GmCry2c在调控植物株高方面的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及gmcry2c在调控植物株高方面的应用。

背景技术：

大豆是世界上重要的粮食、油料和饲料作物之一，与国民经济密切相关。我国大豆资源丰富，有许多高产、高油、高蛋白、抗病和抗逆性强的优质品种。但是，由于大豆对光非常敏感，在间作或密植条件下，植株会出现徒长，易倒伏等现象。这些不利性状严重制约了我国大豆的机械化大规模生产，给农业生产带来巨大损失。如何克服大豆间作或密植过程中徒长或倒伏的现象，提高耕地利用率，最终实现大豆的增产是生产实践中一个极具潜力的研究方向，具有重要的理论和生产价值。

研究表明，在模式植物拟南芥中，隐花色素(cryptochrome)对植物的光周期以及光强度反应均非常重要。发明人试图通过过量表达大豆隐花色素基因(gmcry2c)，增加大豆对外界环境中光强度的反应，实现扩大大豆的播种面积、改良农艺性状、提高土地利用率、进行品种轮换等，最终达到提高大豆产量的目的。

隐花色素是一种普遍存在于动物、植物、微生物中的蓝光受体，它能接受蓝光信号、诱导下游基因进行信号转导，从而引起相关的生理反应。植物中隐花色素的主要作用是参与植物的光形态建成和光周期介导的开花反应。对植物中隐花色素功能的解析主要来自对模式植物拟南芥的研究。拟南芥中有三种隐花色素：atcry1、atcry2和atcry3，其中atcry1和atcry2具有光解酶活性参与光信号反应，其主要有以下特点和功能：①都属于核蛋白；②蓝光下都能抑制下胚轴伸长、促进子叶张开；cry通过转录和翻译后机制来调控基因表达，而cry调控的基因表达同时还受到如光敏色素等其他信号通路调控，表明隐花色素调控的光形态建成是一个复杂的基因表达调控网络。近十多年来，拟南芥中已发现一些与cry相互作用的蛋白质，对这些基因的研究有助于进一步认识隐花色素的光信号转导机制。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供gmcry2c在调控植物株高方面的应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：通过利用gateway系统中的pearly101-yfp及yfp-pearly104载体，将yfp基因分别与gmcry2c基因的3’端和5’端连接。利用子叶节法转化大豆栽培品种，获得gmcry2c-yfp以及yfp-gmcry2c蛋白过量表达的稳定转化植株，结果发现转化植株的高度明显变矮。所述gmcry2c的氨基酸序列为：(1)具有如seqidno.2所示的氨基酸序列；(2)具有如seqidno.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的编码具有相同功能的氨基酸序列。

由此可以合理推断，在大豆中敲除所述gmcry2c的编码基因，或使所述gmcry2c的编码基因发生沉默，或使所述gmcry2c的编码基因发生低表达，可增加大豆的株高。

同时可以预测，当将所述编码基因导入目的植物中，或在植物中过表达所述编码基因，也可实现调控植株株高的目的，且预测将降低植株株高。

进一步地，本发明所述植物为单子叶植物或双子叶植物，优选为豆科植物。

本发明提供了gmcry2c在制备转基因植物新品种中的应用。

本发明提供了gmcry2c在培育矮植株植物中的应用。

本发明提供了gmcry2c在植物种质资源改良中的应用。

上述的应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。进一步优选为大豆或拟南芥。

上述应用中，所述gmcry2c的氨基酸序列为：

(1)具有如seqidno.2所示的氨基酸序列；

(2)具有如seqidno.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的编码具有相同功能的氨基酸序列。

gmcry2c的核苷酸序列为：

(1)具有如seqidno.1所示的核苷酸序列；

(2)具有如seqidno.1所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的编码具有相同功能多肽的核苷酸序列；

