禽流感病毒血凝素抗原及表达其的CHO细胞株、制备方法和疫苗与流程

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种禽流感病毒血凝素抗原及表达其的cho细胞株、制备方法和疫苗。

背景技术：

禽流感病毒(aiv)为单股负链病毒，呈球形或丝状，球形直径80-120nm。基因组分为8个节段，共编码10种蛋白，其中ha、na和m位于病毒的囊膜表面，是aiv的主要保护性抗原。位于病毒双层脂包膜下是基质蛋白m，它是病毒颗粒中含量最多的蛋白，其构成了病毒包膜的框架。在脂质双层膜上则镶嵌了两种由病毒基因编码的糖蛋白刺突，即血凝素(hemagglutinnin，ha)与神经氨酸酶(neuraminidase，na)，两者是划分流感病毒亚型的依据，且其抗原性极易变异，一旦形成新的亚型，极易导致禽流感的爆发。

ha是构成病毒囊膜纤突的主要成分，属于ⅰ型糖蛋白。ha以三聚体的形式存在。ha在病毒吸附、穿模以及决定病毒与细胞融合等方面均起关键作用。它能否被裂解为ha1和ha2两部分是病毒致病力高低的重要因素。aiv感染后可以产生抗ha抗体，ha抗体是主要的保护性抗体，在防止病毒感染中起重要作用。ha蛋白是禽流感流感病毒的主要保护性抗原之一。它不仅可以刺激机体产生保护性抗体，而且可以诱导机体产生细胞毒性作用，对同一亚型病毒的共计产生良好的保护力。

2003年初至今，h5n1亚型高致病性禽流感在欧洲、非洲、美洲和亚洲的禽类中，发生过大面积流行并造成了重大的经济损失。目前禽流感灭活疫苗应用鸡胚或mdck全悬浮细胞生产，应用鸡胚生产疫苗工艺复杂，使用的鸡胚可能存在外源病毒的污染，需要将毒液接种鸡胚、收取尿囊液、灭活，收取尿囊素液鸡胚废弃物需要高压处理，产生较多的生产废物，给环境保护带来压力。mdck全悬浮细胞生产禽流感疫苗需要驯化种毒适应细胞的过程，需要周期长，而且有时达不到预期的毒价，其培养成本和生产工艺较为复杂。因此，一种改进的禽流感疫苗是目前市场需要的。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种禽流感病毒血凝素抗原，该抗原兼具具广谱性和良好的免疫原性，免疫禽类后可产生较高滴度的抗体并且预防多种亚型的禽流感。

本发明的第二目的在于提供一种表达上述禽流感病毒血凝素抗原的细胞株，该细胞株可表达具有广谱性的流感病毒血凝素抗原。

本发明的第三目的在于提供一种上述禽流感病毒血凝素抗原和上述细胞株的制备方法，该方法操作简单，获得的抗原免疫原性好。

本发明的第四目的在于提供一种包含上述禽流感病毒血凝素抗原的疫苗，该疫苗生产成本低，免疫效力高。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

一种禽流感病毒血凝素抗原，所述禽流感病毒血凝素抗原为具有如seqidno.1所示序列表达的血凝素蛋白；所述血凝素蛋白为真核细胞表达的蛋白。

优选地，所述真核细胞为cho细胞。

一种表达上述禽流感病毒血凝素抗原的细胞株；

优选地，所述细胞株为cho细胞株。

一种上述禽流感病毒抗原或上述细胞株的制备方法，该制备方法包括提供包括seqidno.1所示序列的重组载体，然后在宿主细胞表达所述重组载体，即可获得禽流感病毒血凝素抗原和表达禽流感病毒血凝素抗原的细胞株；

优选地，所述制备方法包括将含有重组载体的宿主细胞进行加压筛选的步骤。

优选地，所述重组载体的筛选试剂包括g418；所述宿主细胞为cho细胞；所述宿主细胞进行加压筛选包括如下步骤：

a)将含有重组载体的cho细胞用含有g418的培养基进行加压筛选3-5代至细胞存活率为10％-50％；优选20％-40％；更优选30％；

b)使用常规培养基培养经步骤a)筛选出的cho细胞至存活率至少为90％；

c)重复步骤a)和步骤b)一次；

优选地，所述含有g418的培养基中g418的浓度为400-1000μg/ml，优选600-900μg/ml，更优选800μg/ml。

优选地，所述重组载体为将seqidno.1所示序列与如下载体中至少一种载体重组的表达载体：pcdna3.1、pee6.4、pee12.4或pgl4.13。

优选地，将加压筛选后的cho细胞进行单克隆筛选。

进一步地，将经过筛选的cho细胞置于36～38℃，5％co2摇床中进行摇瓶培养48～72小时，细胞接种密度为0.3×10⁶～0.5×10⁶vc/ml；

优选地，在36～38℃培养至第5日将温度降至31～33℃，ph调整至7.4～7.6；

优选地，在第4日和第9日分别加入10％起始工作体积的efficientfeed，每日检测葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度低于2.5g/l时，补充葡萄糖到3～4g/l；

