酸乙酯溶液f。s6)浓缩与结晶：将枸橼酸咖啡因乙酸乙酯溶液f减压浓缩至呈膏状，加入称重量10倍体积的100％乙醇溶液溶解完全后过滤得到滤液，转移到冷藏室(4～10℃)静置析晶24小时，过滤并干燥即得到白色枸橼酸咖啡因结晶体2.03kg。
本发明按照上述实施例进行了说明应当理解，上述实施例不以任何形式限定本发明，凡采用等同替换或等效变换方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。