(3)在严格条件下，能够与seqidno.1所示的核苷酸序列杂交的编码具有相同功能蛋白的核苷酸序列。

本发明的有益效果在于：本发明利用gateway系统中的pearly101-yfp及yfp-pearly104(已公开于文献earley,k.w.,j.r.haag,o.pontes,k.opper,t.juehne,k.songandc.s.pikaard(2006)."gateway-compatiblevectorsforplantfunctionalgenomicsandproteomics."plantj45(4):616-629.)载体，将yfp基因分别与gmcry2c基因的3’端和5’端连接。利用子叶节法转化大豆栽培品种，获得gmcry2c-yfp以及yfp-gmcry2c蛋白过量表达的稳定转化植株，结果发现转化植株的高度明显矮于野生型大豆，可见gmcry2c基因具有降低植物植株高度的功能，本发明为植株株高的调控手段提供了新的选择。

附图说明

图1为yfp-gmcry2c过表达后，在转基因植株中株高变矮的表型和western-blot分子检测结果。

图2为gmcry2c-yfp过表达后，在转基因植株中株高变矮的表型western-blot分子检测结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1大豆gmcry2c基因过表达植物表达载体的构建

本发明提供了用于构建过表达载体所用的引物，其包括用于扩增gmcry2ccds序列的引物：

cds-2cf:atgggtagcaacaggactat

cds-2cr:catagctccatctttgctt

用于同源重组连接pdonrzeo入门载体的通用引物：pcry2c-f:caaaaaagcaggcttcatgggtagcaacaggactat

pcry2c-r:caagaaagctgggtccatagctccatctttgctt

取大豆威廉82的种子，种植在含有营养土和蛭石的按1:1混合的土壤中，在短日照下生长15天。取大豆叶片2片。

(1)提取rna方法如下：在研钵中加入液氮，迅速将样品充分磨碎，用rnase-free离心管盛约30mg样品(到100μl刻度处)。加入350μlra1buffer和3.5μlβ-me，充分涡旋振荡，使其完全混匀。室温下8000g离心1min，将上清转移到粉色的过滤柱中，室温11000g离心1min，液体转移至新的1.5ml离心管，弃去过滤柱。加入350μl70％乙醇，涡旋振荡25s，充分混匀。将液体转移至蓝色的吸附柱中，8000g离心30s，rna被吸附到柱子上。除盐，加入350μlmdbbuffer，11000g离心1min，弃去废液。除dna，向吸附柱加入95μldnasereactionmixture，室温静置15min。清洗，加入200μlra2buffer，11000g离心2min，更换新的收集管。加入600μlra3buffer，11000g离心1min，弃去废液，加入250μlbuffer，11000g离心2min，弃废液。更换新rnase-freeh2o，11000g离心1min，重复一次，以增加洗脱率。此步骤在冰上操作。得到的rna放于-80℃冰箱保存。

(2)反转录合成cdna方法如下：cdna第一链的反转录合：在冰上向nuclease-freepcr管中依次加入下列试剂：totalrna6μl(0.1ng-5μg)，oligo(dt)18primer1μl，nuclease-free5μl，置于pcr仪中65℃反应5min。然后再加入以下试剂：5xreactionbuffer4μl，rnaseinhibitor1μl，10mmdntp2μl，m-mμlvreverse1μl，轻轻混匀，在pcr仪中45℃反应60min。pcr仪中，70℃5min，终止反应。

(3)用设计好的gmcry2ccdna扩增引物

cds-2cf:atgggtagcaacaggactat

cds-2cr:catagctccatctttgctt，以反转录产物为模板，进行pcr扩增。pcr反应体系如下：模板(cdna)1μl，dntp4μl，2×gcbuffer25μl，primer-f1μl，primer-r1μl，primerstarhs0.5μl，ddh2o20.5μl。