优选地，当细胞活率低于80％时，收获上清得到所述禽流感病毒抗原。

一种禽流感疫苗，该禽流感疫苗包括上述禽流感病毒血凝素抗原；

优选地，所述禽流感疫苗中禽流感病毒血凝素抗原的用量为1-10μg/羽份，优选为2-8μg/羽份，更优选为3-6μg/羽份。

优选地，所述禽流感疫苗还包括佐剂；

优选地，所述佐剂选自氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、gel01、蜂胶、isa206或isa760vg中的一种或多种；

优选地，所述禽流感疫苗包括质量比为1:1的抗原和佐剂，优选为水包油包水型。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的禽流感病毒血凝素抗原，该抗原为具有如seqidno.1所示序列表达的血凝素蛋白；seqidno.1所示序列为选用近5年流行的禽流感血凝素基因进行比对分析后得到的序列，并将该序列进行密码子的优化和修饰，以达到进一步提高抗原广谱性和提高抗原表达量的目的。并且该血凝素蛋白为真核细胞表达的蛋白，避免了损失该抗原的构象型的抗原表位。本发明提供的表达上述禽流感病毒血凝素抗原的细胞株，具有上述禽流感病毒血凝素抗原的有益效果。

上述禽流感病毒血凝素抗原的制备方法和可以获得具有广谱性和抗原免疫原性好的血凝素蛋白，并且该方法操作简单，适合规模化生产。

本发明提供的包含上述禽流感病毒血凝素抗原的疫苗，该疫苗生产成本低，免疫效力高，免疫3-4周龄spf鸡后，14日即可检测到h5亚型抗原测定hi抗体几何平均滴度(gmt)均不低于1:64，21日h5亚型抗原测定hi抗体几何平均滴度(gmt)均不低于1:256；而常规的灭活苗免疫后21日hi抗体几何平均滴度(gmt)才不低于1:64，因此该疫苗优于常规疫苗。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例3提供的重组质粒酶切鉴定结果图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明提供一种禽流感病毒血凝素抗原，该抗原为具有如seqidno.1所示序列表达的血凝素蛋白；seqidno.1所示序列为选用近5年流行的禽流感ha基因进行比对分析后得到的序列，并将该序列进行密码子的优化和修饰，以达到进一步提高抗原广谱性和提高抗原表达量的目的。并且该血凝素蛋白为真核细胞表达的蛋白，优选使用cho细胞表达的蛋白，避免损失该抗原的构象型的抗原表位。本发明还提供了表达上述禽流感病毒血凝素抗原的细胞株，因此具有上述禽流感病毒血凝素抗原的有益效果。

其中，典型的cho细胞可以为cho-k1细胞。

本发明还提供了一种上述禽流感病毒血凝素抗原和上述细胞株的制备方法，包括提供包括seqidno.1所示序列的重组载体，然后在宿主细胞表达所述重组载体。在一个优选的实施方式中，使用cho细胞制备上述抗原，将seqidno.1所示序列与如下载体中至少一种载体重组：pcdna3.1、pee6.4、pee12.4或pgl4.13；然后将重组载体转染至cho细胞内进行表达，pcdna3.1、pee6.4、pee12.4或pgl4.13均以g418为报告基因，因此将重组载体转染至cho细胞内后采用含有g418的培养基对表达血凝素蛋白的cho细胞进行加压筛选，将加压筛选出的细胞株进行细胞的单克隆筛选，经过筛选获得表达量相对较高的细胞株。然后进一步通过优化该细胞株的培养条件、补料时间，补料量最终获得了较高血凝素蛋白的细胞株，使用该细胞株表达血凝素蛋白蛋白的表达量高并且稳定。筛选出高表达血凝素蛋白的细胞株后，在优化的培养条件下培养该细胞株，可以获得高表达量的蛋白，收集蛋白去掉细胞碎片后即可获得血凝素蛋白，即可制备疫苗的禽流感病毒抗原。

在一个优选的实施方式中，采用如下步骤进行加压筛选：

a)将含有重组载体的cho细胞用含有g418的培养基进行加压筛选3-5代至细胞存活率为10％-50％，例如可以为，但不限于10％、20％、30％、40％或50％；优选20％-40％；更优选30％；

b)使用常规培养基培养经步骤a)筛选出的cho细胞至存活率至少为90％；

c)重复步骤a)和步骤b)一次；

在一些优选的实施方式中红，所述含有g418的培养基中g418的浓度为400-1000μg/ml，例如可以为，但不限于400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml或1000μg/ml，优选600-900μg/ml，更优选800μg/ml，以达到优化加压筛选效果的目的。

