本发明涉及sod分离提取技术领域,尤其涉及一种鸭血红细胞sod的分离纯化方法。
背景技术:
超氧化歧化酶(sod)够有效清除氧自由基,提高人体的免疫力,是人体中不可缺少的具有特殊生物活性的酶。随着年龄的增长,人体sod逐渐减少,体内超氧阴离子自由基堆积,不仅会加速细胞衰老,而且容易导致免疫性疾病、急性炎症与水肿等多种疾病,因此,以sod为活性成分的药物、食品、保健品、化妆品等备受关注,特别是在医药领域得到了广泛应用。
动物血液是国内外生产sod的主要来源之一,我国有丰富的禽类血液资源,其中鸭血食用较少,大部分未能开发利用,具有显著的应用价值。动物细胞中提取的sod主要为cuzn-sod,现有提取工艺中,最早的溶剂沉淀法使用大量的氯仿等有毒溶剂,成本高,危害较大,后续出现了多种改进工艺,如透析或超滤等,虽可以克服上述缺陷,但是工序复杂,提取的sod纯度不高,难以实现工业化生产。
技术实现要素:
针对现有技术的上述不足,本发明提供一种鸭血红细胞sod的分离纯化方法。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
一种鸭血红细胞sod的分离纯化方法,包括步骤:
(s1)采集新鲜鸭血,加入5-8%的柠檬酸钠抗凝液,抗凝液与鸭血的体积比为1:5-8,离心收集红细胞;
(s2)用生理盐水洗涤3次以上,每次洗涤后进行离心,然后加入红细胞体积2-3倍的去离子水,搅拌1-2h,使红细胞破碎,充分溶血;
(s3)加入重量比分别为4-5%、0.2-1%的氯化钠和硫酸铜,加压过滤,再将滤液用截留分子量为3000-6000d的中空纤维膜超滤浓缩,得到sod浓缩液;
(s4)调节ph为5.5-6.5,于55-60℃水浴中加热30-50min,冷却,离心,去除杂蛋白,然后取上清液,过预先用2-3mmol/l的磷酸缓冲液平衡的阴离子交换层析柱,用5-10mmol/l的磷酸缓冲液洗脱,收集sod洗脱液,经真空冷冻干燥,得到sod粉。
优选的,各步骤中,离心处理的时间为15-20min,转速为4500-5500r/min。
优选的,步骤(s4)中,ph调节剂选自浓度为6-8%的盐酸。
优选的,所述阴离子交换层析柱为deae-sepharosef.f色谱柱。
优选的,步骤(s4)还包括,在洗脱液中添加0.1-0.5mol/l的稳定剂,所述稳定剂包括维生素、l-组氨酸、l-精氨酸中的至少一种,进一步,所述维生素采用质量比为1:1的维生素e和k复配。通过添加上述特定的稳定剂,能显著提高sod的活性和贮存稳定性。
本发明的有益效果:
通过加压过滤、超滤和层析工艺多级纯化,使产品纯度及蛋白含量明显提高,不仅无需使用有机溶剂,而且操作简便,提取效率高、成本低,适合工业化生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细的说明。
实施例1
(s1)采集新鲜鸭血,加入5%的柠檬酸钠抗凝液,抗凝液与鸭血的体积比为1:5,离心,收集红细胞;
(s2)用红细胞体积3倍的生理盐水洗涤3次,每次洗涤后进行离心,然后加入红细胞体积3倍的去离子水,搅拌1h,充分溶血;
(s3)加入重量比分别为4.5%、0.4%的氯化钠和硫酸铜,加压过滤,再将滤液用截留分子量为5000d的中空纤维膜超滤浓缩,得到sod浓缩液;
(s4)用7.5%的盐酸调节ph为6.5,于60℃水浴中加热40min,冷却,离心,取上清液,过预先用2.5mmol/l的磷酸缓冲液平衡的deae-sepharosef.f色谱柱,用4.5mmol/l的磷酸缓冲液洗脱,收集sod洗脱液,经真空冷冻干燥,得到sod粉。采用gbt5009.171-2003的方法进行活性测定,产品比活力为11000u/mg,用紫外分光光度法测定蛋白含量为96.82%。
实施例2
采用实施例1的方法制备sod份,不同的是,步骤(s4)中,在洗脱液中添加0.05mol/l的维生素、0.15mol/l的l-组氨酸及0.1mol/l的l-精氨酸,其中述维生素采用质量比为1:1的维生素e和k复配。经活性测定,产品比活力为13500u/mg,蛋白含量为99.79%。可见,添加稳定剂后,产品的比活力和蛋白含量明显提高。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而并非对其进行限制,凡未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换,其均应涵盖在本发明技术方案的保护范围内。