(4)pcr产物回收和产物连接琼脂糖凝胶回收试剂盒(购自axygen公司)回收pcr产物，回收片段与pdonrzeo载体进行连接。

(5)大肠杆菌dh5α的转化：取50μl冰上冻融的感受态细胞，加入5μl连接产物，轻轻混匀，冰浴置30min。42℃水浴锅热激45s，快速转移到冰上放置2min。加入500μl无抗的lb培养基于离心管中，37℃，200rpm培养1h。将菌液加均匀涂布与含有相应抗生素的lb平板上，待液体完全吹干后，倒置平板，37℃培养过夜。

(6)阳性克隆的鉴定用牙签挑取平板上的单克隆，在含有抗生素的lb平板划线，然后将牙签在含有pcr反应混合物的管中轻轻搅动几下，进行菌落pcr来鉴定。可以挑取多个单克隆，并在平板上做好标记，以增加获得阳性克隆的概率。之后将平板置于37℃过夜培养。pcr体系：dntp2μl，2*gcbuffer10μl，sp6-f0.5μl，t7-r0.5μl，high-gcdnapolymerase0.3μl，ddh2o6.7μl，共20μl。pcr程序：反应程序：98℃6min，94℃30s，57℃30s，72℃2min，35个循环，pcr产物经电泳检测，有目的片段的克隆，把对应平板上的划线，送菌液测序，得到连有正向基因的阳性克隆，正向基因的核苷酸序列如seqidno.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示。

(7)质粒提取对于测序正确的单克隆，扩摇菌液，用试剂盒提取质粒，步骤如下：a)取2ml培养过夜的菌液，12000g离心1min，弃尽上清。b)加250μlbuffers1(含有rnase)用移液器吹打悬浮细菌沉淀，一定要保证均匀。c)加入250μlbuffers2，温和地上下翻转数次混合均匀，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5min，以防质粒dna被裂解。d)加入350μlbuffers3，温和并充分地混合数次，12000g离心10min。e)吸取上清转移到制备管(置于2ml离心管中)，12000g离心1min，弃滤液。f)将制备管放回2ml离心管中，加500μlbufferw1，12000g离心1min，弃滤液。g)将制备管放回离心管，加700μlbufferw2，12000g离心1min，弃滤液；重复一次。h)将制备管放回2ml离心管中，12000g离心1min。i)将制备管移入干净的1.5ml离心管中，在吸附管膜中央加40μlddh2o，室温静置1min。12000g离心1min，洗脱质粒dna。

(8)基因表达载体的构建

本实验中用到的表达载体均含有gateway重组系统，在入门载体(enteryvector)pdonrzeo中插入目的基因cds序列，再通过lr反应将目的基因cds序列转移到表达载体pearly101-yfp及yfp-pearly104载体上，完成目的基因表达载体的构建。

lr反应体系：表达载体pearly101-yfp及yfp-pearly1041μl(30-50ng)，载体(pdonrzeo-cds)1μl(30-50ng)，lrclonaseenzymemix1μl，ddh2o2μl，共5μl。25℃反应过夜。反应液转化大肠杆菌dh5α，筛选阳性克隆。

实施例2转基因大豆植株的获得

将构建好的含有gmcry2c-yfp和yfp-gmcry2c的质粒转化农杆菌后，进行大豆转化。

(1)农杆菌感受态的制备与转化

1)农杆菌感受态的制备挑取农杆菌eha105单菌落分别置于5ml含相应抗生素的lb液体培养基中，eha105抗性为：100μg/ml利福平(rif)。28℃培养过夜；取过夜培养菌液500μl接种于50mllb含相应抗生素的液体培养基中，28℃培养到od600约为0.5；冰上放置30min；4℃，5,000rpm离心10min，用15ml在预-20℃的10mmcacl2重悬农杆菌细胞，4℃，5,000rpm离心10min；用2ml预冷的10mmcacl2重悬沉淀，冰上100μl/管分装，液氮速冻，-80℃保存。

