一种红系特异高表达GFP的小鼠多能干细胞系及其构建方法与流程

本发明属于诱导干细胞技术领域，具体涉及一种红系特异高表达gfp的小鼠多能干细胞系及其构建方法。

背景技术：

第一株小鼠转基因胚胎干细胞(escs)在1981年获得。escs具有自我更新，多向分化潜能，用四倍体补偿技术己证实escs可分化成所有组织细胞，在体外分化方面，研究者己成功地将escs诱导形成胰腺细胞，神经细胞，心肌细胞、造血干细胞等组织细胞。escs的这些特征，推进了功能性基因的研究步伐。携有特定外源基因的escs，可在体内外水平对基因的基本功能和调控机制进行研究，并且可以开发分子生物农场，探索遗传性疾病的发病机制等。转基因escs可通过直接转染外源性基因获得，但用这种方法制备前，需要验证所用的escs是否是真正的escs，是否具有生殖系传递功能，并且外源基因是否会发生基因表达沉默现象。己有研究发现，用小鼠逆转录病毒载体转染干细胞的效率较低，且外源基因会快速沉默，这种转基因沉默现象阻碍了干细胞转基因研究的进一步发展。而且对于特定组织细胞表达基因的转基因escs，需要将其在体内分化到特定组织细胞，才能知道此基因是否特异性的功能性表达在特定组织细胞中。

携有特定外源基因的escs也可通过转基因小鼠的囊胚内细胞团细胞孵化扩增获得。通常转基因小鼠可由受精卵雄原核注射，第一例转基因小鼠即通过对小鼠受精卵原核注射获得，还可由生殖系转基因es通过制备生殖系传递嵌合体小鼠获得。但通常所用的转基因技术并不能完全实现定向整合，整合基因的拷贝数不能有效控制，这导致了转基因小鼠间、转基因小鼠子代间外源基因表达的差异性。

常规转基因胚胎干细胞是将外源性基因直接导入escs中，这种方法往往产生外源基因的随机插入、各细胞克隆的转基因拷贝数不一致，插入基因会产生表达沉默等现象。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种红系特异高表达gfp的小鼠多能干细胞系及其构建方法。

一种红系特异高表达gfp的小鼠多能干细胞系，所述小鼠多能干细胞系通过显微注射的方式，将红系高表达gfp载体注入昆明白小鼠受精卵的雄原核中，培育转基因鼠，经验证插入性基因在特定组织细胞表达后，对转基因小鼠进行繁殖，待其子代小鼠的外源性基因的拷贝数稳定后，用其囊胚制备而成。

一种红系特异高表达gfp的嵌合体小鼠的制备方法，包括如下步骤：

(1)将红系高表达gfp载体，通过显微注射的方式，将其注入昆明白小鼠受精卵的雄原核中，将该受精卵植入0.5天假孕母鼠的输卵管中，直到红系高表达gfp转基因小鼠出生；

(2)红系高表达gfp转基因昆明白小鼠与c57小鼠交配，获得黑色毛色hg转基因雄性小鼠，其与c57母鼠交配后，获取3.5天囊胚，将其接种在丝裂酶素处理过的小鼠胚胎成纤维细胞上制备红系高表达gfp转基因胚胎干细胞；

(3)运用囊胚注射技术将红系高表达gfp转基因胚胎干细胞注入3.5天icr小鼠的囊胚中，将其植入2.5天假孕母鼠子宫，直到红系高表达gfp转基因胚胎干细胞嵌合体小鼠出生。

所述红系高表达gfp转基因胚胎干细胞嵌合体小鼠与icr母鼠交配，确认是否具有生殖系传递的能力。

本发明的有益效果：本发明的红系特异高表达gfp的转基因hg小鼠，用其囊胚制备hgescs，并通过显微注射方法将此干细胞注入icr囊胚后，移植入假孕母鼠子宫，约18天后获得hgescs生殖系传递的嵌合体小鼠。通过对嵌合体和其子代的解剖学和细胞学证实，gfp特异高表达在生血组织，如e9.5胚胎的agm区和血液细胞中。本发明整合了转基因小鼠制备和胚胎干细胞制备，可有效地建立组织特异性基因高表达的es细胞系。运用遗传背景高度相似的转基因小鼠和这种遗传背景的hgescs，对于研究血细胞在体内外的形成衍变具有重要细胞学价值，这有助于揭开造血干的形成，造血微环境的复杂影响作用，同时有且于推动多能性干细胞体外向可移植造血干分化的研究进程。

附图说明

图1为hgescs和体外多能性验证；图中，a-hg转基因小鼠囊胚icm扩增培养，b-hges细胞克隆，c-多能性基因mrna水平表达，1和2为hges细胞系，3是小鼠r1es细胞系，d-hgescs碱性磷酸酶染色。