在一些优选的实施方式中，将经过筛选的cho细胞置于36～38℃，5％co2摇床中进行摇瓶培养48～72小时，例如可以为，但不限于48小时、60小时或72小时；细胞接种密度为0.3×10⁶～0.5×10⁶vc/ml，例如可以为，但不限于0.3×10⁶vc/ml、0.4×10⁶vc/ml或0.5×10⁶vc/ml。

优选地，在36～38℃培养至第5日将温度降至31～33℃，ph调整至7.4～7.6。

优选地，在第4日和第9日分别加入10％起始工作体积的efficientfeed，每日检测葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度低于2.5g/l时，补充葡萄糖到3～4g/l。

优选地，当细胞活率低于80％时，收获上清得到所述禽流感病毒抗原。

使用上述方法可以获得稳定高表达血凝素蛋白的cho细胞，血凝素蛋白的表达量可高达5mg/ml，使用筛选出的cho细胞生产血凝素蛋白作为禽流感血凝素抗原生产周期短，蛋白表达量高并且生产的抗原免疫原性好。

本发明还提供了一种禽流感疫苗，所述疫苗包括上述禽流感病毒血凝素抗原，该疫苗中抗原的用量优选为1-10μg/羽份，例如可以为，但不限于1μg/羽份、2μg/羽份、3μg/羽份、4μg/羽份、5μg/羽份、6μg/羽份、7μg/羽份、8μg/羽份、9μg/羽份或10μg/羽份，优选为2-8μg/羽份，更优选为3-6μg/羽份。

优选地，该禽流感疫苗还包括佐剂；例如可以为但不限于为氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、gel01、蜂胶、isa206或isa760vg，所述禽流感疫苗优选使用质量分数为10％-60％isa206vg，可以更有效地提高疫苗的抗原缓释作用和免疫原性。

下面结合优选实施例进一步说明本发明的有益效果。

实施例1一种表达血凝素蛋白的序列

从genebank上下载当前流行、近5年流行的禽流感h5亚型ha基因序列进行比对分析，选择出优势表位作为疫苗抗原的成分，根据cho细胞密码子的偏嗜性，将禽流感病毒ha基因的序列进行密码子的优化和修饰，以提高目的蛋白表达ha蛋白的水平。同时，为使ha基因具有广谱的抗原性，筛选相对保守的ha1优势表位的抗原序列，并在ha2的3’端以柔性氨基酸形式连接基质蛋白m2e(含23个氨基酸)，形成一段人工多肽的碱基序列，通过蛋白质同源建模，利用结构和序列的同源性在pdb库中搜索蛋白模块，模拟各表位不同连接方法的空间三维构象，分析其抗原性，最后筛选出抗原性最优的组合方式作为ha目的蛋白的基因序列，该蛋白具有高度的广谱性和保守性，设计酶切位点并人工合成ha基因全长。

实施例2一种表达血凝素蛋白的重组载体

将上述合成的编码ha蛋白的氨基酸序列且c端具有his标签的片段通过sali和xhoi位点插入克隆到真核转移载体pcdna3.1上。利用t4dna连接酶在16℃过夜连接后获得连接产物，经大肠杆菌感受态dh5a转化后涂布于含有氨节青霉素的lb平板中，37℃培养过夜后挑取阳性菌落在含有氨节青霉素的lb培养基中培养，提取质粒。

实施例3表达血凝素蛋白的重组载体的的酶切鉴定

将制备质粒dna，选择sali和xhoi位点限制性内切酶消化，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。其中，泳道m：dnamarker，泳道1～3：酶切后质粒，泳道4：酶切前质粒。从图中可以看出有预期大小的目的出现，说明目的基因成功插入到载体中。

将阳性结果的质粒送上海生工测序验证，最终获得阳性重组表达质粒，其序列如seqidno.1所示，其中，第1402-1431、第1441-1476和第1486-1512抗原表位之间由cctcccagc编码的柔性氨基酸相连。

实施例4表达血凝素蛋白的重组载体的重组细胞加压筛选

将该质粒转染至生长良好全悬浮的cho细胞，3日后进行细胞传代，并在培养基内加入800μg/ml的g418，加压至活率在30％左右时，停止加压。用常规的培养基培养，换入新的贴壁培养基培养7天，当细胞活率达到90％以上时，再加压筛选一次，同样细胞活率达到90％。

实施例5表达血凝素蛋白的重组载体细胞的单克隆筛选

阳性克隆挑选和检测:培养7天后的平板中，将贴壁生长的细胞挑至96孔板中，利用贴壁培养基培养7天后，加入100gl悬浮培养基msx表达培养2天，空板中培养基用于点杂交检测，将其中高表达克隆转至24孔板，利用贴壁培养基培养2天后换为msx培养，培养基用于蛋白质印迹法检测，根据实验结果最终得到高表达克隆株。所有细胞的培养条件为37℃，5％co2。