2)农杆菌转化取100μl感受态细胞冰上解冻，加入1μg质粒dna混匀后，冰上放25置30min，液氮速冻3-5min后立即放于37℃水浴5min，加入1ml无抗lb液体培养基，28℃，160rpm复苏3-5h后菌液均匀涂于含相应抗生素的固体培养基上。28℃倒置培养2～3d，挑单菌用pcr鉴定阳性克隆。

(2)大豆转化

1.用浓盐酸和次氯酸钠反应出的氯气灭过菌的天隆1号，摇菌。

2.将豆子对半切开，去掉一部分胚尖，在豆子的分生区部分划伤口，泡在无菌水中。下午取出摇好的菌液，离心(4000prm，10min)，调菌，使菌液od值＝0.4～0.6，将豆子中的无菌水倒掉，加入调好的菌液，放在摇床中摇30min(28℃，200prm左右)，取出吹10min左右，平铺在共培培养基中暗培3天。

3.暗培3天后，胚芽长长，用无菌水和加入激素的液体诱导培养基各洗4-5次，确保将农杆菌洗净。

4.将长出的胚芽切掉，只保留3-4mm长度，胚芽朝下，有伤口的一面朝上斜插入固体诱导培养基中，放入温室中光照培养。

5.在温室培养10天后，有的豆瓣开始出芽，有芽的从桩部将芽切掉并转到新的固体诱导培养基中，没长芽的扔掉。

6.温室中培养10天后，将长芽的继代到新的固体诱导培养基中，没有长芽的豆瓣扔掉，温室培养10天。豆瓣在固体诱导培养基中一共培养30天。

7.将长好的愈伤组织与豆瓣分离，扔掉豆瓣，把愈伤组织上黑色表面刮掉，转到固体伸长培养基中，每20天更换一次新的固体伸长培养基，一般继代3-4次，合计60-80天。

8.愈伤在伸长培养同时也在筛选，在筛选过程中会有苗长出来。

9.当苗长到超过100ml刻度的时候从愈伤上切下来，移到生根培养基中。

10.苗子在培养基中培养20-30天左右，长得壮实有发达根系的苗子就可以开始放在背光处炼苗了，一般炼苗五天。

11.每种一棵苗就表上豆子品种，基因名称，生根日期和土培日期，以及培养人的名字。加入适量水，绿肥和缓释肥，盖上一层薄膜放在光照下，使其适应强光，3天后去膜。

实施例3转基因大豆表型鉴定

为了确定转基因阳性植株，取一片鲜嫩的叶片，提取总蛋白，进行免疫印迹(westernblot)，pearly101及pearly104载体含有yfp蛋白，用yfp抗体(罗氏roche11697498001)进行阳性植株鉴定。

本研究中，获得两株过表达yfp-gmcry2c植株，分别命名为yfp-gmcry2c-9、yfp-gmcry2c-11根据western-blot分子检测结果，该蛋白表达量越高，植株表型越明显，植株的高度明显矮于野生型大豆，可见gmcry2c基因具有降低植物植株高度的功能。获得gmcry2c-yfp过表达植株两株，命名为gmcry2c-yfp-1、gmcry2c-yfp-4，western-blot分子检测结果显示，cry2c-yfp表达量一致，植株表型也一致。图1显示yfp-gmcry2c过表达后，在转基因植株中株高变矮的表型和western-blot分子检测结果。图2显示gmcry2c-yfp过表达后，在转基因植株中株高变矮的表型western-blot分子检测结果。本申请获得gmcry2c-yfp以及yfp-gmcry2c蛋白过量表达的稳定转化植株，结果发现转化植株的高度明显矮于野生型大豆，证实gmcry2c基因具有降低植物植株高度的功能。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>gmcry2c在调控植物株高方面的应用

<130>khp181113284.9

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1905

<212>dna

<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum

<400>1

atgggtagcaacaggactattgtttggtttagaagggaccttagaattgaggacaatcct60

gcattagctgctgctgcaaaggagggttctgtactccctgtgtatatatggtgccctaaa120

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