图2为hges嵌合体小鼠和其子代生殖系嵌合小鼠。

图3为hges嵌合体子代小鼠mef与血液涂片荧光镜检，图中，a的左图是9.5天hg转基因小鼠胚胎，右图是hges细胞小鼠mef细胞；图b为dnagfppcr鉴定；1是icr小鼠mef，2是hges细胞小鼠mef细胞，3是hg转基因小鼠尾尖皮肤；图c为血液涂片荧光镜检；chimera：hges细胞嵌合体小鼠；offspring:生殖系传递的hges细胞小鼠。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

红系特异高表达gfp的嵌合体小鼠的制备方法，按照如下步骤进行：

(1)hg昆明白转基因小鼠其操作步骤参照richa的技术方法。

(2)hges细胞制备：

参照bryja等人的escs制备技术。因杂交系escs更能生出生殖系嵌合体小鼠。因此用hg昆明白转基因小鼠与c57小鼠交配，获得的子代hg雄鼠与c57母鼠交配，用其3.5天囊胚，接种在丝裂酶素处理过的mef细胞上。hges细胞原代fbs培养基：20％fbsfores+1％neaa+1％penstrep+1％l-glutamine+0.1％2-mercaptoethanol+2000iu/mllif+dmem；hges细胞原代sr培养基：20％sr+1％neaa+1％penstrep+1％l-glutamine+0.1％2-mercaptoethanol+2000iu/mllif+dmem；hges细胞扩增培养基：将hges细胞原代sr培养基中lif浓度调整为1000iu/ml。

(3)hgipscs细胞制备，参照yamanaka四因子重编程方法制备技术。

(4)rt-pcr多能性基因验证：

抽取hgescs和hgipscs的rna，逆转录为cdna后，选择oct3/4、nanog、sox2、r-gapdh正反引物进行pcr反应；抽取hgescs生殖系小鼠的mef的dna，选择gfp、d-gapdh正反引物进行pcr反应。引物序列见表1。

表1.pcr引物序列与产物长度

(5)多能性验证：apl(碱性磷酸酶染色，碧云天p0321)试剂盒试剂对escs进行染色。

(6)拟胚体形成实验。消化hgescs后进行悬浮培养。eb培养基：15％fbsfores+1％neaa+1％penstrep+1％l-glutamine+0.1％2-mercaptoethanol+dmem。

(7)hgescs嵌合体制备参照《小鼠胚胎操作手册》，主要是通过显微注射将hgescs注射入3.5天的icr囊胚后，将其移植入假孕2.5天的icr母鼠子宫中。嵌合体小鼠出生后，待其8周龄后，选择雄性嵌合体小鼠与icr母鼠交配，观察hgescs是否具有生殖系传递的能力。

(8)选取嵌合体的黑色毛色子代雄性小鼠，与icr母鼠交配，获取13.5天胚胎，制备成mef，抽取其dna进行gfp鉴定，阳性mef再用荧光显微镜镜检观察是否有gfp表达。

(9)hges嵌合体血液学鉴定，取嵌合体小鼠和嵌合体子代小鼠的尾尖外周血，制备血液涂片，进行荧光镜检。

hgescs的制备及其多能性的初步验证结果：

囊胚在20％ko-sr的条件下培养，待其培养10-12后，其滋胚层扩增较少，icr扩展较大(图1的a)，0.25％的胰酶消化成细胞团块，接种在丝裂酶素处理过的mef滋养层上，形成如图1的b的典型es细胞克隆，之后每3-4天传代扩增。干细胞多能性基因sox2、oct3/4、nanog在这些细胞中稳定表达(图1的c)。碱性磷酸酶染色显示hgescs染色特异，mef滋养层细胞不着色(图1的d)。

嵌合体的制备及hgescs生殖系嵌合的验证：

escs是否具有多能性的金标准是其是否其具有生殖系嵌合能力。发明人选择其中一株hgescs细胞系进行icr囊胚注射，获得了花色毛色的嵌合体小鼠。成年雄性嵌合体小鼠与icr母鼠交配，获得毛色为纯黑的hgescs生殖系嵌合体小鼠(图2)。

嵌合体子代mef的基因型鉴定和血液涂片的荧光镜检结果：

hg转基因小鼠e9.5胚胎通过荧光镜检可以观察到，gfp主要集中在造血生成区域agm区(图3的a左)，而嵌合体子代小鼠的mef，尽管dna鉴定是阳性(图3的b)，但镜检并未发现有gfp荧光表达(图3的a右)。嵌合体的血涂片中，其gfp表达的血细胞由hgescs分化而来，嵌合体子代的血涂片中可见更多的gfp表达的红细胞(图3的c)。