实施例6表达血凝素蛋白的重组载体细胞的的培养

将经过筛选的cho细胞在cho培养基(含25μmmsx)或其它适宜培养基重悬细胞，细胞接种密度为0.3×10⁶～0.5×10⁶vc/ml，接种细胞于合适体积的细胞摇瓶，并置于37±1℃，含5％co2摇床中进行摇瓶培养48～72小时，继续传代扩增培养细胞。

根据需要进行逐级生物反应器培养发酵，一般进行5～8倍放大，放大到特定体积时进行抗原的表达，在37±1℃培养至第5日将温度降至32±1℃，ph调整至7.5±0.1，并以适宜转速进行培养，在第4日和第9日加入10％起始工作体积的efficientfeed，每日检测葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度低于2.5g/l时，补充葡萄糖到3～4g/l。当蛋细胞活率低于80％时，收获上清即为所需抗原。

通过优化该细胞株的培养条件、补料时间，补料量最终获得了1.5mg/ml的ha蛋白表达。

实施例7一种禽流感疫苗

去细胞碎片将表达的定量后，与佐剂混合制备成疫苗，免疫3-4周龄spf鸡后，结果显示14日即可检测到h5亚型抗原测定hi抗体几何平均滴度(gmt)均不低于1:64，21日h5亚型抗原测定hi抗体几何平均滴度(gmt)均不低于1:256。

对比例1

将种毒接种至10～11日龄的鸡胚尿囊素液中，培养约72小时后，收取鸡胚尿囊素液，灭活，乳化，同时需要高压灭菌处理吸取尿囊液的鸡胚。免疫后21日hi抗体几何平均滴度(gmt)不低于1:64。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

sequencelisting

<110>天康生物股份有限公司

<120>禽流感病毒血凝素抗原及表达其的cho细胞株、制备方法和疫苗

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1524

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atggagaagatcgtgctgctgttcgccatcgtgagcctggtgaagagcgaccagatctgc60

atcggctaccacgccaacaacagcaccgagcaggtggacaccatcatggagaagaacgtg120

accgtgacccacgcccaggacatcctggagaagacccacaacggcaagctgtgcgaccac180

gacggcgtgaagcccctgatcctgagggactgcagcgtggccggctggctgctgggcaac240

cccatgtgcgacgagcccatcaacgtgcccgagtggagctacatcgtggagaaggccaac300

cccgccaacgacctgtgctaccccggcgacttcaacgactacgaggagctgaagcacctg360

ctgagcaggatcaaccacttcgagaagatccagatcatccccaagaacagctggagcagc420

cacgagacccccctgggcgtgagcagcgcctgcccctaccagggcaagagcagcttcttc480

aggaacgtggtgtggctgatcaagaagaacaacgcctaccccaccatcaagaggagctac540

aacaacaccaaccaggaggacctgctggtgctgtggggcatccaccaccccaacgacgcc600

gccgagcagaccaggctgtaccagaaccccaccacctacatcagcgtgggcaccagcacc660

ctgaaccagaggcctgtgcccaagatcgccaccaggagcaagatcaacggccagagcggc720

aggatcgacttcttctggaccatcctgaagcccaacgacgccatccacttcgagagcaac780

ggcaacttcatcgcccccgagtacgcctacaagatcgtgaagaagggcgacagcaccatc840

atgaggagcgaggtggagtacggcaactgcaacaccaggtgccagacccccgtgggcgcc900

accaggggatccttcggcgccatcgccggcttcatcgagggcggctggcagggcatggtg960

gacggctggtacggctaccaccacagcaacgagcagggcagcggctacgccgccgacaag1020

gagagcacccagaaggccatggacggcgtgaccaacaaggtgaacagcatcatcgacaag1080

atgaacacccagttcgaggccgtgggcagggagttcaacaacctggagaggaggatcgag1140

aacctgaacaagaagatggaggacggcttcctggacgtgtggacctacaacgccgagctg1200

ctggtgctgatggagaacgagaggaccctggacttccacgacagcaacgtgaagaacctg1260

tacgacaaggtgaggctgcagctgaaggacaacgccaaggagctgggcaacggctgcttc1320

gagttctaccacaagtgcaacaacgagtgcatggagagcgtgaggaacggcacctacgac1380

tacccccagtaccctcccagcatcctgggcttcgtgttcacgctgaccgtgcctcccagc1440

ggccccctgaaggccgagatcgcgcagaggctggagcctcccagcggcatcctgggcttc1500

gtgttcaccctccctcccagctga1524